Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לצוות המחקר ובמיוחד להודות על הסיוע הטכני והתמיכה של צוותי המחקר הביולוגי והאירוסולים במו"פ PMI, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., סינגפור, ו- PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, שוויץ. המחברים מודים לסם אנסארי על ניהול הביו-בנקאות ומודים על תמיכתו של סינדהורה בהרגאבי גופלה רדי על עריכת טיוטה של כתב היד.

כל הכותבים הם עובדי פיליפ מוריס אינטרנשיונל. פיליפ מוריס אינטרנשיונל היא מקור המימון והחסות היחיד לפרויקט זה.

עשן סיגריות מוכר כגורם סיכון עיקרי הקשור להתפתחות מחלות דלקתיות כרוניות של הריאה, כולל קרצינומה ריאתית, ברונכיטיס ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)1. מעבר להשפעה על הריאות, חשיפה לניתוח קיסרי ממלאת תפקיד משמעותי בהתפתחות מחלות נוספות כגון מחלת עורקים כליליים טרשתיים ומחלות כלי דם היקפיים1. מחלות לב וכלי דם, יחד עם COPD, הן סיבות המוות המובילות הראשונה והשלישית בעולם, בהתאמה. גישות הערכת סיכונים טוקסיקולוגיות הסתמכו באופן היסטורי על שימוש במודלים של בעלי חיים כגון מכרסמים. מודלים של חולדות ועכבר עם אף בלבד או גוף מלא משמשים בדרך כלל לחקר ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה לניתוח קיסרי.
לדוגמה, בדרך כלל, 6 חודשים של חשיפה לעשן גורמים להפרעות היסטולוגיות ותפקודיות בריאות מורין המחקות את אלה של מחלות אנושיות, כולל אמפיזמה, עיצוב מחדש של דרכי הנשימה ויתר לחץ דם ריאתי, אם כי השינויים קלים יחסית לאלה שנצפו אצל מעשנים אנושיים לטווח ארוך2. הן ברקמות של בעלי חיים והן ברקמות אנושיות, מחקרים הבחינו במגוון רחב של שינויים מולקולריים בתגובה לחשיפה לניתוח קיסרי, כולל תגובות לעקה חמצונית, דלקת ושינויים ברקמות מבניות 3,4. באופן לא מפתיע, חשיפה לניתוח קיסרי דווחה גם כבעלת השפעה מרחיקת לכת על הליפידום של הריאות, כולל השפעות על שומנים פעילי שטח, מתווכי איתות שומנים ושומנים מבניים 4,5,6.
כדי לאפיין את השינויים בשומנים בתפזורת הנגרמים על ידי חשיפה ארוכת טווח ל-CS של ריאות עכברים, ביצענו ניתוח מהיר וכמותי של ספקטרומטריית מסה בעירוי ישיר של רובה ציד. לאחר הצגת שיטת הליפידומיה של רובה הציד בשנת 20057, שיטה זו שימשה ביעילות להרחבת הידע שלנו על מטבוליזם תאי שומנים 8,9,10 במערכות מודל כגון שמרים 11, Caenorhabditis elegans12, ו- Drosophila melanogaster13, כמו גם במגוון רחב של סוגי דגימות יונקים כגון קווי תאים 14, 15,16 רקמות אנושיות שונות17,18 ומכרסמים19,20 ונוזלי גוף 21,22.
במהלך העשורים האחרונים, מחקרים חשפו את המורכבות של תגובות תאיות לשינויים סביבתיים, המערבות אלפי חלבונים, שומנים ומטבוליטים המחוברים זה לזה. עובדה זו הבהירה כי שימוש בטכניקות אנליטיות חדישות חיוני להשגת מבט מעמיק על המכונות המולקולריות ולחשיפת מלוא עוצמתן של ההשפעות הפיזיולוגיות האקסוגניות. בהקשר זה, טביעות האצבע השומניות המקיפות והכמותיות המיוצרות על ידי גישות ליפידומיה של רובה ציד יכולות להוסיף ביעילות לידע שלנו על מטבוליזם תאי שומנים 8,9,10.
