Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
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Die Autoren bedanken sich beim Studienteam und bedanken sich insbesondere für die technische Unterstützung und Unterstützung der Bioforschungs- und Aerosolteams von PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, und PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Die Autoren danken Sam Ansari für die Leitung des Biobankings und bedanken sich für die Unterstützung von Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy für die Bearbeitung eines Entwurfs des Manuskripts.

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Philip Morris International. Philip Morris International ist die einzige Finanzierungsquelle und Sponsor dieses Projekts.

Zigarettenrauch (CS) gilt als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung chronisch entzündlicher Erkrankungen der Lunge, einschließlich Lungenkarzinom, Bronchitis und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD)1. Über die Auswirkungen auf die Lunge hinaus spielt die CS-Exposition eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung anderer Krankheiten wie der atherosklerotischen koronaren Herzkrankheit und der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit1. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind zusammen mit COPD die erste bzw. dritthäufigste Todesursache weltweit. Toxikologische Risikobewertungsansätze stützten sich in der Vergangenheit auf die Verwendung von Tiermodellen wie Nagetieren. In-vivo-Nur-Nasen - oder Ganzkörper-Ratten- und Mausmodelle werden häufig verwendet, um die langfristigen Auswirkungen einer CS-Exposition zu untersuchen.
Zum Beispiel induziert eine 6-monatige Rauchexposition im Allgemeinen histologische und funktionelle Anomalien in der murinen Lunge, die denen menschlicher Krankheiten ähneln, einschließlich Emphysem, Atemwegsumbau und pulmonaler Hypertonie, obwohl die Veränderungen im Vergleich zu denen, die bei Langzeitrauchern beobachtet wurden, relativ mild sind2. Sowohl in tierischen als auch in menschlichen Geweben haben Studien eine Vielzahl von molekularen Veränderungen als Reaktion auf CS-Exposition beobachtet, einschließlich oxidativer Stressreaktionen, Entzündungen und struktureller Gewebeveränderungen 3,4. Es überrascht nicht, dass die CS-Exposition auch weitreichende Auswirkungen auf das Lungenlipidom hat, einschließlich Auswirkungen auf Tensidlipide, Lipidsignalmediatoren und Strukturlipide 4,5,6.
Um die Lipidveränderungen zu charakterisieren, die durch die langfristige CS-Exposition der Mauslunge induziert werden, führten wir eine schnelle und quantitative Schrotflinten-Direktinfusions-Massenspektrometrie-Analyse durch. Nach der Einführung der Shotgun-Lipidomics-Methode im Jahr 20057 wurde diese Methode effektiv eingesetzt, um unser Wissen über den Lipidzellstoffwechsel 8,9,10 in Modellsystemen wie Hefe 11, Caenorhabditis elegans12 und Drosophila melanogaster13 sowie in einer Vielzahl von Säugetierprobentypen wie Zelllinien 14 zu erweitern. 15,16 verschiedene menschliche17,18 und Nagetiergewebe19,20 und Körperflüssigkeiten21,22.
In den letzten Jahrzehnten haben Studien die Komplexität zellulärer Reaktionen auf Umweltveränderungen gezeigt, an denen Tausende von miteinander verbundenen Proteinen, Lipiden und Metaboliten beteiligt sind. Dies hat deutlich gemacht, dass der Einsatz modernster Analysetechniken unerlässlich ist, um einen tieferen Einblick in die molekularen Mechanismen zu erhalten und das volle Ausmaß exogener physiologischer Auswirkungen aufzudecken. In diesem Zusammenhang können die umfassenden, quantitativen Lipid-Fingerabdrücke, die durch Shotgun-Lipidomik-Ansätze erzeugt werden, unser Wissen über den zellulären Lipidstoffwechsel effektiv erweitern 8,9,10.
