Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
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저자는 연구팀에 감사를 표하고 특히 PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., 싱가포르 및 PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Switzerland. 저자는 바이오뱅킹을 관리해 준 Sam Ansari에게 감사를 표하고 원고 초안을 편집한 Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy의 지원에 감사드립니다.

모든 저자는 필립 모리스 인터내셔널의 직원입니다. 필립 모리스 인터내셔널(Philip Morris International)은 이 프로젝트의 유일한 자금원이자 후원자입니다.

담배 연기(CS)는 폐암, 기관지염 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 폐의 만성 염증성 질환 발병과 관련된 주요 위험 요소로 인식되고 있습니다1. CS 노출은 폐 충격 외에도 죽상동맥경화성 관상동맥 질환 및 말초혈관 질환과 같은 다른 질병의 발병에 중요한 역할을 한다1. 심혈관 질환은 COPD와 함께 전 세계적으로 각각 첫 번째와 세 번째 주요 사망 원인입니다. 독성 학적 위험 평가 접근법은 역사적으로 설치류와 같은 동물 모델의 사용에 의존 해 왔습니다. 생체 내 코 전용 또는 전신 쥐 및 마우스 모델은 일반적으로 CS 노출의 장기적인 영향을 연구하는 데 사용됩니다.
예를 들어, 일반적으로 6개월 동안 연기에 노출되면 폐기종, 기도 리모델링, 폐고혈압 등 인간 질환과 유사한 조직학적 및 기능적 이상이 쥐 폐에 나타나지만, 그 변화는 장기간 흡연자에게서 관찰되는 것에 비해 상대적으로 경미하다2. 동물 조직과 인간 조직 모두에서 산화 스트레스 반응, 염증 및 구조적 조직 변화를 포함하여 CS 노출에 대한 광범위한 분자 변화가 관찰되었습니다 3,4. 놀랍지 않게도, CS 노출은 계면활성제 지질, 지질 신호 매개체 및 구조적 지질에 대한 효과를 포함하여 폐 지질체에 광범위한 영향을 미치는 것으로 보고되었다 4,5,6.
마우스 폐의 장기간 CS 노출에 의해 유도된 대량 지질 변화를 특성화하기 위해 빠르고 정량적인 산탄총 직접 주입 질량 분석 분석을 수행했습니다. 2005년 산탄총 지질체학(shotgun lipidomics)분석법이 도입된 후 7, 이 방법은 효모 11, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)12, 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)13와 같은 모델 시스템뿐만 아니라 세포주(14)와 같은 광범위한 포유류 시료 유형에서 지질 세포 대사 8,9,10에 대한 지식을 확장하는 데 효과적으로 사용되었습니다. 15,16 다양한 인간17,18 및 설치류 조직19,20 및 체액21,22.
지난 수십 년 동안 연구에 따르면 수천 개의 상호 연결된 단백질, 지질 및 대사 산물을 포함하는 환경 변화에 대한 세포 반응의 복잡성이 밝혀졌습니다. 이를 통해 최첨단 분석 기술을 사용하는 것이 분자 기계에 대한 심층적인 관점을 얻고 외인성 생리학적 영향의 전체 규모를 밝히는 데 필수적이라는 것이 분명해졌습니다. 이러한 맥락에서, 샷건 지질체학 접근법에 의해 생성된 포괄적이고 정량적인 지질 지문은 지질 세포 대사에 대한 우리의 지식을 효과적으로 추가할 수 있습니다 8,9,10.
CS 노출을 여러 질병의 위험 요소로 간주하여 독성 학적 위험 평가 접근법은 역사적으로 설치류와 같은 동물 모델의 사용에 의존 해 왔습니다. Shotgun 지질체학 MS는 다양한 샘플 유형에서 지질체 섭동을 평가하기 위한 빠르고 민감한 정량적 분석 도구를 제공합니다. 샷건 지질체학의 고유한 특징은 전기분무 이온화(ESI) 나노스프레이(23)를 생성하는 전도성 나노칩을 사용하여 크로마토그래피 분리 없이 표지된 내부 표준물질로 스파이크된 총 지질 추출물을 고분해능 MS 기기로 분리하는 자동 직접 주입 분석입니다.
MS1 모드에서 동시에 획득되는 질량 대 전하 비율 정보는 모든 온전한 내인성 지질의 총 지질 풋프린트를 제공합니다. 선택적으로 모 지질 분자가 단편화되고 분석되는 MS2/MS3 모드는 추가 구조 정보를 제공합니다. 데이터 분석에는 특수 소프트웨어가 필요하며, 지질 식별 및 추정 화학 구조 설명으로 이어지는 풀링된 스펙트럼의 스펙트럼 및 피크 할당의 디콘볼루션이 포함됩니다. 추가로, 절대 정량화는 관심 있는 지질 클래스 당 적어도 하나의 지질 표준물질을 함유하는 표지된 내부 표준물질 혼합물을 스파이크함으로써 수행될 수 있다. 전반적으로, 본 기술로, 샘플당 몇 분이 걸리는 MS 분석은 설치류 조직에서 14개의 지질 부류(24 )로부터 최대 800개의 지질의 식별 및 정량화를 커버할 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

