Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
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著者らは、研究チームに感謝し、特に、フィリップモリス国際研究所のPMI R&Dのバイオ研究およびエアロゾルチームの技術支援とサポートに感謝したいと思います。Ltd.、シンガポール、およびPMI R&D、Philip Morris Products S.A.、ヌーシャテル、スイス。著者らは、バイオバンキングを管理してくれたSam Ansariに感謝し、原稿の草稿を編集してくれたSindhoora Bhargavi Gopala Reddyの支援を認める。

すべての著者はフィリップモリスインターナショナルの従業員です。フィリップモリスインターナショナルは、このプロジェクトの唯一の資金源であり、スポンサーです。

タバコの煙(CS)は、肺癌、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの肺の慢性炎症性疾患の発症に関連する主要な危険因子として認識されています1。肺への影響を超えて、CS曝露は、アテローム硬化性冠動脈疾患や末梢血管疾患などの他の疾患の発症に重要な役割を果たします1。心血管疾患は、COPDとともに、それぞれ世界で1番目と3番目に多い死因です。毒物学的リスク評価アプローチは、歴史的にげっ歯類などの動物モデルの使用に依存してきました。 in vivo 鼻のみまたは全身ラットおよびマウスモデルは、CSへの曝露の長期的影響を研究するために一般的に使用されます。
たとえば、一般に、6か月の煙曝露は、肺気腫、気道リモデリング、肺高血圧症などの人間の病気の異常を模倣するマウス肺の組織学的および機能的異常を誘発しますが、その変化は長期の人間の喫煙者で観察されたものと比較して比較的軽度です2。動物と人間の両方の組織で、酸化ストレス反応、炎症、構造組織の変化など、CS曝露に応答する幅広い分子変化が研究によって観察されています3,4。当然のことながら、CS曝露は、界面活性剤脂質、脂質シグナル伝達メディエーター、および構造脂質への影響を含む、肺リピドームに広範囲にわたる影響を与えることも報告されています4、5、6。
マウス肺の長期CS曝露によって誘発されるバルク脂質変化を特徴付けるために、我々は迅速かつ定量的なショットガン直接注入質量分析分析を行った。2005年にショットガンリピドミクス法が導入されて以来7、この方法は、酵母11、カエノラブディティスエレガンス12、ショウジョウバエメラノガスター13などのモデル系、および細胞株14などの幅広い哺乳類サンプルタイプで、脂質細胞代謝8,9,10に関する知識を拡張するために効果的に使用されてきました。 15、16種々のヒト17、18およびげっ歯類組織19、20および体液21、22。
過去数十年にわたって、研究は、何千もの相互接続されたタンパク質、脂質、および代謝物を含む、環境変化に対する細胞応答の複雑さを明らかにしてきました。これにより、分子機構の詳細なビューを取得し、外因性の生理学的影響の全規模を明らかにするには、最先端の分析技術を使用することが不可欠であることが明らかになりました。これに関連して、ショットガンリピドミクスアプローチによって生成された包括的で定量的な脂質フィンガープリントは、脂質細胞代謝に関する知識を効果的に追加することができます8,9,10。
いくつかの疾患の危険因子としてのCS曝露に関して、毒物学的リスク評価アプローチは歴史的にげっ歯類などの動物モデルの使用に依存してきました。ショットガンリピドミクスMSは、さまざまなサンプルタイプのリピドーム摂動を評価するための、高速で高感度の定量分析ツールを提供します。ショットガンリピドミクスのユニークな特徴は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ナノスプレー23を生成する導電性ナノチップを使用して、クロマトグラフィー分離なしで、標識された内部標準を添加した全脂質抽出物を高分解能MS装置に自動直接注入分析することです。
MS1モードで同時に取得される質量電荷比情報は、すべての無傷の内因性脂質の総脂質フットプリントを提供します。オプションで、親脂質分子を断片化して分析するMS2/MS3モードは、追加の構造情報を提供します。データ解析には特殊なソフトウェアが必要であり、脂質同定と推定化学構造の解明につながるプールスペクトルのスペクトルのデコンボリューションとピーク割り当てが含まれます。さらに、絶対定量は、目的の脂質クラスごとに少なくとも1つの脂質標準物質を含む標識内部標準混合物をスパイクすることによって行うことができる。全体として、本技術では、サンプルあたり数分かかるMS分析は、げっ歯類組織における14の脂質クラス24 から最大800の脂質の同定および定量をカバーできる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

