Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
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Gli autori desiderano ringraziare il team di studio e in particolare riconoscere l'assistenza tecnica e il supporto dei team di bioricerca e aerosol presso PMI R & D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, e PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Svizzera. Gli autori ringraziano Sam Ansari per aver gestito il biobanking e riconoscono il sostegno di Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy per la redazione di una bozza del manoscritto.

Tutti gli autori sono dipendenti di Philip Morris International. Philip Morris International è l'unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto.

Il fumo di sigaretta (CS) è riconosciuto come un principale fattore di rischio associato allo sviluppo di malattie infiammatorie croniche del polmone, tra cui carcinoma polmonare, bronchite e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO)1. Oltre all'impatto polmonare, l'esposizione alla CS svolge un ruolo significativo nello sviluppo di altre malattie come la malattia coronarica aterosclerotica e la malattia vascolare periferica1. Le malattie cardiovascolari, insieme alla BPCO, sono rispettivamente la prima e la terza causa di morte in tutto il mondo. Gli approcci di valutazione del rischio tossicologico si sono storicamente basati sull'uso di modelli animali come i roditori. I modelli di ratto e topo in vivo solo naso o full-body sono comunemente usati per studiare gli effetti a lungo termine dell'esposizione alla CS.
Ad esempio, generalmente, 6 mesi di esposizione al fumo inducono anomalie istologiche e funzionali nei polmoni murini che imitano quelli delle malattie umane, tra cui enfisema, rimodellamento delle vie aeree e ipertensione polmonare, sebbene i cambiamenti siano relativamente lievi rispetto a quelli osservati nei fumatori umani a lungo termine2. Sia nei tessuti animali che in quelli umani, gli studi hanno osservato una vasta gamma di cambiamenti molecolari in risposta all'esposizione a CS, tra cui risposte allo stress ossidativo, infiammazione e cambiamenti strutturali del tessuto 3,4. Non sorprende che l'esposizione a CS abbia anche un impatto di vasta portata sul lipidoma polmonare, compresi gli effetti sui lipidi tensioattivi, sui mediatori della segnalazione lipidica e sui lipidi strutturali 4,5,6.
Per caratterizzare i cambiamenti lipidici di massa indotti dall'esposizione a lungo termine al CS dei polmoni di topo, abbiamo eseguito un'analisi di spettrometria di massa a infusione diretta rapida e quantitativa. Dopo l'introduzione del metodo di lipidomica shotgun nel 20057, questo metodo è stato efficacemente utilizzato per estendere le nostre conoscenze sul metabolismo cellulare lipidico 8,9,10 in sistemi modello come lievito 11, Caenorhabditis elegans12 e Drosophila melanogaster13, nonché in una vasta gamma di tipi di campioni di mammiferi come le linee cellulari 14, 15,16 vari tessuti umani17,18 e roditori19,20 e fluidi corporei21,22.
Negli ultimi decenni, gli studi hanno rivelato la complessità delle risposte cellulari ai cambiamenti ambientali, coinvolgendo migliaia di proteine, lipidi e metaboliti interconnessi. Ciò ha chiarito che l'utilizzo di tecniche analitiche all'avanguardia è essenziale per ottenere una visione approfondita dei macchinari molecolari e per scoprire l'intera entità degli impatti fisiologici esogeni. In questo contesto, le impronte lipidiche complete e quantitative prodotte dagli approcci lipidomici shotgun possono effettivamente aggiungere alle nostre conoscenze sul metabolismo cellulare lipidico 8,9,10.
Per quanto riguarda l'esposizione al CS come fattore di rischio per diverse malattie, gli approcci di valutazione del rischio tossicologico si sono storicamente basati sull'uso di modelli animali come i roditori. Shotgun lipidomics MS fornisce uno strumento analitico rapido, sensibile e quantitativo per valutare la perturbazione del lipidoma in numerosi tipi di campioni. La caratteristica unica della lipidomica shotgun è l'analisi automatizzata a iniezione diretta di un estratto lipidico totale - spiked con standard interni etichettati - senza separazione cromatografica in uno strumento MS ad alta risoluzione utilizzando un nanochip conduttivo che genera un nanospray di ionizzazione elettrospray (ESI)23.