In Bezug auf die CS-Exposition als Risikofaktor für mehrere Krankheiten stützten sich toxikologische Risikobewertungsansätze in der Vergangenheit auf die Verwendung von Tiermodellen wie Nagetieren. Shotgun lipidomics MS bietet ein schnelles, sensitives und quantitatives Analysewerkzeug zur Beurteilung der Lipidomstörung in zahlreichen Probentypen. Das einzigartige Merkmal der Shotgun-Lipidomik ist die automatisierte Direktinjektionsanalyse eines Gesamtlipidextrakts - mit markierten internen Standards versetzt - ohne chromatographische Trennung in ein hochauflösendes MS-Instrument unter Verwendung eines leitfähigen Nanochips, der ein Elektrospray-Ionisations-Nanospray (ESI) erzeugt23.
Die Informationen über das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis, die gleichzeitig im MS1-Modus erfasst werden, liefern den gesamten Lipid-Fußabdruck aller intakten endogenen Lipide. Optional liefert der MS2/MS3-Modus, bei dem die Ausgangslipidmoleküle fragmentiert und analysiert werden, zusätzliche strukturelle Informationen. Die Datenanalyse erfordert spezielle Software und umfasst die Entfaltung von Spektren und Peak-Zuweisungen in gepoolten Spektren, die zur Identifizierung von Lipiden und zur Aufklärung der mutmaßlichen chemischen Struktur führen. Zusätzlich kann eine absolute Quantifizierung durchgeführt werden, indem ein markiertes internes Standardgemisch mit mindestens einem Lipidstandard pro Lipidklasse von Interesse versetzt wird. Insgesamt kann mit der vorliegenden Technik die MS-Analyse, die nur wenige Minuten pro Probe dauert, die Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 800 Lipiden aus 14 Lipidklassen24 in Nagetiergeweben abdecken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Lipide spielen eine wichtige Rolle als essentielle Bestandteile aller prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Ständige technologische Verbesserungen in der Massenspektrometrie haben die Lipidomik zu einem leistungsstarken Analysewerkzeug für die Überwachung der Gewebelipidomzusammensetzung sowohl in homöostatischen als auch in Krankheitszuständen gemacht. In diesem Artikel wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für eine Schrotflinten-Lipidanalysemethode vorgestellt, die den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung von einigen hundert molekularen Lipidspezies in verschiedenen Gewebe- und Biofluidproben bei hohem Durchsatz unterstützt. Diese Methode nutzt die automatisierte Nano-Flow-Direktinjektion eines Gesamtlipidextrakts, der mit markierten internen Standards ohne chromatographische Trennung versetzt ist, in ein hochauflösendes Massenspektrometriegerät. Ausgehend von Submikrogramm-Mengen an Nagetiergewebe dauert die MS-Analyse 10 Minuten pro Probe und deckt bis zu 400 Lipide aus 14 Lipidklassen im Lungengewebe der Maus ab. Die hier vorgestellte Methode eignet sich gut für die Untersuchung von Krankheitsmechanismen und die Identifizierung und Quantifizierung von Biomarkern, die auf eine frühe Toxizität oder positive Wirkungen im Nagetiergewebe hinweisen.

Hier präsentieren wir als repräsentative Ergebnisse Daten, die veranschaulichen, wie die Schrotflinten-Lipidomik verwendet werden kann, um die Auswirkungen von CS auf die Lunge von Mäusen zu untersuchen. Das Shotgun-Lipid-Analyseprotokoll wurde erfolgreich für eine In-vivo-Studie zur vergleichenden Analyse von zwei Probengruppen angewendet: Lungengewebe, das von neun weiblichen Apoe-/−-Mäusen seziert wurde, die CS ausgesetzt waren (3R4F-Gruppe; Positivkontrolle) und eine gleiche Anzahl von Mäusen, die unter Frischluftbedingungen (Scheingruppe) gehalten wurden, als Negativkontrolle, die nach 3 Monaten gesammelt wurde, 4 Monate und 6 Monate Expositionszeitpunkte. Die Tiere wurden unter gefilterter und konditionierter Frischluft bei 22 °C ± 2 °C Temperatur und 55 % ± 15 % Luftfeuchtigkeit gehalten und mit einem gammabestrahlten Pelletfutter gefüttert. Das Lichtregime wurde bei 12 h pro Tag beibehalten. Pro Käfig wurden bis zu acht Mäuse untergebracht. 3R4F-Referenzzigaretten für die Expositionsbehandlung wurden von der University of Kentucky gekauft, um das 3R4F CS-Aerosol (600 μg Gesamtfeinstaub-TPM/L-Aerosol) für eine Zielexpositionskonzentration zu erzeugen, die 28 μg Nikotin/L entspricht.CS Rauch von 3R4F-Zigaretten wurde mit 30 Rotationsrauchmaschinen nach Phillips et al. erzeugt.27 . Basierend auf dem Health Canada Intensive Smoking Protocol wurden 55 ml Zugvolumen, ein Zug pro 30 s und eine 100%ige Verstopfung der Belüftungsöffnungen auf 3R4F-Zigaretten angewendet, um eine ausreichende Exposition zu gewährleisten. Alle zusätzlichen Details zum Studiendesign wurden bereits berichtet27,28.