지질은 모든 원핵 및 진핵 세포의 필수 구성 요소로서 중요한 역할을 합니다. 질량 분석법의 지속적인 기술 향상으로 인해 지질체는 항상성 및 질병 상태에서 조직 지질체 구성을 모니터링하기 위한 강력한 분석 도구가 되었습니다. 이 논문은 높은 처리량으로 다양한 조직 및 생체 유체 샘플에서 수백 개의 분자 지질 종을 동시에 검출하고 정량화할 수 있도록 지원하는 샷건 지질 분석 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 크로마토그래피 분리 없이 표지된 내부 표준물질로 스파이크된 총 지질 추출물을 고분해능 질량 분석 기기에 자동으로 나노 플로우 직접 주입하는 방법을 활용합니다. 마이크로그램 미만의 설치류 조직에서 시작하여 MS 분석은 샘플당 10분이 소요되며 마우스 폐 조직의 14개 지질 클래스에서 최대 400개의 지질을 다룹니다. 여기에 제시된 방법은 질병 메커니즘을 연구하고 설치류 조직 내에서 초기 독성 또는 유익한 효과를 나타내는 바이오마커를 식별 및 정량화하는 데 매우 적합합니다.

여기에서는 대표적인 결과로 산탄총 지질체가 생쥐의 폐에 대한 CS의 영향을 연구하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 데이터를 제시합니다. 산탄총 지질 분석 프로토콜은 두 그룹의 샘플에 대한 비교 분석을 위한 생체 내 연구에 성공적으로 적용되었습니다: CS에 노출된 9마리의 암컷 Apoe-/- 마우스(3R4F 그룹, 양성 대조군)에서 해부된 폐 조직 및 신선한 공기 조건에서 유지된 동일한 수의 마우스(가짜 그룹) 3개월에 수집된 음성 대조군으로, 4개월 및 6개월 노출 시점. 동물을 22°C ± 2°C 온도 및 55% ± 15% 습도에서 여과하고 컨디셔닝된 신선한 공기 하에 유지하고, 감마선-조사된 펠릿 사료를 먹였다. 조명 체제는 하루 12 시간으로 유지되었습니다. 각 케이지 당 최대 8 마리의 마우스를 수용했습니다. 3R4F 담배의 3R4F 담배에서 3R4F 연기는 28 μg의 니코틴/.CS L에 해당하는 목표 노출 농도에 대해 3R4F CS 에어로졸(총 미립자 물질 TPM/L 에어로졸 600μg)을 생성하기 위해 켄터키 대학교에서 구입되었습니다.27 Phillips et al.27에 따르면 30 포트 회전식 흡연 기계를 사용하여 30 포트 회전식 흡연 기계를 사용하여 연기 . 캐나다 보건부 집중 흡연 프로토콜에 따라 3R4F 담배에 55mL의 퍼프 부피, 30초당 1개의 퍼프, 100% 막힌 통풍구를 적용하여 충분한 노출을 제공했습니다. 연구 설계에 대한 모든 추가 세부 사항은 이전에 보고되었습니다27,28.
전반적으로, 가장 풍부한 14개의 지질 부류에서 ~400개의 분자 지질 종을 식별하고 정량화했습니다(그림 3). 클래스당 총 정규화된 지질 농도는 PE, PEO, PC, PCO, PI 및 PG 지질 클래스에 대해 약간 상승했으며 SM, LPE 및 PA 지질에 대해 일부 하향 조절이 관찰되었지만(그림 3A), TAG 및 PS에 대해서는 차이가 없었습니다. 흥미롭게도 CS 그룹에서 PCO 및 PEO 플라스말로겐 지질 수치가 염증 세포에서 보고되었습니다29 . 