Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke studiegruppen og spesielt anerkjenne teknisk assistanse og støtte fra bioforsknings- og aerosolteamene ved PMI R &D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, og PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Sveits. Forfatterne takker Sam Ansari for å administrere biobanken og anerkjenner støtten fra Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy for å redigere et utkast til manuskriptet.

Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i et anlegg akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International og lisensiert av Agri-Food &; Veterinary Authority of Singapore, med godkjenning fra en institusjonell dyrepleie- og brukskomité og i samsvar med National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purpose (NACLAR, 2004).
1. Prøveinnsamling
<ol><li>Utfør lungedisseksjoner fra mus etter 3 måneder og 6 måneders eksponering av ApoE−/− mus. Samle vevene 16-24 timer etter eksponering, snap-frys dem i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C før du starter arbeidsflyten for lipidomikk. Sørg for innsamling av totalt ni prøver fra hver "omics" disseksjonsgruppe.</li>
</ol>2. Vev - pulverisering av prøvene
<ol><li>Forbered magnethammeren og forbruksvarer for sliping av vev. Forkjølte vevsposer, tang, kappede vevsoverføringsrør med lokk, en "V" plastspatel og 2 ml plastoppsamlingsrør på tørris. Monter den tilsvarende rørholderen på et magnetisk hammerinstrument. Slå på magnethammeren og sett slagkraften til Høy.</li>
	<li>Legg prøven i en vevspose; Sett prøven gjennom den øverste åpningen av vevposen ved hjelp av forkjølt tang om nødvendig. Plasser prøven i midten av den fleksible posen, vekk fra kantene.</li>
	<li>Forsegl klesposen ved å skru et forkjølt oppsamlingsrør på toppen av posen med vev.</li>
	<li>Knips og frys prøven ved å dyppe den fleksible posen i flytende nitrogen i 10 sekunder.</li>
	<li>Luft oppsamlingsrøret; Løsne røret i en 1/4 omdreining for utlufting for å unngå å sprekke posen når den magnetiske hammeren treffer.</li>
	<li>Legg den frosne papirposen på den magnetiske hammeren.</li>
	<li>Påfør magnethammeren ved å trykke på aktiverknappen for å pulverisere prøven. Hvis ikke-pulveriserte vevsbiter forblir i posen, knipser du prøven i flytende nitrogen igjen og gjentar for et nytt støt.</li>
	<li>Fjern vevposen fra magnethammeren, og hold den pulveriserte prøven nederst. For å forhindre at prøven smelter, snap-frys den igjen umiddelbart.</li>
	<li>Overfør prøven til et oppsamlingsrør. Snu tuben raskt slik at silkeposen er øverst, og bank på posen for å overføre vevspartiklene til bunnen av oppsamlingsrøret. MERK: Dette trinnet bør gjøres raskt for å unngå smelting av vevet.</li>
	<li>Overfør en 10 mg vevsalikvot til en 2 ml tube for videre lipidomisk analyse og oppbevar prøven ved -80 °C inntil ytterligere trinn er utført.</li>
</ol>3. Vev homogenisering
<ol><li>Slå på vevlyserinstrumentet og still ristefrekvensen til 30 Hz og ristevarigheten til 2 minutter. Forbered vevshomogeniseringsbufferløsningen: 150 mM ammoniumbikarbonat i vann, med en pH på ~ 8,2.</li>
	<li>Ta ut prøvene fra lagringsfryseren, legg på is, og legg fire rustfritt stålperler inn i rørene som inneholder vevpulveret. Tilsett 0,5 ml 150 mM ammoniumbikarbonatbuffer til hver prøve.</li>
	<li>Plasser prøverørene i vevslyserholderne. Motvekt begge holdere med samme antall rør. Fest holderne i vevslyserens holdearm. Forstyrre vevet.</li>
	<li>Legg rørene på is og kontroller visuelt at det ikke er rester av vevsaggregater i røret. Hvis vevsforstyrrelser er ufullstendige (aggregater sees), gjenta avbruddsprosessen ved å utføre en annen behandlingssyklus. Legg prøvene på is.</li>
	<li>Lag en aliquot 1 av 100 μL av prøven i et 1,5 ml rør dedikert til proteinbestemmelse. Sentrifuger den ved 18 200 × g i 5 minutter ved 10 °C.</li>
	<li>Bestem proteininnholdet i aliquot 1 ved Bradford-analysen (se avsnitt 4). Oppbevar prøvene på is.</li>
	<li>Lag en aliquot 2 på 20-100 μL av stamhomogenatet i et nytt 2 ml mikrorør for lipidekstraksjon (se avsnitt 5). Hvis prøvene ikke analyseres umiddelbart, må du holde dem på is til ekstraksjonen utføres. MERK: Det endelige ekstraksjonsvolumet må defineres på grunnlag av den totale proteinmengden. Det må ligge i området 0,015-0,045 mg protein per total aliquot.</li>
</ol>4. Bradford proteinbestemmelsesanalyse
MERK: Studieprøver bør randomiseres før begynnelsen av analysen, og randomiseringen respekteres for alle trinn i prøvebehandlingen.