בנוגע לחשיפה לניתוח קיסרי כגורם סיכון למספר מחלות, גישות להערכת סיכונים טוקסיקולוגיות הסתמכו באופן היסטורי על שימוש במודלים של בעלי חיים כגון מכרסמים. Shotgun lipidomics MS מספק כלי אנליטי מהיר, רגיש וכמותי להערכת הפרעות ליפידום בסוגי דגימה רבים. התכונה הייחודית של ליפידומיה של רובה ציד היא ניתוח הזרקה ישירה אוטומטית של תמצית שומנים כוללת - מתובל עם תקנים פנימיים מסומנים - ללא הפרדה כרומטוגרפית למכשיר MS ברזולוציה גבוהה באמצעות ננו-שבב מוליך המייצר ננו-ספריי יינון אלקטרוספריי (ESI)23.
מידע יחס המסה לטעינה שנרכש בו-זמנית במצב MS1 מספק את טביעת הרגל השומנית הכוללת של כל הליפידים האנדוגניים השלמים. לחלופין, מצב MS2/MS3, שבו מולקולות השומנים האב מקוטעות ומנותחות, מספק מידע מבני נוסף. ניתוח נתונים דורש תוכנה מיוחדת וכולל דה-קונבולוציה של ספקטרום ומשימות שיא בספקטרום מאוגד המובילות לזיהוי שומנים והבהרת מבנה כימי משוער. בנוסף, ניתן לבצע כימות מוחלט על ידי זינוק תערובת תקנים פנימית מסומנת המכילה לפחות תקן שומנים אחד לכל סוג שומנים מעניין. בסך הכל, עם הטכניקה הנוכחית, ניתוח טרשת נפוצה לוקח כמה דקות לכל דגימה יכול לכסות זיהוי וכימות של עד 800 שומנים מ 14 קבוצות שומנים24 ברקמות מכרסמים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

שומנים ממלאים תפקיד חיוני כמרכיבים חיוניים של כל התאים הפרוקריוטים והאיקריוטים. שיפורים טכנולוגיים מתמידים בספקטרומטריית מסות הפכו את הליפידומיה לכלי אנליטי רב עוצמה לניטור הרכבי ליפידום של רקמות במצבים הומיאוסטטיים כמו גם במצבי מחלה. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לשיטת ניתוח שומנים של רובה ציד, התומכת בזיהוי וכימות בו זמנית של כמה מאות מיני שומנים מולקולריים בדגימות שונות של רקמות ונוזלים ביולוגיים בתפוקה גבוהה. שיטה זו ממנפת הזרקה ישירה אוטומטית של ננו-זרימה של תמצית שומנים כוללת עם תקנים פנימיים מסומנים ללא הפרדה כרומטוגרפית למכשיר ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. החל מכמויות תת-מיקרוגרם של רקמת מכרסמים, ניתוח הטרשת הנפוצה אורך 10 דקות לכל דגימה ומכסה עד 400 שומנים מ-14 סוגי שומנים ברקמת ריאה של עכבר. השיטה המוצגת כאן מתאימה היטב לחקר מנגנוני מחלה ולזיהוי וכימות סמנים ביולוגיים המצביעים על רעילות מוקדמת או השפעות מועילות בתוך רקמות מכרסמים.