플라스말로겐 지질의 세포 내 기능 중 하나는 항산화 활성입니다. 활성 산소(ROS) 및 질소종(RNS)에 노출된 상태에서 디아실 인지질과 비교하여 플라스말로겐의 선택적 산화가 보고되었습니다30. 플라스말로겐의 화학 구조에서 에닐-에테르 결합은 산화 스트레스31에 대한 라디칼 공격에 민감합니다. 라디칼 공격의 주요 생성물은 하이드록실화 에이코사테트라엔산, 2-모노아실글리세롤 인지질, 펜타데칸올, 포름산, 다양한 사슬 길이의 α-하이드록시알데히드, 1-포르밀-2-아라키도노일 글리세로인지질 및 리소인지질입니다.
이러한 결과는 전체 분자식에 기초한 분자 특징 중 100-120개의 화합물이 CS 노출에 의해 유의한 영향을 받았음을 보여줍니다(그림 3D). MS2 단편화 정보의 상세한 디콘볼루션과 단편 신호 강도의 정규화를 통해 각 지질 등급에 표시되는 각 공액 지방산(FA)의 총량을 대략적으로 정의하고(그림 3E) 노출된 그룹과 대조군 간의 이러한 데이터를 비교할 수 있었습니다. 완전히 포화된 FA와 불포화도가 거의 없는 FA 모두에서 뚜렷한 감소가 관찰되었으며, 대부분 리소-지질의 맥락에서 관찰되었습니다. 대조적으로, PC, PE 및 PG 인지질 부류의 조성 중의 고도불포화 지방산 (PUFA)은 모든 시점에 대해 CS 그룹에서 상승하였다. 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA)과 결합된 PC 및 PG의 극단적인 경우는 3R4F CS 노출 그룹에서만 독점적으로 검출되었습니다(그림 3E, 빨간색).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> 그림 1: Bradford 분석에서 샘플 분포를 위한 플레이트 레이아웃. 블랭크 및 표준 샘플은 컬럼 1-3에 세 번 배치됩니다. 알 수 없는 샘플은 4-11열에 이중으로 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> 그림 2: 샷건 질량분석법 분석을 위한 96웰 마이크로타이터 플레이트의 플레이트 레이아웃. 양의 이온화 모드에서 수집을 위한 블랭크, 표준, 미지의 및 QC 샘플의 분포는 플레이트의 왼쪽에 매핑됩니다(컬럼 1-6). 음이온화 모드에 대한 모든 샘플은 오른쪽에 배치됩니다(컬럼 7-12). 약어: pos = positive; QC = 품질 관리; 부정 = 음수; TB = 공백 상태 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> 그림 3: 담배 연기에 노출된 쥐 폐의 산탄총 지질학 분석. Apoe-/- 마우스는 3R4F 기준 담배 또는 신선한 공기(가짜)로부터 CS에 노출되었습니다. (A) 지질 등급 농도 및 등급당 지질 종의 수. 각 클래스에 대해 정량화 된 지질 종의 수는 괄호 안에 표시됩니다. 각 지질 등급에 대한 평균 및 95% 신뢰 구간, 각 노출 유형에 대해 별도로(3개의 시점에 걸쳐 집계됨). (B) 세 시점에서 3R4F CS 대 가짜 비교에 대한 정량화된 지질 종의 효과 크기(log2 배수 변화) 및 유의성(-log10 FDR 조정 p 값)을 보여주는 화산 플롯. 현저하게 상승 된 지질은 노란색으로 표시됩니다. 