Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
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Les auteurs tiennent à remercier l’équipe d’étude et à remercier particulièrement l’assistance technique et le soutien des équipes de biorecherche et d’aérosols de PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapour, et PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suisse. Les auteurs remercient Sam Ansari pour la gestion de la biobanque et reconnaissent le soutien de Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy pour l’édition d’une ébauche du manuscrit.

Tous les auteurs sont des employés de Philip Morris International. Philip Morris International est la seule source de financement et sponsor de ce projet.

La fumée de cigarette (CS) est reconnue comme l’un des principaux facteurs de risque associés au développement de maladies inflammatoires chroniques des poumons, notamment le carcinome pulmonaire, la bronchite et la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC)1. Au-delà de l’impact pulmonaire, l’exposition au CS joue un rôle important dans le développement d’autres maladies telles que la coronaropathie athéroscléreuse et la maladie vasculaire périphérique1. Les maladies cardiovasculaires, ainsi que la BPCO, sont respectivement la première et la troisième cause de décès dans le monde. Les approches d’évaluation des risques toxicologiques ont toujours reposé sur l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs. Des modèles in vivo de rats et de souris nez seulement ou du corps entier sont couramment utilisés pour étudier les effets à long terme de l’exposition au CS.
Par exemple, généralement, 6 mois d’exposition à la fumée induisent des anomalies histologiques et fonctionnelles dans les poumons murins qui imitent celles des maladies humaines, y compris l’emphysème, le remodelage des voies respiratoires et l’hypertension pulmonaire, bien que les changements soient relativement légers par rapport à ceux observés chez les fumeurs humains à long terme2. Dans les tissus animaux et humains, des études ont observé un large éventail de changements moléculaires en réponse à l’exposition au CS, y compris les réponses au stress oxydatif, l’inflammation et les changements tissulaires structurels 3,4. Comme on pouvait s’y attendre, l’exposition au CS aurait également un impact considérable sur le lipidome pulmonaire, y compris des effets sur les lipides tensioactifs, les médiateurs de signalisation lipidique et les lipides structurels 4,5,6.
Pour caractériser les changements lipidiques globaux induits par l’exposition à long terme au CS des poumons de souris, nous avons effectué une analyse rapide et quantitative par spectrométrie de masse par perfusion directe. Après l’introduction de la méthode lipidomique au fusil de chasse en 20057, cette méthode a été utilisée efficacement pour étendre nos connaissances sur le métabolisme cellulaire lipidique 8,9,10 dans des systèmes modèles tels que la levure 11, Caenorhabditis elegans12 et Drosophila melanogaster13, ainsi que dans un large éventail de types d’échantillons de mammifères tels que les lignées cellulaires 14, 15,16 divers tissus humains17,18 et rongeurs19,20 et fluides corporels21,22.
Au cours des dernières décennies, des études ont révélé la complexité des réponses cellulaires aux changements environnementaux, impliquant des milliers de protéines, de lipides et de métabolites interconnectés. Cela a clairement montré que l’utilisation de techniques analytiques de pointe est essentielle pour obtenir une vue approfondie des machines moléculaires et pour découvrir toute l’ampleur des impacts physiologiques exogènes. Dans ce contexte, les empreintes lipidiques quantitatives complètes produites par les approches lipidomiques peuvent efficacement ajouter à nos connaissances sur le métabolisme cellulaire lipidique 8,9,10.
En ce qui concerne l’exposition au CS comme facteur de risque pour plusieurs maladies, les approches d’évaluation des risques toxicologiques ont toujours reposé sur l’utilisation de modèles animaux tels que les rongeurs. Shotgun lipidomics MS fournit un outil analytique rapide, sensible et quantitatif pour évaluer la perturbation des lipidomes dans de nombreux types d’échantillons. La caractéristique unique de la lipidomique de fusil de chasse est l’analyse automatisée par injection directe d’un extrait lipidique total - enrichi d’étalons internes marqués - sans séparation chromatographique dans un instrument MS à haute résolution à l’aide d’une nanopuce conductrice générant une nanopulvérisation d’ionisation par électropulvérisation (ESI)23.