Le informazioni sul rapporto massa-carica acquisite simultaneamente nella modalità MS1 forniscono l'impronta lipidica totale di tutti i lipidi endogeni intatti. Opzionalmente, la modalità MS2/MS3, in cui le molecole lipidiche madri vengono frammentate e analizzate, fornisce ulteriori informazioni strutturali. L'analisi dei dati richiede un software specializzato e include la deconvoluzione degli spettri e le assegnazioni dei picchi negli spettri raggruppati che portano all'identificazione dei lipidi e alla delucidazione della struttura chimica putativa. Inoltre, la quantificazione assoluta può essere eseguita mediante spiking di una miscela di standard interni etichettati contenente almeno uno standard lipidico per classe lipidica di interesse. Nel complesso, con la presente tecnica, l'analisi della SM che richiede pochi minuti per campione può coprire l'identificazione e la quantificazione di un massimo di 800 lipidi da 14 classi lipidiche24 nei tessuti dei roditori.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

I lipidi svolgono un ruolo vitale come componenti essenziali di tutte le cellule procariotiche ed eucariotiche. I costanti miglioramenti tecnologici nella spettrometria di massa hanno reso la lipidomica un potente strumento analitico per il monitoraggio delle composizioni del lipidoma tissutale negli stati omeostatici e patologici. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per un metodo di analisi dei lipidi shotgun che supporta il rilevamento e la quantificazione simultanea di alcune centinaia di specie lipidiche molecolari in diversi campioni di tessuto e biofluido ad alta produttività. Questo metodo sfrutta l'iniezione diretta automatizzata di nano-flusso di un estratto lipidico totale arricchito con standard interni etichettati senza separazione cromatografica in uno strumento di spettrometria di massa ad alta risoluzione. A partire da quantità inferiori al microgrammo di tessuto dei roditori, l'analisi della SM richiede 10 minuti per campione e copre fino a 400 lipidi da 14 classi lipidiche nel tessuto polmonare del topo. Il metodo qui presentato è adatto per studiare i meccanismi della malattia e identificare e quantificare i biomarcatori che indicano tossicità precoce o effetti benefici all'interno dei tessuti dei roditori.

Qui, come risultati rappresentativi, presentiamo i dati che illustrano come la lipidomica del fucile può essere utilizzata per studiare gli effetti della CS sui polmoni dei topi. Il protocollo di analisi lipidica shotgun è stato applicato con successo per uno studio in vivo per l'analisi comparativa di due gruppi di campioni: tessuti polmonari sezionati da nove topi femmina Apoe-/− esposti a CS (gruppo 3R4F; controllo positivo) e un numero uguale di topi mantenuti in condizioni di aria fresca (gruppo sham) come controllo negativo raccolto a 3 mesi, Punti temporali di esposizione di 4 mesi e 6 mesi. Gli animali sono stati tenuti sotto aria fresca filtrata e condizionata a 22 °C ± 2 °C di temperatura e 55% ± 15% di umidità e alimentati con una dieta a pellet irradiata con raggi gamma. Il regime di luce è stato mantenuto a 12 ore al giorno. Sono stati ospitati fino a otto topi per ogni gabbia. Le sigarette di riferimento 3R4F per il trattamento di esposizione sono state acquistate dall'Università del Kentucky per generare l'aerosol 3R4F CS (600 μg di aerosol TPM / L di particolato totale) per una concentrazione di esposizione target equivalente a 28 μg di nicotina / L.CS fumo dalle sigarette 3R4F è stato prodotto utilizzando macchine per fumatori rotative a 30 porte secondo Phillips et al.27 . Sulla base del protocollo sul fumo intensivo di Health Canada, 55 ml di volume di soffio, un soffio ogni 30 s e il blocco del 100% dei fori di ventilazione sono stati applicati alle sigarette 3R4F per fornire un'esposizione sufficiente. Tutti i dettagli aggiuntivi sul disegno dello studio sono stati riportati in precedenza27,28.