현저히 감소된 지질은 청록색으로 표시된다(FDR-adjusted p value < 0.05). (C) 절대 평균 배수 변화가 가장 큰 25개 지질 종의 차등 풍부도. 3R4F CS 대 가짜 비교를 위한 Log2 배수 변화는 색상으로 구분되며 통계적 유의성이 표시됩니다: *: FDR 조정 p 값 < 0.01; X: FDR-조정된 p 값 < 0.05. (D) 비교 플롯. 폴드-변화 비교를 위한 상관 계수는 색상으로 구분되며, 차등적으로 풍부한 공유 지질의 수가 표시됩니다(여백의 총 수). 파이 차트는 동일한 변화 방향(FC 부호)을 가진 공유된 차등적으로 풍부한 지질의 백분율을 보여줍니다. 별표는 차등적으로 풍부한 지질의 현저한 중첩을 나타낸다. (E) 지질 등급당 복합 FA의 차등 풍부도. 세 시점 모두에서 3R4F와 가짜 노출 사이에 상당한 존재비 차이가 있는 공액 지방산에 대한 패널 C 에서와 같은 히트맵(FDR 조정 p 값 < 0.05). 지질 부류당 각각의 지방산의 양은 지방산 단편의 MS2 강도에 기초하여 추정하였다. 약어: CS = 담배 연기; FDR = 거짓 발견률; FC = 배수 변화; FA = 지방산; PC = 포스파티딜콜린; PS = 포스파티딜세린; TAG = 트리아실글리세롤; SM = 스핑고미엘린; PEO = 플라스말로겐 포스파티딜에탄올아민; PE = 포스파티딜에탄올아민; PG = 포스파티딜글리세롤; PI = 포스파티딜이노시톨; DAG = 디아실글리세롤; SE = 스테롤/콜레스테릴 에스테르; PCO = 플라스말로겐 포스파티딜콜린; LPC = 리소포스파티딜콜린; LPE = 리소포스파티딜에탄올아민; PA = 포스파티드산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA 최종 농도(mg/mL)</td>
			<td>2mg/mL(μL)의 BSA 용액</td>
			<td>중탄산암모늄 완충액(μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 of 0.125 mg/mL 용액</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>표 1: Bradford 분석에 대한 보정 곡선에 대한 BSA 내부 표준물질의 희석 계획. 약어: BSA = 소 혈청 알부민.
보충 정보: LipidXplorer 지질 식별에 사용되는 MFQL 파일. .zip 패키지는 필요한 개별 MFQL 파일로 구성되며, 각 파일의 이름은 <lipid class abbreviation>_<ionization mode>_MS2.mfql(예: PE_neg_MS2.mfql) 패턴에 따라 지정됩니다. 레이블이 지정된 내부 표준물질 식별을 위한 파일 이름에는 <lipid 약어>의 D7(D9) 태그(예: PED7_neg_MS2.mfql)가 포함됩니다. 이 MFQL 파일은 내부 표준에서 중수소의 양을 확인하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Shotgun 질량분석법 기반 지질체학은 다양한 설치류 조직에서 한 번의 측정으로 광범위한 지질 등급에 대한 민감한 정량적 스냅샷을 동시에 제공합니다.