脂質は、すべての原核細胞および真核細胞の必須成分として重要な役割を果たしています。質量分析の絶え間ない技術的進歩により、リピドミクスは、恒常性および疾患状態における組織リピドーム組成をモニタリングするための強力な分析ツールになりました。この論文では、さまざまな組織および生体液サンプル中の数百の分子脂質種の同時検出と定量をハイスループットでサポートするショットガン脂質分析方法のステップバイステップのプロトコルを提示します。この方法は、クロマトグラフィー分離なしで標識された内部標準を添加した総脂質抽出物を高分解能質量分析装置に自動ナノフロー直接注入します。齧歯動物組織のサブマイクログラム量から始めて、MS分析はサンプルあたり10分かかり、マウス肺組織の14の脂質クラスから最大400の脂質をカバーします。ここで紹介する方法は、疾患メカニズムを研究し、げっ歯類組織内の初期の毒性または有益な効果を示すバイオマーカーを特定および定量化するのに適しています。

ここでは、代表的な結果として、ショットガンリピドミクスを使用してマウスの肺に対するCSの影響を研究する方法を示すデータを提示します。ショットガン脂質分析プロトコルは、2つのサンプルグループの比較分析のためのin vivo研究に成功しました:CSに曝露された9匹の雌Apoe-/-マウス(3R4Fグループ;ポジティブコントロール)から解剖された肺組織と、3か月で収集されたネガティブコントロールとして新鮮な空気条件下で維持された同数のマウス(偽グループ)。 4か月、および6か月の曝露時点。動物を濾過し、2°C±温度および55%±15%の湿度で新鮮な空気を調節し、ガンマ線照射ペレット飼料を与えた。光環境は1日あたり12時間に維持された。各ケージあたり最大8匹のマウスを飼育した。暴露処理用の3R4F参照紙巻きたばこをケンタッキー大学から購入し、28μgのニコチン/Lに相当する目標ばく露濃度の3R4F CSエアロゾル(総粒子状物質TPM/Lエアロゾル600μg)を生成した.CS フィリップスらによると、3R4F紙巻きたばこからの煙は30台のポートロータリー喫煙機を使用して製造されました27.カナダ保健省の集中喫煙プロトコルに基づいて、十分な曝露を提供するために、55 mLのパフ量、30秒ごとに1パフ、および通気孔の100%閉塞が3R4Fタバコに適用されました。研究デザインに関するすべての追加詳細は以前に報告されています27,28。
全体として、最も豊富な14の脂質クラスから~400の分子脂質種が同定され、定量されました(図3)。クラスあたりの正規化脂質濃度の合計は、PE、PEO、PC、PCO、PI、およびPG脂質クラスでわずかに上昇し、SM、LPE、およびPA脂質ではいくらかのダウンレギュレーションが観察されましたが(図3A)、TAGおよびPSでは差は見られませんでした。 興味深いことに、CS群におけるPCOおよびPEOプラズマローゲン脂質のレベルの上昇が炎症細胞で報告されています29。.プラズマローゲン脂質の細胞内機能の1つは抗酸化活性です。活性酸素(ROS)および窒素種(RNS)への曝露下で、ジアシルリン脂質と比較したプラズマローゲンの選択的酸化が報告された30。プラズマローゲンの化学構造におけるエニル-エーテル結合は、酸化ストレスに対するラジカル攻撃に敏感です31。ラジカル攻撃の主な生成物は、ヒドロキシル化エイコサテトラエン酸、2-モノアシルグリセロールリン脂質、ペンタデカノール、ギ酸、さまざまな鎖長のα-ヒドロキシアルデヒド、1-ホルミル-2-アラキドノイルグリセロリン脂質、およびリゾリン脂質です。
これらの結果は、全分子式に基づく分子特徴のうち、100〜120の化合物がCS曝露によって有意に影響されたことを示しています(図3D)。MS2フラグメンテーション情報の詳細なデコンボリューションとフラグメントシグナル強度の正規化により、各脂質クラスで表される各共役脂肪酸(FA)の総量のおおよその定義(図3E)と、曝露群と対照群の間でこれらのデータの比較が可能になりました。完全に飽和したFAと、主にリゾ脂質の文脈で、不飽和度がわずかのFAの両方で明らかな減少が観察されました。対照的に、PC、PE、およびPGリン脂質クラスの組成中の多価不飽和脂肪酸(PUFA)は、すべての時点でCS群で上昇しました。エイコサペンタン酸(EPA)およびドコサヘキサエン酸(DHA)と結合したPCおよびPGの極端な症例は、3R4F CS曝露群でのみ検出されました(図3E、赤色)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> 図1:ブラッドフォードアッセイにおけるサンプル分配のためのプレートレイアウト。 