Nel complesso, ~ 400 specie di lipidi molecolari delle 14 classi lipidiche più abbondanti sono state identificate e quantificate (Figura 3). La concentrazione lipidica totale normalizzata per classe era leggermente elevata per le classi lipidiche PE, PEO, PC, PCO, PI e PG, e una certa downregulation è stata osservata per i lipidi SM, LPE e PA (Figura 3A), mentre nessuna differenza poteva essere vista per TAG e PS. È interessante notare che livelli elevati di lipidi plasmalogeni PCO e PEO nel gruppo CS sono stati riportati nelle cellule infiammatorie29 . Una delle funzioni intracellulari dei lipidi plasmalogeni è l'attività antiossidante. Sotto esposizione a specie reattive dell'ossigeno (ROS) e azoto (RNS), è stata riportata l'ossidazione selettiva dei plasmalogeni rispetto ai fosfolipidi diacilici30. Il legame enil-etere nella struttura chimica dei plasmalogeni è sensibile all'attacco radicale dello stress ossidativo31. I principali prodotti dell'attacco radicale sono gli acidi eicosatetraenoici idrossilati, i fosfolipidi 2-monoacilglicerolo, il pentadecanolo, gli acidi formici, α-idrossialdeidi di varie lunghezze di catena, l'1-formil-2-arachidonoil glicerofosfolipidi e i lisofosfolipidi.
Questi risultati mostrano che, tra le caratteristiche molecolari basate sulla formula molecolare totale, 100-120 composti sono stati significativamente influenzati dall'esposizione a CS (Figura 3D). La deconvoluzione dettagliata delle informazioni di frammentazione MS2 e la normalizzazione delle intensità del segnale del frammento hanno permesso la definizione approssimativa della quantità totale di ciascun acido grasso coniugato (FA) rappresentato in ciascuna classe lipidica (Figura 3E) e il confronto di questi dati tra gruppi esposti e gruppi di controllo. È stata osservata una chiara diminuzione sia dei FA completamente saturi che di quelli con solo poche insaturazioni, soprattutto nel contesto dei lisosolipidi. Al contrario, gli acidi grassi polinsaturi (PUFA) nella composizione delle classi di fosfolipidi PC, PE e PG erano elevati nel gruppo CS per tutti i punti temporali. I casi estremi di PC e PG coniugati con acido eicosapentanoico (EPA) e docosaesaenoico (DHA) sono stati rilevati esclusivamente nel gruppo di esposizione 3R4F CS (Figura 3E, colore rosso).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figura 1: Layout delle piastre per la distribuzione del campione nel saggio di Bradford. I campioni bianchi e standard sono posti in triplice copia nelle colonne 1-3; I campioni sconosciuti sono inseriti in duplicato nelle colonne 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figura 2: Disposizione della piastra della micropiastra a 96 pozzetti per l'analisi della spettrometria di massa shotgun. La distribuzione dei campioni bianchi, standard, sconosciuti e QC per l'acquisizione in modalità di ionizzazione positiva è mappata sul lato sinistro della piastra (colonne 1-6); Tutti i campioni per la modalità di ionizzazione negativa sono posizionati sulla destra (colonne 7-12). Abbreviazioni: pos = positivo; QC = controllo qualità; neg = negativo; TB = vuoto totale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figura 3: Analisi lipidomica shotgun di polmoni di topo esposti al fumo di sigaretta. I topi Apoe-/− sono stati esposti al CS dalla sigaretta di riferimento 3R4F o all'aria fresca (sham). (A) Concentrazioni della classe lipidica e numero di specie lipidiche per classe. Per ciascuna classe, il numero di specie lipidiche quantificate è indicato tra parentesi. Intervalli