설치류 조직의 산탄총 지질체

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

제시된 프로토콜은 동물 조직에서 광범위한 지질을 정량화할 수 있게 한다. 지질 메커니즘을 연구하고 동물 모델에서 초기 독성을 나타내는 바이오마커를 식별하는 쉬운 도구입니다. 이 방법은 샘플당 10분의 추세 시간으로 다양한 샘플 매트릭스에서 14개의 서로 다른 지질 클래스에 있는 400개 이상의 분자 지질에 대한 정량적 프로필을 제공합니다.시작하려면 원심분리기 분취액 1 상청액을 농도의 2배로 중탄산암모늄 완충액으로 희석합니다. 소혈청알부민 표준곡선을 준비한 후, 표준관을 18, 200 g에서 상온에서 15초 동안 원심분리하여 관을 vortex하였다. 이전에 준비한 표준 튜브에서 블랭크, 표준물질 및 시료 각각 6마이크로리터를 96웰 평평한 바닥 플레이트로 옮깁니다.다음으로, 250 마이크로리터의 브래드포드 시약을 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 첨가하고 혼합한다. 5분 동안 배양한 후 플레이트 리더를 이용하여 595 나노미터 파장에서 흡광도를 측정하였다. 100 마이크로 리터의 중탄산 암모늄 용액이 들어있는 2 밀리리터 튜브를 전체 블랭크 및 내부 표준 블랭크의 각 튜브에 준비하고 모든 샘플을 얼음에 보관하십시오.10개의 샘플 세트 사이에 하나의 품질 관리 샘플이 배치되는 것을 고려하여 품질 관리 샘플을 준비합니다. 10 마이크로 리터의 풀링 된 인간 혈장을 2 밀리리터 튜브에 추가 한 다음 10 마이크로 리터의 내부 표준 용액을 모든 내부 표준 블랭크, 품질 관리 및 연구 샘플에 스파이크합니다. 섭씨 영하 20도 부탄올 메탄올 혼합물 300 마이크로 리터를 각 시료에 넣고 써모 믹서에서 실온에서 10 분 동안 450g에서 흔들어줍니다.다음으로, 헵탄 에틸 아세테이트 혼합물 300 마이크로 리터를 첨가하고, 써모 믹서 상에서 실온에서 10 분 동안 450 g에서 흔들어 준 다음, 1 % 고행산 혼합물 300 마이크로 리터를 첨가하고, 써모 믹서 상에서 실온에서 450 g에서 5 분 동안 흔들어. 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리하고 상부 상 360 마이크로 리터를 2로 표시된 새로운 2 밀리리터 자동 잠금 튜브로 옮깁니다. 320 μL의 헵탄 에틸 아세테이트를 1로 표시된 수상 튜브에 첨가 한 후, 열 혼합기에서 실온에서 5 분 동안 450 g에서 흔들어 준 다음, 이전에 입증 된대로 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리한다.상부 상 320 마이크로리터를 옮기고 튜브 2에서 이전 단계의 분획과 결합합니다. 유사하게, 250 마이크로 리터의 헵탄 에틸 아세테이트를 튜브 1의 수상에 첨가하고 열 혼합기에서 실온에서 5 분 동안 450g에서 흔들어줍니다. 다시, 실온에서 5 분 동안 2, 800 g에서 원심 분리 한 다음, 상부 상 200 마이크로 리터를 옮기고 튜브 2의 이전 단계의 분획과 결합시킨다.진공 농축기에서 섭씨 35도에서 증발시켜 건조시키고 300마이크로리터의 MS 혼합 용액에 다시 용해합니다. 모든 것이 용해되도록 각 튜브를 5 초 동안 소용돌이 치고 섭씨 4도에서 5 분 동안 18, 200g에서 원심 분리합니다. 양성 이온화 모드 분석을 위해 50마이크로리터의 분취량을 마이크로리터 플레이트에 옮기고 50마이크로리터의 MS 혼합 용액으로 희석합니다.다시, 80 마이크로리터의 MS 믹스로 희석하고 음이온화 모드 분석을 위해 20 마이크로리터의 분취량을 MTP 플레이트에 옮긴다. 플레이트를 호일로 감싸고 분석 전에 섭씨 4도를 유지하십시오. 분석 전 5일 이내에 제조업체의 지침에 따라 양성 및 음성 모드 모두에서 MS를 보정합니다.직접 주입 나노 소스를 미리 설치하여 MS의 이송 모세관과 칩 홀더에 4.1마이크로미터 노즐 칩이 제대로 정렬되었는지 확인한 다음 1.25psi의 가스 압력, 1.1킬로볼트의 소스 전압, 5마이크로리터의 샘플 주입 부피에 해당하는 양극 및 음극 주입 매개변수를 확인합니다. 출력 접점 폐쇄 Rel1 2.5초, 배달 시간 5분, 플레이트 냉각 섭씨 4도, 온도 컨트롤러를 설정하고 새 플레이트를 만듭니다. 포지티브 모드의 경우 MS 분석법이 모세관 온도가 섭씨 250도이고 S 렌즈 RF 레벨이 65.0으로 설정되어 있는지 소프트웨어를 확인하고 조정합니다. Xcalibur 소프트웨어에서 포지티브 방법을 열고 140, 000 해상도에서 550에서 1, 000 m/z 범위에서 0분에서 1분까지 0분에서 1분까지 전체 스캔 MS 획득이 설정되어 있는지 확인하고 100만 개의 자동 게인 제어 및 50밀리초의 최대 주입 시간을 제공합니다.680.48022의 잠금 질량을 적용합니다. 