L’information sur le rapport masse/charge qui est acquise simultanément dans le mode MS1 fournit l’empreinte lipidique totale de tous les lipides endogènes intacts. En option, le mode MS2/MS3, dans lequel les molécules lipidiques mères sont fragmentées et analysées, fournit des informations structurelles supplémentaires. L’analyse des données nécessite un logiciel spécialisé et comprend la déconvolution des spectres et les assignations de pics dans des spectres regroupés qui conduisent à l’identification des lipides et à l’élucidation putative de la structure chimique. De plus, la quantification absolue peut être effectuée en augmentant un mélange d’étalons internes étiquetés contenant au moins un étalon lipidique par classe de lipides d’intérêt. Dans l’ensemble, avec la technique actuelle, l’analyse de la SEP prenant quelques minutes par échantillon peut couvrir l’identification et la quantification de jusqu’à 800 lipides de 14 classes lipidiques24 dans les tissus de rongeurs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Les lipides jouent un rôle essentiel en tant que composants essentiels de toutes les cellules procaryotes et eucaryotes. Les améliorations technologiques constantes en spectrométrie de masse ont fait de la lipidomique un outil analytique puissant pour surveiller les compositions des lipidomes tissulaires dans les états homéostatiques et pathologiques. Cet article présente un protocole étape par étape pour une méthode d’analyse lipidique au fusil de chasse qui prend en charge la détection et la quantification simultanées de quelques centaines d’espèces lipidiques moléculaires dans différents échantillons de tissus et de biofluides à haut débit. Cette méthode tire parti de l’injection directe automatisée en nanoflux d’un extrait lipidique total enrichi d’étalons internes marqués sans séparation chromatographique dans un instrument de spectrométrie de masse à haute résolution. À partir de quantités inférieures au microgramme de tissu de rongeur, l’analyse de la SEP prend 10 minutes par échantillon et couvre jusqu’à 400 lipides de 14 classes de lipides dans le tissu pulmonaire de souris. La méthode présentée ici est bien adaptée pour étudier les mécanismes de la maladie et identifier et quantifier les biomarqueurs qui indiquent une toxicité précoce ou des effets bénéfiques dans les tissus des rongeurs.

Ici, comme résultats représentatifs, nous présentons des données illustrant comment la lipidomique de fusil de chasse peut être utilisée pour étudier les effets du CS sur les poumons de souris. Le protocole d’analyse lipidique du fusil de chasse a été appliqué avec succès pour une étude in vivo pour l’analyse comparative de deux groupes d’échantillons: des tissus pulmonaires disséqués de neuf souris femelles Apoe−/− exposées au CS (groupe 3R4F; témoin positif) et un nombre égal de souris maintenues dans des conditions d’air frais (groupe simulé) en tant que témoin négatif collecté à 3 mois, Points de temps d’exposition de 4 mois et 6 mois. Les animaux ont été maintenus sous air frais filtré et conditionné à une température de 22 °C ± 2 °C et de 55 % ± 15 % d’humidité et nourris avec un régime de granulés irradiés aux rayons gamma. Le régime d’éclairage a été maintenu à 12 heures par jour. Jusqu’à huit souris ont été logées par cage. Les cigarettes de référence 3R4F pour le traitement de l’exposition ont été achetées de l’Université du Kentucky pour produire l’aérosol 3R4F CS (600 μg d’aérosol TPM/L de matières particulaires totales) pour une concentration d’exposition cible équivalente à 28 μg de nicotine/L.CS la fumée des cigarettes 3R4F a été produite à l’aide de machines à fumer rotatives à 30 orifices selon Phillips et coll.27 . Selon le Protocole de fumée intensive de Santé Canada, 55 mL de volume de bouffée, une bouffée par 30 s et un blocage de 100 % des orifices de ventilation ont été appliqués aux cigarettes 3R4F pour assurer une exposition suffisante. Tous les détails supplémentaires sur la conception de l’étude ont été rapportés précédemment27,28.