di confidenza medi e del 95% per ciascuna classe lipidica, separatamente per ciascun tipo di esposizione (aggregati su tre punti temporali). (B) Grafici del vulcano che mostrano la dimensione dell'effetto (variazione log2 volte) e la significatività (-log10 FDR-adjusted p value) delle specie lipidiche quantificate per il confronto 3R4F CS rispetto a sham nei tre punti temporali. I lipidi significativamente elevati sono contrassegnati in giallo; i lipidi significativamente diminuiti sono marcati in ciano (valore p aggiustato per FDR < 0,05). (C) Abbondanza differenziale delle 25 specie lipidiche con le maggiori variazioni assolute medie di piega. Le variazioni di piega di Log2 per il confronto 3R4F CS rispetto a quello fittizio sono codificate a colori e la significatività statistica è indicata: *: valore p aggiustato per FDR < 0,01; X: valore p corretto per FDR < 0,05. (D) Grafici di confronto. I coefficienti di correlazione per i confronti di fold-change sono codificati a colori e viene indicato il numero di lipidi condivisi differenzialmente abbondanti (numeri totali ai margini). I grafici a torta mostrano la percentuale di lipidi condivisi differenzialmente abbondanti con la stessa direzione di cambiamento (segno FC). L'asterisco indica una significativa sovrapposizione dei lipidi differenzialmente abbondanti. (E) Abbondanza differenziale di FA coniugati per classe lipidica. Mappa di calore come nel pannello C per gli acidi grassi coniugati con differenze significative di abbondanza tra 3R4F e esposizione fittizia in tutti e tre i punti temporali (valore p aggiustato per FDR < 0,05). La quantità di ciascun acido grasso per classe lipidica è stata stimata in base alle intensità MS2 dei frammenti di acido grasso. Abbreviazioni: CS = fumo di sigaretta; FDR = tasso di false scoperte; FC = cambio di piega; FA = acidi grassi; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerolo; SM = sfingomielina; PEO = plasmalogen fosfatidiletanolammina; PE = fosfatidiletanolammina; PG = fosfatidil glicerolo; PI = fosfatidilinositolo; DAG = diacilglicerolo; SE = esteri sterolo/colesterile; PCO = plasmalogen fosfatidilcolina; LPC = lyso fosfatidilcolina; LPE = lyso fosfatidiletanolammina; PA = acido fosfatidico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentrazione finale BSA (mg/ml)</td>
			<td>Soluzione di BSA a 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Tampone bicarbonato di ammonio (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 di soluzione 0,125 mg/mL</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Schema di diluizione dello standard interno BSA per la curva di taratura per il saggio di Bradford. Abbreviazione: BSA = albumina sierica bovina.
Informazioni supplementari: File MFQL utilizzati per l'identificazione dei lipidi LipidXplorer. Il pacchetto .zip è costituito dai singoli file MFQL richiesti, ciascuno denominato seguendo questo modello: <abbreviazione della classe lipidica>_<modalità di ionizzazione>_MS2.mfql (ad esempio, PE_neg_MS2.mfql). I nomi dei file per l'identificazione standard interna etichettata includono il tag D7 (D9) nella <abbreviazione lipidica> (ad esempio, PED7_neg_MS2.mfql). Questi file MFQL vengono utilizzati per verificare la quantità di deuterio nello standard interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

La lipidomica basata sulla spettrometria di massa shotgun fornisce un'istantanea quantitativa sensibile di un ampio spettro di classi lipidiche simultaneamente in una singola misurazione da vari tessuti di roditori.