데이터 독립적인 MS/MS 수집 분석법이 250 m/z의 고정된 첫 번째 질량으로 17, 500 분해능에서 1분과 5분 시간 범위 사이에 설정되어 있는지 확인하십시오. MS2에 대한 자동 이득 제어가 100, 000, 최대 주입 시간 64 밀리 초, 충돌 에너지 20 NCE, 절연 창 1 m / z, 포함 질량 목록 398에서 1, 100 m / z가 1 Dalton의 질량 단계로 사용되는지 확인하십시오.네거티브 모드에서 획득하는 경우, MS 분석법이 MS tune 파일에서 65.0의 S-렌즈 RF 레벨에서 섭씨 250도의 모세관 온도로 설정되어 있는지 튜닝 소프트웨어를 체크인합니다. 다음으로, Xcalibur 소프트웨어에서 전체 스캔 획득 모드가 400 - 940 m/z 범위를 포괄하는 140, 000 해상도에서 0분에서 1분까지, 100만 개의 자동 게인 제어, 200밀리초의 최대 주입 시간 및 526.46262의 잠금 질량으로 설정되어 있는지 확인합니다. DIA 모드에서의 MS2 획득이 150 m/z의 고정된 첫 번째 질량, 100, 000, 64 밀리초의 최대 주입 시간 및 35 NCE의 최대 주입 시간의 자동 이득 제어, 1 Dalton의 질량 스텝으로 400에서 940까지의 포함 질량 목록을 사용하여 17, 500의 분해능에서 실행 1분에서 5분 사이에 설정되었는지 확인합니다.포지티브 모드에서 Xcalibur 소프트웨어에서 분석 시퀀스 대기열을 생성하고 트리거한 다음 ChipSoft 소프트웨어에서 시퀀스를 생성하고 각 샘플에 대해 직접 주입 로봇에서 오는 접촉 폐쇄 신호에 의해 샘플 수집이 트리거될 때까지 기다리는 동안 분석을 시작합니다. 포지티브 모드 분석이 완료되면 네거티브 모드에서 Xcalibur 소프트웨어에서 분석 시퀀스 대기열을 생성하고 트리거한 다음 ChipSoft 소프트웨어에서 시퀀스를 생성하고 각 샘플에 대해 직접 주입 로봇에서 오는 접촉 폐쇄 신호에 의해 샘플 수집이 트리거될 때까지 기다리는 동안 분석을 시작합니다. 총 정규화된 지질 농도는 PE, PEO, PC, PCO, PI 및 PG 지질 클래스에 대해 약간 상승된 14개의 가장 풍부한 지질 클래스로부터 확인 및 정량화되었으며 SM, LPE 및 PA 지질에 대해 일부 하향 조절이 관찰되었습니다.TAG와 PS에서는 차이가 없습니다. 이러한 결과는 또한 전체 분자식에 기초한 분자 특징 중 100 내지 120 화합물이 담배 연기 노출에 의해 유의하게 영향을 받았다는 것을 보여준다. MS2 단편화의 디콘볼루션과 단편 신호 강도의 정규화를 통해 각 지질 유리에 표시된 각 공액 지방산의 총량을 대략적으로 정의하고 노출군과 대조군 간의 이러한 데이터를 비교할 수 있었습니다. 완전 포화 및 소수의 불포화 지방산의 감소가 관찰된 반면, PC, PE 및 PG 인지질 부류의 조성에서 고도불포화 지방산은 모든 시점에서 담배 연기 그룹에서 상승했습니다.에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산과 결합된 PC 및 PG의 극단적인 경우는 3R4F CS 노출군에서만 검출되었습니다. 시료 및 QC 시료의 피펫팅은 저대역 팁으로 수행되어야 하며 정확해야 하며, 이는 각 시료 사이에서 팁을 확인해야 함을 의미합니다. 내부 표준물질 용액의 피펫팅은 매우 중요하며 정확해야 합니다.1 내지 1 디클로로메탄 메탄올의 용액은 주의해서 다루어야 하며, 샘플에 플라스틱 폴리머가 포함되지 않도록 팁을 함유한 비가소제를 사용해야 합니다. 팁은 각 샘플 간에 변경되어야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

연구

생화학

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

산탄 프로테오믹스 자세하게 특성화 LERLIC-MS / MS 및 글루타민 정량 아스파라긴 탈 아미드

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

세포 외 단백질 Microarray 기술은 낮은 친 화력 수용 체 Ligand 상호 작용의 높은 처리량 검색

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

세포와 조직에서 코엔자임 A의 정량화

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

포유류 조직과 콜레스테롤을 함유한 제노푸스 우세포의 농축

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...