כאן, כתוצאות מייצגות, אנו מציגים נתונים הממחישים כיצד ניתן להשתמש בליפידומיה של רובה ציד כדי לחקור את ההשפעות של ניתוח קיסרי על ריאותיהם של עכברים. פרוטוקול ניתוח השומנים של רובה הציד יושם בהצלחה במחקר in vivo לניתוח השוואתי של שתי קבוצות דגימות: רקמות ריאה שנותחו מתשע נקבות עכברי Apoe−/− שנחשפו ל-CS (קבוצת 3R4F; בקרה חיובית) ומספר שווה של עכברים שהוחזקו בתנאי אוויר צח (קבוצת דמה) כביקורת שלילית שנאספה לאחר 3 חודשים, נקודות זמן חשיפה של 4 חודשים ו-6 חודשים. בעלי החיים הוחזקו תחת אוויר צח מסונן וממוזג בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס ו -55% ± 15% לחות והוזנו בדיאטת גלולות המוקרנות בגמא. משטר האור נשמר בשעה 12 שעות ביום. עד שמונה עכברים שוכנו בכל כלוב. סיגריות ייחוס 3R4F לטיפול בחשיפה נרכשו מאוניברסיטת קנטקי כדי לייצר את תרסיס 3R4F CS (600 מיקרוגרם של חומר חלקיקי כולל TPM/L) עבור ריכוז חשיפה למטרה שווה ערך ל -28 מיקרוגרם ניקוטין / L.CS עשן מסיגריות 3R4F יוצר באמצעות 30 מכונות עישון סיבוביות על פי פיליפס ואחרים . בהתבסס על פרוטוקול העישון האינטנסיבי של Health Canada, 55 מ"ל נפח נשיפה, נשיפה אחת לכל 30 שניות וחסימה של 100% של חורי אוורור הוחלו על סיגריות 3R4F כדי לספק חשיפה מספקת. כל הפרטים הנוספים על תכנון המחקר דווחו בעבר27,28.
בסך הכל, ~400 מיני שומנים מולקולריים מ-14 קבוצות השומנים הנפוצות ביותר זוהו וכומתו (איור 3). ריכוז השומנים המנורמל הכולל בכיתה היה מעט גבוה יותר עבור קבוצות השומנים PE, PEO, PC, PCO, PI ו-PG, ונצפתה ירידה מסוימת בוויסות עבור שומנים SM, LPE ו-PA (איור 3A), בעוד שלא ניתן היה לראות הבדל עבור TAGs ו-PS. באופן מעניין, רמות גבוהות של שומנים פלסמלוגנים PCO ו-PEO בקבוצת CS דווחו בתאי דלקת29 . אחד התפקידים התוך-תאיים של שומנים פלסמלוגנים הוא פעילות נוגדת חמצון. תחת חשיפה למיני חמצן תגובתי (ROS) וחנקן (RNS), דווח על חמצון סלקטיבי של פלסמלוגנים בהשוואה לפוספוליפידים דיאציל30. הקשר אניל-אתר במבנה הכימי של פלסמלוגנים רגיש להתקפה רדיקלית על עקה חמצונית31. המוצרים העיקריים של התקפה רדיקלית הם חומצות איקוסאטראנואיות הידרוקסילציה, פוספוליפידים 2-מונואצילגליצרול, פנטדקנול, חומצות פורמיות, α-הידרוקסיאלדהידים באורכי שרשרת שונים, 1-פורמיל-2-ארכידונויל גליצרופוספוליפיד, וליזופוספוליפידים.