Insgesamt wurden ~400 molekulare Lipidspezies aus den 14 am häufigsten vorkommenden Lipidklassen identifiziert und quantifiziert (Abbildung 3). Die normalisierte Gesamtlipidkonzentration pro Klasse war für die Lipidklassen PE, PEO, PC, PCO, PI und PG leicht erhöht, und für SM-, LPE- und PA-Lipide wurde eine gewisse Herunterregulierung beobachtet (Abbildung 3A), während für TAGs und PS kein Unterschied festgestellt werden konnte. Interessanterweise wurden erhöhte Konzentrationen von PCO- und PEO-Plasmalogenlipiden in der CS-Gruppe in Entzündungszellen berichtet29 . Eine der intrazellulären Funktionen von Plasmalogenlipiden ist die antioxidative Aktivität. Unter Exposition gegenüber reaktivem Sauerstoff (ROS) und Stickstoffspezies (RNS) wurde über selektive Oxidation von Plasmalogen im Vergleich zu Diacylphospholipiden berichtet30. Die Enyl-Ether-Bindung in der chemischen Struktur von Plasmalogen reagiert empfindlich auf Radikalangriffe auf oxidativen Stress31. Die Hauptprodukte des Radikalangriffs sind hydroxylierte Eicosatetraensäuren, 2-Monoacylglycerinphospholipide, Pentadecanol, Ameisensäuren, α-Hydroxyaldehyde verschiedener Kettenlängen, 1-Formyl-2-arachidonoylglycerophospholipid und Lysophospholipide.
Diese Ergebnisse zeigen, dass unter den molekularen Merkmalen, die auf der Gesamtsummenformel basieren, 100-120 Verbindungen signifikant durch die CS-Exposition beeinflusst wurden (Abbildung 3D). Die detaillierte Entfaltung der MS2-Fragmentierungsinformationen und die Normalisierung der Fragmentsignalintensitäten ermöglichten die ungefähre Definition der Gesamtmenge jeder konjugierten Fettsäure (FA), die in jeder Lipidklasse vertreten ist (Abbildung 3E) und den Vergleich dieser Daten zwischen exponierten und Kontrollgruppen. Es wurde eine deutliche Abnahme sowohl der vollständig gesättigten FAs als auch der FAs mit nur wenigen Ungesättigten, hauptsächlich im Zusammenhang mit Lysolipiden, beobachtet. Im Gegensatz dazu waren mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) in der Zusammensetzung der PC-, PE- und PG-Phospholipidklassen in der CS-Gruppe zu allen Zeitpunkten erhöht. Die extremen Fälle von PC und PG, die mit Eicosapentansäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA) konjugiert waren, wurden ausschließlich in der 3R4F CS-Expositionsgruppe nachgewiesen (Abbildung 3E, rote Farbe).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Abbildung 1: Plattenlayout für die Probenverteilung im Bradford-Assay. Blind- und Standardproben werden in dreifacher Ausfertigung in den Spalten 1-3 platziert; Unbekannte Proben werden in doppelter Ausfertigung in die Spalten 4-11 eingefügt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Abbildung 2: Plattenlayout der 96-Well-Mikrotiterplatte für die Schrotflinten-Massenspektrometrie-Analyse. Die Verteilung der Blind-, Standard-, Unbekannt- und QC-Proben für die Erfassung im positiven Ionisationsmodus ist auf der linken Seite der Platte abgebildet (Spalten 1-6); Alle Proben für den negativen Ionisationsmodus befinden sich auf der rechten Seite (Spalten 7-12). Abkürzungen: pos = positiv; QC = Qualitätskontrolle; neg = negativ; TB = Gesamtleerzeichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Abbildung 3: Schrotflinten-Lipidomics-Analyse von Mauslungen, die Zigarettenrauch ausgesetzt waren. Apoe−/− -Mäuse wurden CS aus der 3R4F-Referenzzigarette oder an der frischen Luft (Schein) ausgesetzt. (A) Lipidklassenkonzentrationen und Anzahl der Lipidspezies pro Klasse. Für jede Klasse ist die Anzahl der quantifizierten Lipidspezies in Klammern angegeben. Mittelwert- und 95%-Konfidenzintervalle für jede Lipidklasse, separat für jeden Expositionstyp (aggregiert über drei Zeitpunkte). (B) Vulkandiagramme, die die Effektgröße (log2-fache Änderung) und Signifikanz (-log10 FDR-adjustierter p-Wert) der quantifizierten Lipidspezies für den 3R4F CS versus Scheinvergleich zu den drei Zeitpunkten zeigen. Signifikant erhöhte Lipide sind gelb markiert; signifikant verminderte Lipide sind in Cyan markiert (FDR-adjustierter p-Wert < 0,05). (C) Differentielle Häufigkeit der 25 Lipidspezies mit den größten absoluten mittleren Faltungsänderungen. Log2-Faltungsänderungen für den 3R4F CS versus Scheinvergleich sind farbkodiert, und die statistische Signifikanz ist angegeben: *: FDR-adjustierter p-Wert < 0,01; X: FDR-adjustierter p-Wert < 0,05. (D) Vergleichsdiagramme. Die Korrelationskoeffizienten für die Faltenänderungsvergleiche sind farbkodiert, und die Anzahl der gemeinsam genutzten differentiell häufigen Lipide wird angegeben (Gesamtzahl an den Rändern). Kreisdiagramme zeigen den Prozentsatz der gemeinsam genutzten unterschiedlich häufig vorkommenden Lipide mit der gleichen Änderungsrichtung (FC-Vorzeichen). Sternchen weisen auf eine signifikante Überlappung der unterschiedlich häufig vorkommenden Lipide hin. (E) Unterschiedliche Häufigkeit konjugierter FAs pro Lipidklasse. Heatmap wie in Panel C für konjugierte Fettsäuren mit signifikanten Abundanzunterschieden zwischen 3R4F und Schein-Exposition in allen drei Zeitpunkten (FDR-adjustierter p-Wert < 0,05). Die Menge jeder Fettsäure pro Lipidklasse wurde basierend auf den MS2-Intensitäten der Fettsäurefragmente geschätzt. Abkürzungen: CS = Zigarettenrauch; FDR = Falscherkennungsrate; FC = Faltänderung; FA = Fettsäuren; PC = Phosphatidylcholin; PS = Phosphatidylserin; TAG = Triacylglycerin; SM = Sphingomyelin; PEO = Plasmalogenphosphatidylethanolamin; PE = Phosphatidylethanolamin; PG = Phosphatidylglycerin; PI = Phosphatidylinositol; DAG = Diacylglycerin; SE = Sterol/Cholesterylester; PCO = Plasmalogenphosphatidylcholin; LPC = Lysophosphatidylcholin; LPE = Lysophosphatidylethanolamin; PA = Phosphatidsäure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA-Endkonzentration (mg/ml)</td>
			<td>BSA-Lösung bei 2 mg/ml (μl)</td>
			<td>Ammoniumbicarbonat-Puffer (μl)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 von 0,125 mg/ml Lösung</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Verdünnungsschema des BSA-internen Standards für die Kalibrierkurve für den Bradford-Assay. Abkürzung: BSA = Rinderserumalbumin.