ブランクサンプルと標準サンプルは、列1〜3の3連に配置されます。不明なサンプルは、列 4 から 11 に重複して配置されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> 図2:ショットガン質量分析用の96ウェルマイクロタイタープレートのプレートレイアウト。 正イオン化モードで取得するためのブランク、標準、未知、およびQCサンプルの分布は、プレートの左側(列1〜6)にマッピングされています。負イオン化モードのすべてのサンプルは右側に配置されます(列7〜12)。略語:pos =ポジティブ。QC =品質管理;neg = 負;TB = 合計ブランク。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> 図3:タバコの煙にさらされたマウス肺のショットガンリピドミクス分析。 Apoe−/− マウスを、3R4F基準タバコまたは新鮮な空気(偽)からのCSに曝露した。(A)脂質クラス濃度とクラスあたりの脂質種の数。各クラスについて、定量化された脂質種の数が括弧内に示されている。各脂質クラスの平均および95%信頼区間、ばく露タイプごとに個別(3つの時点にわたって集計)。(B)3つの時点での3R4F CSと偽の比較について、定量化された脂質種の効果サイズ(log2倍変化)と有意性(-log10FDR調整p値)を示す火山プロット。著しく上昇した脂質は黄色でマークされています。有意に減少した脂質はシアンでマークされています(FDR調整p値<0.05)。(C)絶対平均倍率が最大の25種の差の存在量の変化。3R4F CSと偽の比較のLog2倍の変化は色分けされており、統計的有意性が示されています:*:FDR調整されたp値<0.01;X:FDR調整されたp値は0.05<。(D)比較プロット。フォールド変化比較の相関係数を色分けし、共有差的に豊富な脂質の数を示します(余白の総数)。円グラフは、同じ変化方向(FC記号)を持つ共有差的に豊富な脂質の割合を示しています。アスタリスクは、差次的に豊富な脂質の有意な重複を示す。(E)脂質クラスごとのコンジュゲートFAの存在量の差。3つの時点すべてで3R4Fと偽曝露の間に有意な存在量差がある共役脂肪酸のパネル C のようなヒートマップ(FDR調整p値<0.05)。脂質クラスあたりの各脂肪酸の量は、脂肪酸フラグメントのMS2強度に基づいて推定されました。略語:CS =タバコの煙;FDR =偽発見率。FC =フォールド変更。FA =脂肪酸;PC =ホスファチジルコリン;PS =ホスファチジルセリン;タグ=トリアシルグリセロール;SM =スフィンゴミエリン;PEO =プラズマローゲンホスファチジルエタノールアミン;PE =ホスファチジルエタノールアミン;PG =ホスファチジルグリセロール;PI =ホスファチジルイノシトール;DAG =ジアシルグリセロール;SE =ステロール/コレステリルエステル;PCO =プラズマローゲンホスファチジルコリン;LPC = リゾホスファチジルコリン;LPE =リゾホスファチジルエタノールアミン;PA =ホスファチジン酸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSAの最終濃度 (mg/mL)</td>
			<td>2 mg/mL (μL) の BSA 溶液</td>
			<td>炭酸水素アンモニウムバッファー (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>0.125 mg/mL 溶液 50 個</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>表1:ブラッドフォードアッセイの検量線のためのBSA内部標準の希釈スキーム。 略称:BSA =ウシ血清アルブミン。
補足情報:脂質Xplorer脂質同定に使用されるMFQLファイル。 .zipパッケージは、個々の必要な MFQL ファイルで構成され、それぞれが次のパターンに従って名前が付けられています: <脂質クラスの省略形>_<イオン化モード>_MS2.mfql (例: PE_neg_MS2.mfql)。標識された内部標準識別用のファイル名には、<脂質の略語>のD7(D9)タグが含まれます(例:PED7_neg_MS2.mfql)。これらのMFQLファイルは、内部標準中の重水素の量を検証するために使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Shotgun 質量分析ベースのリピドミクスは、さまざまなげっ歯類組織からの 1 回の測定で、幅広い脂質クラスの高感度定量スナップショットを同時に提供します。