התוצאות האלה מראות שבין התכונות המולקולריות המבוססות על הנוסחה המולקולרית הכוללת, 100-120 תרכובות הושפעו באופן משמעותי מחשיפה לניתוח קיסרי (איור 3D). הדה-קונבולוציה המפורטת של מידע הפיצול MS2 והנורמליזציה של עוצמות אות המקטע אפשרו הגדרה משוערת של הכמות הכוללת של כל חומצת שומן מצומדת (FA) המיוצגת בכל מחלקת שומנים (איור 3E) והשוואה של נתונים אלה בין קבוצות חשופות וקבוצת ביקורת. נצפתה ירידה ברורה הן ב-FAs רוויים לחלוטין והן באלה עם מעט אי-רוויות, בעיקר בהקשר של ליזו-ליפידים. לעומת זאת, חומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFA) בהרכב של מחלקות פוספוליפידים PC, PE ו-PG היו גבוהות בקבוצת CS עבור כל נקודות הזמן. המקרים הקיצוניים של PC ו-PG מצומדים לאיקוסאפנטנואית (EPA) וחומצה דוקוסהקסנואית (DHA) זוהו באופן בלעדי בקבוצת החשיפה ל-3R4F CS (איור 3E, צבע אדום).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> איור 1: פריסת לוחות לפיזור דגימות בניסוי ברדפורד. דוגמאות ריקות וסטנדרטיות ממוקמות במשולש בעמודות 1-3; דוגמאות לא ידועות ממוקמות בשכפול בעמודות 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> איור 2: פריסת לוחות של לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לניתוח ספקטרומטריית מסות של רובה ציד. התפלגות דגימות ריקות, סטנדרטיות, לא ידועות ו- QC לרכישה במצב יינון חיובי ממופה בצד שמאל של הלוח (עמודות 1-6); כל הדגימות למצב יינון שלילי ממוקמות מימין (עמודות 7-12). קיצורים: pos = חיובי; QC = בקרת איכות; neg = שלילי; TB = ריק מוחלט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> איור 3: ניתוח ליפידומיה של רובה ציד של ריאות עכברים שנחשפו לעשן סיגריות. עכברי Apoe−/− נחשפו ל-CS מסיגריית הייחוס 3R4F או אוויר צח (דמה). (A) ריכוזי מחלקת שומנים ומספר מיני השומנים בכל מחלקה. עבור כל מחלקה, מספר מיני השומנים המכומתים נתון בסוגריים. רווח בר-סמך ממוצע ו-95% עבור כל קבוצת שומנים, בנפרד עבור כל סוג חשיפה (מצטבר על פני שלוש נקודות זמן). (B) חלקות הר געש המציגות את גודל ההשפעה (שינוי קיפול log2) ואת המשמעות (-log10 FDR-adjusted p value) של מיני השומנים המכומתים עבור השוואת 3R4F CS לעומת השוואה מזויפת בשלוש נקודות הזמן. שומנים גבוהים באופן משמעותי מסומנים בצהוב; ירידה משמעותית בשומנים מסומנת בציאן (ערך p מותאם FDR < 0.05). (C) שפע דיפרנציאלי של 25 מיני השומנים עם השינויים הגדולים ביותר בקפל הממוצע האבסולוטי. שינויי קיפול Log2 עבור השוואת 3R4F CS לעומת דמה מקודדים בצבעים, ומובהקות סטטיסטית מסומנת: *: ערך p מותאם FDR < 0.01; X: ערך p מותאם FDR < 0.05. (ד) חלקות השוואה. מקדמי המתאם להשוואות הקיפול-שינוי מסומנים בצבעים, ומצוין מספר השומנים המשותפים השופעים דיפרנציאלית (סה"כ מספרים בשוליים). תרשימי עוגה מציגים את אחוז השומנים המשותפים השופעים באופן דיפרנציאלי עם אותו כיוון שינוי (סימן FC). כוכבית מצביעה על חפיפה משמעותית של השומנים השופעים באופן דיפרנציאלי. (E) שפע דיפרנציאלי של FAs מצומדים לכל מחלקת שומנים. מפת חום כמו בלוח C עבור חומצות שומן מצומדות עם הבדלי שפע משמעותיים בין 3R4F וחשיפה דמה בכל שלוש נקודות הזמן (ערך p מותאם FDR < 0.05). הכמות של כל חומצת שומן לכל קבוצת שומנים הוערכה בהתבסס על עוצמות MS2 של שברי חומצות שומן. קיצורים: CS = עשן סיגריות; FDR = שיעור גילוי כוזב; FC = שינוי קיפול; FA = חומצות שומן; PC = פוספטידילכולין; PS = פוספטידיל-סרין; TAG = טריאצילגליצרול; SM = ספינגומיילין; PEO = פלסמלוגן פוספטידיל-אתנולמין; PE = פוספטידיל-אתנולמין; PG = פוספטידיל גליצרול; PI = פוספטידילינוזיטול; DAG = דיאצילגליצרול; SE = אסטרים סטרול / כולסטריל; PCO = פלסמלוגן פוספטידילכולין; LPC = ליסו פוספטידילכולין; LPE = lyso phosphatidylethanolamine; PA = חומצה פוספטידית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ריכוז סופי BSA (מ"ג/מ"ל)</td>
			<td>תמיסת BSA במינון 2 מ"ג/מ"ל (μL)</td>
			<td>מאגר אמוניום ביקרבונט (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 מתוך תמיסת 0.125 מ"ג/מ"ל</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: סכימת דילול של התקן הפנימי BSA עבור עקומת הכיול עבור מבחן ברדפורד. קיצור: BSA = אלבומין בסרום בקר.