Ergänzende Informationen: MFQL-Dateien, die für die Identifizierung von LipidXplorer-Lipiden verwendet werden. Das .zip Paket besteht aus den einzelnen benötigten MFQL-Dateien, die jeweils nach folgendem Muster benannt sind: <Lipidklassenabkürzung>_<ionisationsmodus>_MS2.mfql (z. B. PE_neg_MS2.mfql). Die Dateinamen für die gekennzeichnete interne Standardidentifikation enthalten das D7(D9)-Tag in der <Lipidabkürzung> (z. B. PED7_neg_MS2.mfql). Diese MFQL-Dateien werden verwendet, um die Menge an Deuterium im internen Standard zu überprüfen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Die auf Schrotflinten-Massenspektrometrie basierende Lipidomik liefert eine empfindliche quantitative Momentaufnahme eines breiten Spektrums von Lipidklassen gleichzeitig in einer einzigen Messung aus verschiedenen Nagetiergeweben.

Schrotflinten-Lipidomik von Nagetiergewebe

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Quantifizierung eines breiten Spektrums von Lipiden in tierischem Gewebe. Es ist ein einfaches Werkzeug, um Lipidmechanismen zu untersuchen und auch Biomarker zu identifizieren, die auf eine frühe Toxizität in Tiermodellen hinweisen. Die Methode liefert ein quantitatives Profil von mehr als 400 molekularen Lipiden in 14 verschiedenen Lipidklassen in einer Vielzahl von Probenmatrizes mit einer Trendzeit von 10 Minuten pro Probe.Zu Beginn verdünnen Sie den Zentrifugen-Aliquot-1-Überstand in der doppelten Konzentration mit Ammoniumbicarbonat-Puffer. Nach der Herstellung der Rinderserumalbumin-Standardkurve die Standardröhrchen wirbeln und die Röhrchen bei 18, 200 g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie aus den zuvor vorbereiteten Standardröhrchen jeweils 6 Mikroliter des Rohlings, der Standards und der Proben auf eine 96-Well-Flachbodenplatte.Als nächstes geben Sie 250 Mikroliter des Bradford-Reagenzes mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung und mischen Sie. Messen Sie nach 5-minütiger Inkubation die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 Nanometern mit einem Plattenleser. Bereiten Sie 2 Milliliterröhrchen mit 100 Mikrolitern Ammoniumbicarbonatlösung in jedes Röhrchen des Gesamtleerwerts und des internen Standardrohlings vor und bewahren Sie alle Proben auf Eis auf.Bereiten Sie Qualitätskontrollproben vor, wobei zu berücksichtigen ist, dass zwischen jedem Satz von 10 Proben eine Qualitätskontrollprobe platziert wird. Geben Sie 10 Mikroliter gepooltes menschliches Plasma in 2-Milliliter-Röhrchen und geben Sie dann 10 Mikroliter interne Standardlösung in alle internen Standard-Blind-, Qualitätskontroll- und Studienproben. Zu jeder Probe 300 Mikroliter minus 20 Grad Celsius Butanol-Methanol-Gemisch geben und bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur auf Thermomixer schütteln.Als nächstes werden 300 Mikroliter Heptan-Ethylacetat-Gemisch zugegeben und bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer geschüttelt, dann 300 Mikroliter 1%ige Asketinsäuremischung hinzugefügt und 5 Minuten bei 450 g bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer geschüttelt. Zentrifugieren Sie bei 2.800 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und überführen Sie 360 Mikroliter der oberen Phase in ein neues 2-Milliliter-Selbstverschlussröhrchen, das als 2 gekennzeichnet ist. Nach Zugabe von 320 Mikrolitern Heptanethylacetat zu dem mit 1 gekennzeichneten Wasserphasenröhrchen wird es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer bei 450 g geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.800 g zentrifugiert, wie zuvor gezeigt.