Lipidomica shotgun di tessuti di roditori

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Il protocollo presentato consente di quantificare un'ampia gamma di lipidi nei tessuti animali. È uno strumento facile per studiare i meccanismi lipidici e anche per identificare biomarcatori che indicano la tossicità precoce nei modelli animali. Il metodo fornisce un profilo quantitativo di oltre 400 lipidi molecolari in 14 diverse classi lipidiche in un'ampia varietà di matrici campione con un tempo di tendenza di 10 minuti per campione.Per iniziare, diluire la centrifuga aliquote 1 surnatante due volte la concentrazione con tampone bicarbonato di ammonio. Dopo aver preparato la curva standard dell'albumina sierica bovina, vortice le provette standard e centrifugare le provette a 18, 200 g per 15 secondi a temperatura ambiente. Dai tubi standard preparati in precedenza, trasferire 6 microlitri ciascuno dei pezzi bianchi, standard e campioni su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti.Quindi, aggiungere 250 microlitri di reagente Bradford a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta multicanale e mescolare. Dopo l'incubazione per 5 minuti, misurare l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 595 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Preparare tubi da 2 millilitri con 100 microlitri di soluzione di bicarbonato di ammonio in ciascun tubo del bianco totale e del bianco standard interno e conservare tutti i campioni sul ghiaccio.Preparare i campioni di controllo qualità, considerando che un campione di controllo qualità viene posizionato tra ogni set di 10 campioni. Aggiungere 10 microlitri di plasma umano in pool a tubi da 2 millilitri, quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione standard interna in tutti i campioni di bianco standard interni, controllo qualità e studio. Aggiungere 300 microlitri di miscela di metanolo butanolo a meno 20 gradi Celsius a ciascun campione e agitare a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente su termomixer.Quindi, aggiungere 300 microlitri di miscela di acetato di etile eptano e agitare a 450 g per 10 minuti a temperatura ambiente sul termomixer, quindi aggiungere 300 microlitri di miscela di acido ascetico all'1% e agitare per 5 minuti a 450 g a temperatura ambiente sul termomixer. Centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire 360 microlitri della fase superiore in un nuovo tubo autobloccante da 2 millilitri etichettato come 2. Dopo aver aggiunto 320 microlitri di eptano acetato di etile al tubo in fase acquosa etichettato come 1, agitare a 450 g per 5 minuti a temperatura ambiente sul termomiscelatore, quindi centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente come dimostrato in precedenza.Trasferire 320 microlitri della fase superiore e combinarli con la frazione del passaggio precedente nel tubo 2. Allo stesso modo, aggiungere 250 microlitri di eptano etilacetato alla fase acquosa nel tubo 1 e agitare a 450 g per 5 minuti a temperatura ambiente sul termomixer. Di nuovo, centrifugare a 2.800 g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire 200 microlitri della fase superiore e combinarla con le frazioni dei passaggi precedenti nel tubo 2.Evaporare fino all'essiccazione a 35 gradi Celsius in un concentratore sottovuoto e risciogliere in 300 microlitri di soluzione di miscela MS. Vortice ogni tubo per 5 secondi per assicurarsi che tutto sia sciolto e centrifugare a 18.200 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Trasferire un'aliquota di 50 microlitri nella piastra da microlitri per l'analisi della modalità di ionizzazione positiva e diluire con 50 microlitri di soluzione di miscela MS.Anche in questo caso, diluire con 80 microlitri di miscela MS e trasferire un'aliquota di 20 microlitri nella piastra MTP per l'analisi della modalità di ionizzazione negativa. Avvolgere la piastra con un foglio e conservare a 4 gradi Celsius prima dell'analisi. Calibrare un MS sia in modalità positiva che negativa in conformità con le istruzioni del produttore 5 giorni o meno prima dell'analisi.Installare la nano-sorgente di infusione diretta in anticipo, assicurandosi che sia correttamente allineata contro il capillare di trasferimento del MS e un chip ugello da 4,1 micrometri nel supporto del chip, quindi controllare i parametri per l'infusione positiva e negativa corrispondenti a una pressione del gas di 1,25 psi, tensione della sorgente di 1,1 kilovolt, 5 microlitri di volume di iniezione del campione, chiusura del contatto di uscita Rel1 per 2,5 secondi, 5 minuti di tempo di consegna, raffreddamento della