Dans l’ensemble, ~400 espèces lipidiques moléculaires des 14 classes de lipides les plus abondantes ont été identifiées et quantifiées (Figure 3). La concentration totale normalisée de lipides par classe était légèrement élevée pour les classes de lipides PE, PEO, PC, PCO, PI et PG, et une certaine régulation à la baisse a été observée pour les lipides SM, LPE et PA (figure 3A), alors qu’aucune différence n’a pu être observée pour les TAG et les PS. Fait intéressant, des niveaux élevés de lipides plasmalogènes PCO et PEO dans le groupe CS ont été signalés dans des cellules inflammatoires29 . L’une des fonctions intracellulaires des lipides plasmalogéniques est l’activité antioxydante. Sous exposition à l’oxygène réactif (ROS) et aux espèces azotées (RNS), une oxydation sélective des plasmalogènes par rapport aux phospholipides diacyles a été signalée30. La liaison ényl-éther dans la structure chimique des plasmalogènes est sensible à l’attaque radicale sur le stress oxydatif31. Les principaux produits de l’attaque radicalaire sont les acides eicosatétraénoïques hydroxylés, les phospholipides de 2-monoacylglycérol, le pentadécanol, les acides formiques, les α-hydroxyaldéhydes de différentes longueurs de chaîne, le 1-formyl-2-arachidonoyl glycérophospholipide et les lysophospholipides.
Ces résultats montrent que, parmi les caractéristiques moléculaires basées sur la formule moléculaire totale, 100 à 120 composés ont été significativement affectés par l’exposition au CS (Figure 3D). La déconvolution détaillée de l’information de fragmentation MS2 et la normalisation des intensités du signal fragmenté ont permis de définir approximativement la quantité totale de chaque acide gras conjugué (AF) représenté dans chaque classe de lipides (Figure 3E) et de comparer ces données entre les groupes exposés et témoins. Une nette diminution des FA complètement saturés et de ceux avec seulement quelques insaturations, principalement dans le contexte des lyso-lipides, a été observée. En revanche, les acides gras polyinsaturés (AGPI) dans la composition des classes de phospholipides PC, PE et PG étaient élevés dans le groupe CS pour tous les points temporels. Les cas extrêmes de PC et de PG conjugués avec de l’eicosapentanoïque (EPA) et de l’acide docosahexaénoïque (DHA) ont été détectés exclusivement dans le groupe exposé au 3R4F CS (Figure 3E, couleur rouge).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figure 1 : Disposition des plaques pour la distribution de l’échantillon dans le test de Bradford. Les échantillons blancs et les échantillons étalons sont placés en trois exemplaires dans les colonnes 1 à 3; Les échantillons inconnus sont placés en double dans les colonnes 4 à 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figure 2 : Disposition de la plaque de microtitrage à 96 puits pour l’analyse par spectrométrie de masse au fusil de chasse. La distribution des échantillons blancs, standard, inconnus et CQ pour l’acquisition en mode d’ionisation positive est cartographiée sur le côté gauche de la plaque (colonnes 1 à 6); Tous les échantillons pour le mode d’ionisation négative sont placés à droite (colonnes 7 à 12). Abréviations : pos = positif; CQ = contrôle de la qualité; neg = négatif; To = total des blancs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse lipidomique au fusil de chasse de poumons de souris exposés à la fumée de cigarette. Les souris Apoe−/− ont été exposées au CS de la cigarette de référence 3R4F ou à l’air frais (simulacre). (A) Concentrations dans la classe lipidique et nombre d’espèces lipidiques par classe. Pour chaque classe, le nombre d’espèces lipidiques