Übertragen Sie 320 Mikroliter der oberen Phase und kombinieren Sie sie mit der Fraktion aus dem vorherigen Schritt in Röhrchen 2. Ebenso 250 Mikroliter Heptanethylacetat in die Wasserphase in Röhrchen 1 geben und bei 450 g 5 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln. Erneut bei 2.800 g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, dann 200 Mikroliter der oberen Phase übertragen und mit den Fraktionen aus den vorherigen Schritten in Röhrchen 2 kombinieren.In einem Vakuumkonzentrator bei 35 Grad Celsius zur Trockene eindampfen und in 300 Mikrolitern MS-Mischlösung wieder auflösen. Jedes Röhrchen 5 Sekunden lang schwenken, um sicherzustellen, dass sich alles auflöst, und bei 18.200 g 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Übertragen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern in die Mikroliterplatte für die Analyse des positiven Ionisationsmodus und verdünnen Sie es mit 50 Mikrolitern MS-Mischlösung.Verdünnen Sie erneut mit 80 Mikrolitern MS-Mischung und übertragen Sie ein Aliquot von 20 Mikrolitern in die MTP-Platte für die Analyse des negativen Ionisationsmodus. Wickeln Sie die Platte mit Folie ein und halten Sie sie vor der Analyse bei 4 Grad Celsius. Kalibrieren Sie ein MS sowohl im positiven als auch im negativen Modus gemäß den Anweisungen des Herstellers 5 Tage oder weniger vor der Analyse.Installieren Sie die Direktinfusions-Nanoquelle im Voraus und stellen Sie sicher, dass sie richtig an der Transferkapillare des MS und einem 4,1-Mikrometer-Düsenchip in den Chiphalter ausgerichtet ist, und überprüfen Sie dann die Parameter für positive und negative Infusionen, die einem Gasdruck von 1,25 psi, einer Quellspannung von 1,1 Kilovolt und 5 Mikrolitern Probeninjektionsvolumen entsprechen. Ausgangskontaktverschluss Rel1 für 2,5 Sekunden, 5 Minuten Lieferzeit, Plattenkühlung bei 4 Grad Celsius, dann den Temperaturregler einrichten und eine neue Platte erstellen. Überprüfen und stellen Sie die Software für den positiven Modus ein, dass die MS-Methode mit einer Kapillartemperatur von 250 Grad Celsius und einem HF-Wert des S-Objektivs von 65,0 eingerichtet ist. Öffnen Sie in der Xcalibur-Software die positive Methode und überprüfen Sie, ob die MS-Erfassung mit vollem Scan von null bis 1 Minute im Bereich von 550 bis 1.000 m/z bei einer Auflösung von 140.000 mit automatischer Verstärkungsregelung von 1 Million und maximaler Injektionszeit von 50 Millisekunden eingestellt ist.Wenden Sie eine Sperrmasse von 680,48022 an. Vergewissern Sie sich, dass die datenunabhängige MS/MS-Erfassungsmethode zwischen dem 1- und 5-Minuten-Zeitbereich mit einer Auflösung von 17.500 und einer festen Anfangsmasse von 250 m/z eingerichtet ist. Prüfen Sie, ob die automatische Verstärkungsregelung für MS2 auf 100.000 und eine maximale Einspritzzeit auf 64 Millisekunden, eine Kollisionsenergie von 20 NCE, das Isolationsfenster auf 1 m/z eingestellt ist und dass eine Einschlussmassenliste von 398 bis 1.100 m/z mit einem Massenschritt von 1 Dalton verwendet wird.Überprüfen Sie für die Erfassung im negativen Modus in der Tune-Software, dass die MS-Methode mit einer Kapillartemperatur von 250 Grad Celsius in der HF-Stufe der S-Linse bei 65,0 in der MS-Tune-Datei eingerichtet ist. Überprüfen Sie als Nächstes in der Xcalibur-Software, ob der Full-Scan-Erfassungsmodus von null bis 1 Minute mit einer Auflösung von 140.000 eingerichtet ist, die den Bereich von 400 bis 940 m/z, eine automatische Verstärkungsregelung von 1 Million, eine maximale Einspritzzeit von 200 Millisekunden und eine Sperrmasse von 526,46262 abdeckt. Überprüfen Sie, ob die MS2-Erfassung im DIA-Modus zwischen 1 und 5 Minuten des Laufs mit einer Auflösung von 17.500 mit einer festen Anfangsmasse von 150 m/z, einer automatischen Verstärkungsregelung