piastra a 4 gradi Celsius, quindi impostare il regolatore di temperatura e creare una nuova piastra. Per la modalità positiva, controllare e sintonizzare il software che il metodo MS sia impostato con una temperatura capillare di 250 gradi Celsius e il livello RF dell'obiettivo S a 65,0. Nel software Xcalibur, aprire il metodo positivo e verificare che l'acquisizione MS a scansione completa sia impostata da zero a 1 minuto nell'intervallo da 550 a 1.000 m/z con risoluzione di 140.000 con controllo automatico del guadagno di 1 milione e tempo massimo di iniezione di 50 millisecondi.Applicare la massa di blocco di 680,48022. Verificare che il metodo di acquisizione MS/MS indipendente dai dati sia impostato tra l'intervallo di tempo di 1 e 5 minuti con una risoluzione di 17.500 con una prima massa fissa di 250 m/z. Verificare che il controllo automatico del guadagno per MS2 sia impostato a 100.000 e che venga utilizzato un tempo massimo di iniezione a 64 millisecondi, un'energia di collisione di 20 NCE, la finestra di isolamento a 1 m/z e che venga utilizzato un elenco di massa di inclusione da 398 a 1.100 m/z con un passo di massa di 1 Dalton.Per l'acquisizione in modalità negativa, verificare che il metodo MS sia impostato con la temperatura capillare a 250 gradi Celsius nel livello RF dell'obiettivo S a 65,0 nel file MS tune. Successivamente, nel software Xcalibur, verificare che la modalità di acquisizione a scansione completa sia impostata da zero a 1 minuto con una risoluzione di 140.000 che copre l'intervallo da 400 a 940 m / z, controllo automatico del guadagno di 1 milione, tempo massimo di iniezione di 200 millisecondi e una massa di blocco di 526,46262. Verificare che l'acquisizione MS2 in modalità DIA sia impostata tra 1 e 5 minuti di corsa con una risoluzione di 17.500 con una prima massa fissa di 150 m/z, controllo automatico del guadagno di 100.000, 64 millisecondi di tempo massimo di iniezione e 35 NCE di energia di collisione utilizzando l'elenco di massa di inclusione da 400 a 940 con un passo di massa di 1 Dalton.Creare la coda della sequenza di analisi nel software Xcalibur in modalità positiva e attivarla, quindi creare la sequenza nel software ChipSoft e avviare l'analisi in attesa che l'acquisizione del campione venga attivata da un segnale di chiusura del contatto proveniente dal robot di infusione diretta per ogni campione. Al termine dell'analisi in modalità positiva, creare la coda della sequenza di analisi nel software Xcalibur in modalità negativa e attivarla, quindi creare la sequenza nel software ChipSoft e avviare l'analisi in attesa che l'acquisizione del campione venga attivata da un segnale di chiusura del contatto proveniente dal robot di infusione diretta per ciascun campione. La concentrazione lipidica totale normalizzata è stata identificata e quantificata dalle 14 classi lipidiche più abbondanti, che era leggermente elevata per le classi lipidiche PE, PEO, PC, PCO, PI e PG e una certa regolazione verso il basso è stata osservata per i lipidi SM, LPE e PA.Mentre nessuna differenza poteva essere vista per TAG e PS. Questi risultati mostrano anche che, tra le caratteristiche molecolari basate sulla formula molecolare totale, da 100 a 120 composti sono stati significativamente influenzati dall'esposizione al fumo di sigaretta. La deconvoluzione della frammentazione MS2 e la normalizzazione delle intensità del segnale del frammento hanno permesso la definizione approssimativa della quantità totale di ciascun acido grasso coniugato rappresentato in ciascun vetro lipidico e il confronto di questi dati tra gruppi esposti e gruppi di controllo. È stata osservata una diminuzione degli acidi grassi completamente saturi e di pochi acidi grassi insaturi, mentre gli acidi grassi polinsaturi nella composizione delle classi di fosfolipidi PC, PE e PG erano elevati nel gruppo del fumo di sigaretta per tutti i punti temporali.I casi estremi di PC e PG coniugati con acido eicosapentaenoico e docosaesaenoico sono stati rilevati esclusivamente nel gruppo di esposizione 3R4F CS. Il pipettaggio del campione e del campione QC deve essere eseguito con punte a banda bassa e per essere precisi, il che significa che le punte devono essere controllate tra ciascun campione. Il pipettaggio della soluzione standard interna è fondamentale e deve essere accurato.La soluzione di metanolo diclorometano da 1 a 1 deve essere maneggiata con cura e deve essere utilizzato un punte non plastificante per evitare di avere polimeri plastici nei campioni. Le punte devono essere cambiate tra ogni campione.

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