quantifiées est indiqué entre parenthèses. Intervalles de confiance moyens et à 95 % pour chaque classe de lipides, séparément pour chaque type d’exposition (agrégés sur trois points temporels). (B) Graphiques de volcans montrant l’ampleur de l’effet (changement de quintage log2) et la signification (valeur p ajustée en fonction du FDR log10) des espèces lipidiques quantifiées pour la comparaison 3R4F CS versus simulée aux trois points temporels. Les lipides significativement élevés sont marqués en jaune; Les lipides significativement diminués sont marqués dans le cyan (valeur p ajustée par FDR < 0,05). (C) Abondance différentielle des 25 espèces lipidiques présentant les plus grands changements moyens absolus de plis. Les changements de pli log2 pour la comparaison 3R4F CS versus simulacre sont codés par couleur, et la signification statistique est indiquée : *: valeur p ajustée par FDR < 0,01; X : valeur p ajustée en fonction du FDR < 0,05. D) Graphiques comparatifs. Les coefficients de corrélation pour les comparaisons de changement de pli sont codés par couleur, et le nombre de lipides différentiellement abondants partagés est indiqué (nombres totaux dans les marges). Les diagrammes circulaires montrent le pourcentage de lipides communs différentiellement abondants avec la même direction de changement (signe FC). L’astérisque indique un chevauchement significatif des lipides différentiellement abondants. (E) Abondance différentielle des FA conjugués par classe lipidique. Carte thermique comme dans le panneau C pour les acides gras conjugués avec des différences d’abondance significatives entre 3R4F et l’exposition fictive dans les trois points temporels (valeur p ajustée en FDR < 0,05). La quantité de chaque acide gras par classe de lipides a été estimée en fonction des intensités MS2 des fragments d’acides gras. Abréviations : CS = fumée de cigarette; FDR = taux de fausses découvertes; FC = changement de pli; FA = acides gras; PC = phosphatidylcholine; PS = phosphatidylsérine; TAG = triacylglycérol; SM = sphingomyéline; PEO = phosphatidyléthanolamine plasmalogène; PE = phosphatidyléthanolamine; PG = phosphatidylglycérol; PI = phosphatidylinositol; DAG = diacylglycérol; SE = esters de stérols/cholestéryle; PCO = phosphatidylcholine plasmalogène; LPC = lyso phosphatidylcholine; LPE = lyso phosphatidyléthanolamine; PA = acide phosphatidique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentration finale de BSA (mg/mL)</td>
			<td>Solution de BSA à 2 mg/mL (μL)</td>
			<td>Tampon de bicarbonate d’ammonium (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 de solution à 0,125 mg/mL</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Schéma de dilution de l’étalon interne BSA pour la courbe d’étalonnage pour l’essai de Bradford. Abréviation : BSA = albumine sérique bovine.
Renseignements supplémentaires : fichiers MFQL utilisés pour l’identification des lipides LipidXplorer. Le paquet .zip se compose des fichiers MFQL individuels requis, chacun nommé selon ce modèle : <abréviation de classe lipidique>_<mode d’ionisation>_MS2.mfql (par exemple, PE_neg_MS2.mfql). Les noms de fichiers pour l’identification de l’étalon interne étiqueté incluent la balise D7(D9) dans l’abréviation <lipide> (par exemple, PED7_neg_MS2.mfql). Ces fichiers MFQL sont utilisés pour vérifier la quantité de deutérium dans l’étalon interne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

La lipidomique basée sur la spectrométrie de masse Shotgun fournit un instantané quantitatif sensible d’un large spectre de classes de lipides simultanément dans une seule mesure à partir de divers tissus de rongeurs.