מידע משלים: קבצי MFQL המשמשים לזיהוי שומנים LipidXplorer. חבילת .zip מורכבת מקבצי MFQL הנדרשים בנפרד, שכל אחד מהם נקרא לפי תבנית זו: <קיצור מחלקת ליפידים>_<מצב יינון>_MS2.mfql (למשל, PE_neg_MS2.mfql). שמות הקבצים לזיהוי סטנדרטי פנימי עם תווית כוללים את התג D7(D9) בתג <קיצור ליפידים> (לדוגמה, PED7_neg_MS2.mfql). קבצי MFQL אלה משמשים לאימות כמות הדאוטריום בתקן הפנימי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

ליפידומיה מבוססת ספקטרומטריית מסות Shotgun מספקת תמונת מצב כמותית רגישה של ספקטרום רחב של סוגי שומנים בו זמנית במדידה אחת מרקמות מכרסמים שונות.

Shotgun Lipidomics של רקמות מכרסם

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

הפרוטוקול המוצג מאפשר לכמת מגוון רחב של שומנים ברקמת בעלי חיים. זהו כלי קל לחקר מנגנוני שומנים וגם לזיהוי סמנים ביולוגיים המעידים על רעילות מוקדמת במודלים של בעלי חיים. השיטה מספקת פרופיל כמותי של יותר מ-400 ליפידים מולקולריים ב-14 סוגי שומנים שונים במגוון רחב של מטריצות מדגם עם זמן מגמה של 10 דקות לדגימה.כדי להתחיל, לדלל צנטריפוגה aliquot 1 supernatant כפול ריכוז עם מאגר אמוניום ביקרבונט. לאחר הכנת העקומה הסטנדרטית של אלבומין בסרום בקר, מערבלים את הצינורות הסטנדרטיים וצנטריפוגות את הצינורות ב 18, 200 גרם למשך 15 שניות בטמפרטורת החדר. מהצינורות הסטנדרטיים שהוכנו קודם לכן, העבירו 6 מיקרוליטר כל אחד מהריק, התקנים והדגימות לצלחת בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות.לאחר מכן, להוסיף 250 מיקרוליטר של מגיב ברדפורד לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית לערבב. לאחר הדגירה במשך 5 דקות, מדדו את הבליעה באורך גל של 595 ננומטר באמצעות קורא לוחות. הכינו צינורות של 2 מיליליטר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט לכל צינור של הריק הריק והפנימי הריק והפנימי ושמרו את כל הדגימות על קרח.הכינו דגימות בקרת איכות, בהתחשב בכך שדגימת בקרת איכות אחת ממוקמת בין כל קבוצה של 10 דגימות. הוסף 10 מיקרוליטר של פלזמה אנושית מאוגמת לצינורות 2 מיליליטר, ולאחר מכן הקפיץ 10 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית פנימית לכל דגימות התקן הפנימי הריק, בקרת האיכות והמחקר. מוסיפים 300 מיקרוליטר של תערובת מתנול בוטנול מינוס 20 מעלות צלזיוס לכל דגימה ומנערים ב-450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על תרמומיקסר.לאחר מכן, להוסיף 300 מיקרוליטר של תערובת הפטן אתיל אצטט ולנער ב 450 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer, ולאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של 1% תערובת חומצה סגפנית ולנער במשך 5 דקות ב 450 גרם בטמפרטורת החדר על thermomixer. צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר 360 מיקרוליטר של השלב העליון לצינור נעילה עצמית חדש 2 מיליליטר מסומן כמו 2. לאחר הוספת 320 מיקרוליטר של הפטן אתיל אצטט לצינור פאזת המים המסומן כ -1, נער ב 450 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על התרמומיקסר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כפי שהודגם קודם לכן.