げっ歯類組織のショットガンリピドミクス

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

提示されたプロトコルは、動物組織中の広範囲の脂質を定量することを可能にする。これは、脂質メカニズムを研究し、動物モデルにおける初期毒性を示すバイオマーカーを特定するための簡単なツールです。この方法は、サンプルあたり10分のトレンド時間で、さまざまなサンプルマトリックスで14の異なる脂質クラスで400を超える分子脂質の定量プロファイルを提供します。まず、遠心分離機アリコート1上清を重炭酸アンモニウム緩衝液で濃度の2倍に希釈します。ウシ血清アルブミン検量線を調製した後、標準チューブをボルテックスし、チューブを18、200gで室温で15秒間遠心分離する。前に準備した標準チューブから、ブランク、標準、サンプルをそれぞれ6マイクロリットルを96ウェル平底プレートに移します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して250マイクロリットルのブラッドフォード試薬を各ウェルに加え、混合します。5分間インキュベートした後、プレートリーダーを用いて波長595ナノメートルの吸光度を測定する。総ブランクと内部標準ブランクの各チューブに100マイクロリットルの重炭酸アンモニウム溶液を入れた2ミリリットルのチューブを準備し、すべてのサンプルを氷上に保ちます。10サンプルの各セットの間に1つの品質管理サンプルが配置されていることを考慮して、品質管理サンプルを準備します。10マイクロリットルのプールヒト血漿を2ミリリットルのチューブに加え、10マイクロリットルの内部標準溶液をすべての内部標準ブランク、品質管理、および研究サンプルにスパイクします。各サンプルに摂氏マイナス20度のブタノールメタノール混合物300マイクロリットルを加え、サーモミキサーで室温で10分間450 gで振とうします。次に、300マイクロリットルのヘプタン酢酸エチル混合物を加え、サーモミキサー上で室温で10分間450gで振とうし、次に300マイクロリットルの1%禁欲酸混合物を加え、サーモミキサー上で室温で450gで5分間振とうする。室温で5分間2, 800gで遠心分離し、360マイクロリットルの上相を2とラベル付けされた新しい2ミリリットルのセルフロックチューブに移す。320マイクロリットルのヘプタン酢酸エチルを1とラベル付けした水相管に加えた後、サーモミキサー上で室温で450gで5分間振とうし、次に2,800gで室温で5分間遠心分離する。320マイクロリットルの上相を移し、それらをチューブ2の前のステップからの画分と混ぜ合わせる。同様に、チューブ1の水相に250マイクロリットルのヘプタン酢酸エチルを加え、サーモミキサーで室温で450gで5分間振とうします。再び、室温で5分間2, 800gで遠心分離し、次いで200マイクロリットルの上相を移し、それをチューブ2中の前のステップからの画分と混合する。真空濃縮器で摂氏35度で蒸発乾固し、300マイクロリットルのMS混合溶液に再溶解します。各チューブを5秒間ボルテックスしてすべてが溶解し、摂氏4度で5分間18, 200 gで遠心分離します。正イオン化モード分析のために50マイクロリットルのアリコートをマイクロリットルプレートに移し、50マイクロリットルのMSミックス溶液で希釈します。再度、80マイクロリットルのMSミックスで希釈し、20マイクロリットルのアリコートをMTPプレートに移して負イオン化モード分析を行います。プレートをホイルで包み、分析前に摂氏4度に保ちます。分析の5日以内に、製造元の指示に従って、ポジティブモードとネガティブモードの両方でMSを校正します。直接注入ナノソースを前もって取り付け、MSの移送キャピラリーと4.1マイクロメートルのノズルチップに対してチップホルダーに適切に位置合わせされていることを確認してから、ガス圧1.25psi、ソース電圧1.1キロボルト、5マイクロリットルのサンプル注入量に対応する正負の注入のパラメータを確認します。 接点閉鎖Rel1を2.5秒間、5分の納期、4°Cでプレート冷却してから、温度コントローラーをセットアップして新しいプレートを作成します。ポジティブモードの場合は、MSメソッドが毛細管温度250°C、SレンズRFレベル65.0に設定されていることをソフトウェアで確認および調整します。