Lipidomique de tissus de rongeurs

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Le protocole présenté permet de quantifier une large gamme de lipides dans les tissus animaux. C’est un outil facile pour étudier les mécanismes lipidiques et aussi pour identifier un biomarqueur indiquant une toxicité précoce dans des modèles animaux. La méthode fournit un profil quantitatif de plus de 400 lipides moléculaires dans 14 classes de lipides différentes dans une grande variété de matrices d’échantillons avec un temps de tendance de 10 minutes par échantillon.Pour commencer, diluer le surnageant aliquote 1 aliquotge 1 par rapport à la concentration avec un tampon de bicarbonate d’ammonium. Après avoir préparé la courbe standard de l’albumine sérique bovine, vortex les tubes étalons et centrifuger les tubes à 18,200 g pendant 15 secondes à température ambiante. À partir des tubes standard préparés précédemment, transférer 6 microlitres chacun des ébauches, des étalons et des échantillons sur une plaque à fond plat à 96 puits.Ensuite, ajoutez 250 microlitres du réactif Bradford à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et mélangez. Après l’incubation pendant 5 minutes, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 595 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Préparer des tubes de 2 millilitres avec 100 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium dans chaque tube de l’ébauche totale et de l’ébauche étalon interne et conserver tous les échantillons sur la glace.Préparer des échantillons de contrôle de la qualité, en considérant qu’un échantillon de contrôle de la qualité est placé entre chaque ensemble de 10 échantillons. Ajouter 10 microlitres de plasma humain mélangé à des tubes de 2 millilitres, puis ajouter 10 microlitres de solution étalon interne dans tous les échantillons blancs étalons internes, de contrôle de la qualité et d’étude. Ajouter 300 microlitres de mélange de butanol et de méthanol moins 20 degrés Celsius à chaque échantillon et agiter à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante sur thermomélangeur.Ensuite, ajoutez 300 microlitres de mélange d’acétate d’heptane d’éthyle et agitez à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur, puis ajoutez 300 microlitres de mélange d’acide ascétique à 1% et agitez pendant 5 minutes à 450 g à température ambiante sur le thermomélangeur. Centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante et transférer 360 microlitres de la phase supérieure dans un nouveau tube autobloquant de 2 millilitres étiqueté 2. Après avoir ajouté 320 microlitres d’acétate d’heptane d’éthyle au tube en phase aqueuse marqué comme 1, agiter à 450 g pendant 5 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur, puis centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante comme démontré précédemment.Transférez 320 microlitres de la phase supérieure et combinez-les avec la fraction de l’étape précédente dans le tube 2. De même, ajouter 250 microlitres d’acétate d’heptane éthyle à la phase aqueuse dans le tube 1 et agiter à 450 g pendant 5 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur. Encore une fois, centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante, puis transférer 200 microlitres de la phase supérieure et le combiner avec les fractions des étapes précédentes dans le tube 2.Évaporer à sec à 35 degrés Celsius dans un concentrateur sous vide et dissoudre à nouveau dans 300 microlitres de solution de mélange MS. Vortex chaque tube pendant 5 secondes pour s’assurer que tout est dissous et centrifuger à 18, 200 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer une partie aliquote de 50 microlitres dans la plaque de microlitre pour l’analyse du mode d’ionisation positive et diluer avec 50 microlitres de solution de mélange MS.Encore une fois, diluer avec 80 microlitres de mélange MS et transférer une partie aliquote de 20 microlitres dans la plaque MTP pour l’analyse du mode d’ionisation négative. Envelopper la plaque avec du papier d’aluminium et conserver à 4 degrés Celsius avant l’analyse. Calibrer une SM en mode positif et négatif conformément aux instructions du fabricant 5 jours ou moins avant l’analyse.Installez la nano-source de perfusion directe dès le départ, en vous assurant qu’elle est correctement alignée contre le capillaire de transfert de la SM et une puce de buse de 4,1 micromètres dans le porte-puce, puis vérifiez les paramètres de perfusion positive et négative correspondant à une pression de gaz de 1,25 psi, une tension source de 1,1 kilovolt, 5 microlitres de volume d’injection de l’échantillon, fermeture du contact de sortie Rel1 pendant 2,5 secondes, 5 minutes de délai de livraison, refroidissement de la plaque à 4 degrés Celsius, puis