מעבירים 320 מיקרוליטר של השלב העליון ומשלבים אותם עם החלק מהצעד הקודם בצינור 2. באופן דומה, הוסף 250 מיקרוליטר של הפטן אתיל אצטט לשלב המים בצינור 1 ונער ב 450 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על התרמיקוסר. שוב, צנטריפוגה ב 2, 800 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר 200 מיקרוליטר של השלב העליון ולשלב אותו עם שברים מן השלבים הקודמים צינור 2.התאדו ליובש ב-35 מעלות צלזיוס ברכז ואקום והתמוססו מחדש ב-300 מיקרוליטר של תמיסת תערובת טרשת נפוצה. מערבול כל צינור במשך 5 שניות כדי להבטיח שהכל מומס וצנטריפוגה ב 18, 200 גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים אליציטוט של 50 מיקרוליטר לצלחת המיקרוליטר לניתוח מצב יינון חיובי ומדללים עם 50 מיקרוליטר של תמיסת תערובת טרשת נפוצה.שוב, לדלל עם 80 מיקרוליטר של תערובת MS ולהעביר aliquot של 20 מיקרוליטר לתוך צלחת MTP עבור ניתוח מצב יינון שלילי. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ושומרים על 4 מעלות צלזיוס לפני הניתוח. כיול טרשת נפוצה הן במצב חיובי והן במצב שלילי בהתאם להוראות היצרן 5 ימים או פחות לפני הניתוח.התקן את מקור ננו העירוי הישיר מראש, וודא שהוא מיושר כראוי כנגד נימי ההעברה של הטרשת הנפוצה ושבב פייה 4.1 מיקרומטר למחזיק השבב, ולאחר מכן בדוק את הפרמטרים לעירוי חיובי ושלילי המתאים ללחץ גז של 1.25 psi, מתח מקור של 1.1 קילו-וולט, 5 מיקרוליטר נפח הזרקת דגימה, סגירת מגע פלט Rel1 למשך 2.5 שניות, 5 דקות של זמן אספקה, קירור צלחת ב 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להגדיר את בקר הטמפרטורה וליצור צלחת חדשה. למצב חיובי, בדוק וכוונן את התוכנה ששיטת MS מוגדרת עם טמפרטורה נימית של 250 מעלות צלזיוס ורמת RF של עדשת S של 65.0. בתוכנת Xcalibur, פתח את השיטה החיובית ובדוק שרכישת MS בסריקה מלאה מוגדרת מאפס עד דקה אחת בטווח של 550 עד 1, 000 m/z ברזולוציה של 140, 000 עם בקרת רווח אוטומטית של מיליון וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות השנייה.החל מסת מנעול של 680.48022. בדוק ששיטת הרכישה של MS/MS שאינה תלויה בנתונים מוגדרת בין טווח הזמן של 1 ו- 5 דקות ברזולוציה של 17, 500 עם מסה ראשונה קבועה של 250 m/z. בדוק כי בקרת ההגברה האוטומטית עבור MS2 מוגדרת ב- 100, 000 וזמן הזרקה מרבי ב- 64 אלפיות השנייה, אנרגיית התנגשות של 20 NCE, חלון הבידוד ב- 1 m/z וכי רשימת מסת הכללה מ- 398 ל- 1, 100 m/z משמשת עם צעד מסה של 1 דלתון.