Xcalibur ソフトウェアで、ポジティブメソッドを開き、フルスキャン MS 取得が 100 万の自動ゲイン制御と 50 ミリ秒の最大射出時間で 140 , 000 の分解能で 550 〜 1 、 000 m/z の範囲で 0 分から 1 分に設定されていることを確認します。ロック質量680.48022を適用します。データに依存しないMS/MS取得方法が、17, 500の分解能で1〜5分の時間範囲で、最初の質量が250 m/zに固定されていることを確認します。MS2の自動ゲイン制御が100, 000に設定され、最大射出時間が64ミリ秒、衝突エネルギーが20 NCE、絶縁ウィンドウが1 m/zに設定され、398から1, 100 m/zの介在質量リストが1ダルトンの質量ステップで使用されていることを確認してください。ネガティブモードでのアクイジションでは、MSチューンファイルのSレンズRFレベル65.0でキャピラリー温度が摂氏250度に設定されていることをチューニングソフトウェアに確認してください。次に、Xcaliburソフトウェアで、フルスキャン取得モードが400〜940 m / zの範囲をカバーする140, 000の解像度で0〜1分に設定され、100万の自動ゲイン制御、200ミリ秒の最大射出時間、および526.46262のロック質量。DIAモードでのMS2取得が、1ダルトンの質量ステップで400〜940の介在質量リストを使用して、17, 500の分解能で17, 500、固定された最初の質量、100、000、64ミリ秒の最大射出時間、35 NCEの自動ゲイン制御で実行の1〜5分に設定されていることを確認してください。Xcaliburソフトウェアでポジティブモードで分析シーケンスキューを作成してトリガーし、ChipSoftソフトウェアでシーケンスを作成し、各サンプルの直接注入ロボットからのコンタクトクロージャ信号によってサンプル取得がトリガーされるのを待って分析を開始します。ポジティブモード分析が完了したら、Xcaliburソフトウェアでネガティブモードで分析シーケンスキューを作成してトリガーし、ChipSoftソフトウェアでシーケンスを作成し、各サンプルの直接注入ロボットからのコンタクトクロージャ信号によってサンプル取得がトリガーされるのを待って分析を開始します。正規化された総脂質濃度は、PE、PEO、PC、PCO、PI、およびPG脂質クラスでわずかに上昇し、SM、LPE、およびPA脂質でいくつかのダウンレギュレーションが観察された14の最も豊富な脂質クラスから同定および定量化されました。TAGとPSでは違いは見られませんでしたが。これらの結果はまた、全分子式に基づく分子特徴のうち、100〜120の化合物がタバコの煙曝露によって有意に影響されたことを示しています。MS2フラグメンテーションのデコンボリューションとフラグメントシグナル強度の正規化により、各脂質ガラスで表される各共役脂肪酸の総量のおおよその定義と、曝露群と対照群の間のこれらのデータの比較が可能になりました。完全飽和脂肪酸と少数の不飽和脂肪酸の減少が観察されたが、PC、PE、およびPGリン脂質クラスの組成中の多価不飽和脂肪酸は、すべての時点でタバコの煙群で上昇した。エイコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸を結合させたPCおよびPGの極端な症例は、3R4F CS曝露群でのみ検出されました。サンプルとQCサンプルのピペッティングは、ローバンドチップで正確である必要があり、各サンプル間でチップをチェックする必要があります。内部標準液のピペッティングは非常に重要であり、正確でなければなりません。1対1のジクロロメタンメタノールの溶液は注意して取り扱う必要があり、サンプルにプラスチックポリマーが含まれないように、チップを含む非可塑剤を使用する必要があります。ヒントは各サンプル間で変更する必要があります。

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Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

リーフ スプレー質量分析: 植物組織由来の代謝産物を直接評価するの急速な周囲のイオン化法

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

タンパク質レベルの組織や標準化された定量ウェスタンブロットによる開発全体の堅牢な比較

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...