réglage du régulateur de température et création d’une nouvelle plaque. Pour le mode positif, vérifiez et réglez le logiciel que la méthode MS est configurée avec une température capillaire de 250 degrés Celsius et le niveau RF de l’objectif S à 65,0. Dans le logiciel Xcalibur, ouvrez la méthode positive et vérifiez que l’acquisition MS à balayage complet est configurée de zéro à 1 minute dans la plage de 550 à 1 000 m / z à une résolution de 140 000 avec un contrôle de gain automatisé de 1 million et un temps d’injection maximum de 50 millisecondes.Appliquer la masse de verrouillage de 680.48022. Vérifiez que la méthode d’acquisition MS/MS indépendante des données est configurée entre la plage de temps de 1 et 5 minutes à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 250 m/z. Vérifier que le contrôle de gain automatisé pour MS2 est réglé à 100 000 et un temps d’injection maximum à 64 millisecondes, une énergie de collision de 20 NCE, la fenêtre d’isolement à 1 m/z et qu’une liste de masse d’inclusion de 398 à 1 100 m/z est utilisée avec un pas de masse de 1 Dalton.Pour l’acquisition en mode négatif, vérifiez dans le logiciel de réglage que la méthode MS est configurée avec la température capillaire à 250 degrés Celsius dans le niveau RF de l’objectif S à 65,0 dans le fichier de réglage MS. Ensuite, dans le logiciel Xcalibur, vérifiez que le mode d’acquisition à balayage complet est configuré de zéro à 1 minute à une résolution de 140 000 couvrant la plage de 400 à 940 m/z, un contrôle de gain automatisé de 1 million, un temps d’injection maximal de 200 millisecondes et une masse de verrouillage de 526,46262. Vérifiez que l’acquisition MS2 en mode DIA est configurée entre 1 et 5 minutes de course à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 150 m/z, un contrôle de gain automatisé de 100 000, 64 millisecondes de temps d’injection maximum et 35 NCE d’énergie de collision en utilisant la liste de masse d’inclusion de 400 à 940 avec un pas de masse de 1 Dalton.Créez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel Xcalibur en mode positif et déclenchez-la, puis créez la séquence dans le logiciel ChipSoft et démarrez l’analyse en attendant que l’acquisition de l’échantillon soit déclenchée par un signal de fermeture de contact provenant du robot de perfusion directe pour chaque échantillon. Lorsque l’analyse en mode positif est terminée, créez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel Xcalibur en mode négatif et déclenchez-la, puis créez la séquence dans le logiciel ChipSoft et démarrez l’analyse en attendant que l’acquisition de l’échantillon soit déclenchée par un signal de fermeture de contact provenant du robot de perfusion directe pour chaque échantillon. La concentration totale normalisée de lipides a été identifiée et quantifiée à partir des 14 classes de lipides les plus abondantes, qui était légèrement élevée pour les classes de lipides PE, PEO, PC, PCO, PI et PG et une certaine régulation à la baisse a été observée pour les lipides SM, LPE et PA.Bien qu’aucune différence n’ait pu être observée pour les TAG et les PS. Ces résultats montrent également que, parmi les caractéristiques moléculaires basées sur la formule moléculaire totale, 100 à 120 composés ont été significativement affectés par l’exposition à la fumée de cigarette. La déconvolution de la fragmentation MS2 et la normalisation des intensités du signal fragmenté ont permis de définir approximativement la quantité totale de chaque acide gras conjugué représenté dans chaque verre lipidique et de comparer ces données entre les groupes exposés et témoins. Une diminution des acides gras complètement saturés et peu d’acides gras insaturés a été observée, tandis que les acides gras polyinsaturés dans la composition des classes de phospholipides PC, PE et PG étaient élevés dans le groupe de la fumée de cigarette pour tous les points temporels.Les cas extrêmes de PC et de PG conjugués avec de l’acide eicosapentaénoïque et docosahexaénoïque ont été détectés exclusivement dans le groupe d’exposition 3R4F CS. Le pipetage de l’échantillon et de l’échantillon de CQ doit être effectué avec des pointes à bande basse et pour être précis, ce qui signifie que les pointes doivent être vérifiées entre chaque échantillon. Le pipetage de la solution étalon interne est critique et doit être précis.La solution de méthanol dichlorométhane 1 à 1 doit être manipulée avec précaution et un embout contenant des éléments non plastifiants doit être utilisé pour éviter la présence de polymères plastiques dans les échantillons. Les pointes doivent être changées entre chaque échantillon.

Research

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Biochemistry

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