עבור הרכישה במצב שלילי, בדוק את תוכנת הכוונון ששיטת MS מוגדרת עם הטמפרטורה הנימית ב 250 מעלות צלזיוס ברמת RF עדשת S ב 65.0 בקובץ המנגינה של MS. לאחר מכן, בתוכנת Xcalibur, בדוק שמצב רכישת הסריקה המלאה מוגדר מאפס לדקה אחת ברזולוציה של 140, 000 המכסה את טווח 400 עד 940 m/z, בקרת רווח אוטומטית של 1 מיליון, זמן הזרקה מרבי של 200 אלפיות השנייה, ומסת נעילה של 526.46262. בדוק כי רכישת MS2 במצב DIA מוגדרת בין 1 ל 5 דקות של ריצה ברזולוציה של 17, 500 עם מסה ראשונה קבועה של 150 m/z, בקרת הגברה אוטומטית של 100, 000, 64 אלפיות השנייה של זמן הזרקה מרבי ו 35 NCE של אנרגיית התנגשות באמצעות רשימת מסת הכללה מ 400 ל 940 עם צעד מסה של 1 דלתון.צור את תור רצף הניתוח בתוכנת Xcalibur במצב חיובי והפעל אותו, ולאחר מכן צור את הרצף בתוכנת ChipSoft והתחל את הניתוח תוך המתנה להפעלת רכישת הדגימה על ידי אות סגירת מגע המגיע מרובוט העירוי הישיר עבור כל דגימה. כאשר ניתוח המצב החיובי הושלם, צור את תור רצף הניתוח בתוכנת Xcalibur במצב שלילי והפעל אותו, ולאחר מכן צור את הרצף בתוכנת ChipSoft והתחל את הניתוח תוך המתנה לרכישת הדגימה שיופעל על ידי אות סגירת מגע המגיע מרובוט העירוי הישיר עבור כל דגימה. ריכוז השומנים המנורמל הכולל זוהה וכומת מתוך 14 קבוצות השומנים הנפוצות ביותר, אשר היה מעט גבוה עבור מחלקות השומנים PE, PEO, PC, PCO, PI ו- PG ונצפתה ויסות נמוך מסוים עבור שומנים SM, LPE ו- PA.אמנם לא ניתן היה לראות הבדל עבור TAGs ו- PS. תוצאות אלה מראות גם כי בין התכונות המולקולריות המבוססות על הנוסחה המולקולרית הכוללת, 100 עד 120 תרכובות הושפעו באופן משמעותי מחשיפה לעשן סיגריות. הדה-קונבולוציה של פיצול MS2 והנורמליזציה של עוצמות אות השבר אפשרה הגדרה משוערת של הכמות הכוללת של כל חומצת שומן מצומדת המיוצגת בכל שומנים והשוואה של נתונים אלה בין קבוצות חשופות וקבוצת ביקורת. נצפתה ירידה בחומצות שומן רוויות במלואן ומעט בלתי רוויות, בעוד שחומצות השומן הרב בלתי רוויות בהרכב מחלקות PC, PE ו-PG פוספוליפידים היו גבוהות יותר בקבוצת עשן הסיגריות בכל נקודות הזמן.המקרים הקיצוניים של PC ו-PG מצומדים לחומצה איקוסאפנטאנואית וחומצה דוקוסהקסנואית זוהו באופן בלעדי בקבוצת החשיפה ל-3R4F CS. פיפטינג של הדגימה ודגימת QC צריך להיעשות עם קצוות פס נמוך ולהיות מדויקים, כלומר יש לבדוק את הטיפים בין כל דגימה. הצנרת של הפתרון הסטנדרטי הפנימי היא קריטית וחייבת להיות מדויקת.התמיסה של 1 עד 1 dichloromethane מתנול צריך להיות מטופל בזהירות ולא plasticizer המכיל טיפים יש להשתמש כדי למנוע פולימרים פלסטיק בדגימות. יש לשנות את הטיפים בין כל דגימה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS עבור אפיון מעמיק וכימות של גלוטמין ו asparagine Deamidation ב פרוטאומיקה Shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

העשרה של רקמות מיונקים וקסנפוס אוציטים עם כולסטרול

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...