von 100.000, einer maximalen Einspritzzeit von 64 Millisekunden und einer maximalen Kollisionsenergie von 35 NCE unter Verwendung der Einschlussmassenliste von 400 bis 940 mit einem Massenschritt von 1 Dalton eingerichtet ist.Erstellen Sie die Analysesequenzwarteschlange in der Xcalibur-Software im positiven Modus und lösen Sie sie aus, erstellen Sie dann die Sequenz in der ChipSoft-Software und starten Sie die Analyse, während Sie darauf warten, dass die Probenaufnahme durch ein Kontaktschließsignal ausgelöst wird, das vom Direktinfusionsroboter für jede Probe kommt. Wenn die Analyse im positiven Modus abgeschlossen ist, erstellen Sie die Warteschlange für die Analysesequenz in der Xcalibur-Software im negativen Modus und lösen Sie sie aus, erstellen Sie dann die Sequenz in der ChipSoft-Software und starten Sie die Analyse, während Sie darauf warten, dass die Probenaufnahme durch ein Kontaktschließsignal ausgelöst wird, das vom Direktinfusionsroboter für jede Probe kommt. Die normalisierte Gesamtlipidkonzentration wurde aus den 14 am häufigsten vorkommenden Lipidklassen identifiziert und quantifiziert, die für die Lipidklassen PE, PEO, PC, PCO, PI und PG leicht erhöht war und für SM-, LPE- und PA-Lipide eine gewisse Herunterregulierung beobachtet wurde.Während bei TAGs und PS kein Unterschied zu sehen war. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass unter den molekularen Merkmalen, die auf der gesamten Summenformel basieren, 100 bis 120 Verbindungen signifikant durch die Exposition gegenüber Zigarettenrauch beeinflusst wurden. Die Dekonvolution der MS2-Fragmentierung und die Normalisierung der Fragmentsignalintensitäten ermöglichten die nähere Definition der Gesamtmenge jeder konjugierten Fettsäure, die in jedem Lipidglas vertreten ist, und den Vergleich dieser Daten zwischen exponierten und Kontrollgruppen. Es wurde eine Abnahme der vollständig gesättigten und wenigen ungesättigten Fettsäuren beobachtet, während die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Zusammensetzung der PC-, PE- und PG-Phospholipidklassen in der Zigarettenrauchgruppe für alle Zeitpunkte erhöht waren.Die extremen Fälle von PC und PG, die mit Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure konjugiert waren, wurden ausschließlich in der 3R4F CS-Expositionsgruppe nachgewiesen. Das Pipettieren der Probe und der QC-Probe muss mit Low-Band-Spitzen erfolgen und genau sein, was bedeutet, dass die Spitzen zwischen den einzelnen Proben überprüft werden müssen. Das Pipettieren der internen Standardlösung ist kritisch und muss genau sein.Die Lösung von 1 zu 1 Dichlormethan-Methanol muss mit Vorsicht gehandhabt werden, und es muss ein nicht weichmacherhaltiger Spitzen verwendet werden, um zu vermeiden, dass Kunststoffpolymere in den Proben vorhanden sind. Die Spitzen müssen zwischen den einzelnen Proben gewechselt werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Verfahren zum Messen von RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Änderungen in Zellen und Geweben

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Forschung

Biochemie

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blatt-Spray-Massenspektrometrie: Eine schnelle Ambient Ionisation Technik direkt Metaboliten von Pflanzengewebe bewerten

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extrazelluläre Protein-Microarray-Technologie für hohen Durchsatz-Erkennung von geringe Affinität-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantifizierung von Coenzym A in Zellen und Geweben

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Anreicherung von Säugetiergeweben und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...