<ol><li>Fortynnet sentrifugert alikot 1 supernatant 2x med ammoniumbikarbonatbuffer. MERK: Fortynningsfaktoren avhenger av konsentrasjonen av vevshomogenatet. For mer konsentrerte løsninger, bruk en høyere faktor slik at den bestemte konsentrasjonen faller i analysens dynamiske område.</li>
	<li>Klargjør en standardkurve for bovint serumalbumin (BSA) i henhold til tabell 1. Vortex standard rør. Sentrifuger rørene ved 18 200 × g i 15 s ved romtemperatur.</li>
	<li>Fra standardrørene som tidligere er fremstilt, overfør 6 μL hver av emnene og standardene til en 96-brønns flatbunnplate i henhold til plateoppsettet vist i figur 1.</li>
	<li>Overfør de tidligere preparerte prøvene til 96-brønns flatbunnplate i henhold til plateoppsettet beskrevet i figur 1.</li>
	<li>Tilsett 250 μL av Bradford-reagenset til hver brønn ved å bruke en flerkanals pipette og blanding. Inkuber i 5 min.</li>
	<li>Mål absorbansen ved en bølgelengde på 595 nm ved hjelp av en plateleser.</li>
	<li>Beregn proteinkonsentrasjonene i alikotene basert på standardkurven. MERK: Fortynningsfaktoren som brukes i begynnelsen av prosedyren bør tas i betraktning ved beregning av proteinkonsentrasjonene.</li>
</ol>5. BUME utvinning
MERK: Unngå bruk av lavbindende plastrør for lipidomikkekstraksjon, siden de sterke organiske løsningsmidlene frigjør myknere og skaper en sterk bakgrunn under prøveanalyse.
<ol><li>Forbered 1,5 ml rør med 100 μL ammoniumbikarbonatoppløsning i hvert rør av det totale emnet (TB), internt standardemne (ISB) og kvalitetskontrollprøver (QC), med tanke på at 1 QC-prøve er plassert mellom hvert sett med 10 prøver. Oppbevar alle prøvene på is.</li>
	<li>Tilsett 10 μL samlet humant plasma til alle QC-prøver. Spike 10 μL intern standardløsning i alle ISB-, QC- og studieprøver (dvs. alle prøver unntatt TB). MERK: For kvalitetskontrollmateriale, bruk et kommersielt tilgjengelig K2EDTA-plasma. Kvantifiser lipidkonsentrasjonen i samlet plasma ved hjelp av nevnte protokoll ved mottak og behold disse områdene som referanser for alle analyser der QC-materialet brukes. Bruk NIST-plasma bare for mer målrettede applikasjoner eller for global metodeverifisering, der nøyaktigheten av analysen må adresseres.</li>
	<li>Tilsett 300 μL -20 °C butanol/metanolblanding (3/1, v/v) i hver prøve. Rist ved 450 × g i 10 minutter ved romtemperatur på thermomixeren.</li>
	<li>Tilsett 300 mikrol heptan/etylacetatblanding (3/1, v/v). Rist ved 450 × g i 10 minutter ved romtemperatur på thermomixeren.</li>
	<li>Tilsett 300 μL 1% eddiksyreblanding. Rist i 5 min ved 450 × g ved romtemperatur på thermomixeren. Sentrifuge ved 2 800 × g i 5 min ved romtemperatur. Overfør 360 μL av den øvre fasen til et nytt 2 ml selvlåsende rør 2. MERK: Væske-væske-ekstraksjon kan resultere i skiftende posisjoner av fasegrensen på en prøveavhengig måte, noe som kan resultere i et lite volumavvik for den øvre fasen. Juster oppsamlingsvolumet for den øvre fasen om nødvendig.</li>
	<li>Tilsett 320 μL heptan/etylacetat (3/1, v/v) til vannfaserøret 1. Rist ved 450 × g i 5 minutter ved romtemperatur på thermomixeren. Sentrifuge ved 2 800 × g i 5 min ved romtemperatur. Overfør 320 μL av den øvre fasen og kombiner med fraksjonen fra trinn 5.11. MERK: Juster innsamlingsvolumet for den øvre fasen om nødvendig.</li>
	<li>Tilsett 250 μL heptan/etylacetat (3/1, v/v) til vannfasen i rør 1. Rist ved 450 × g i 5 minutter ved romtemperatur på termomixeren. Sentrifuge ved 2 800 × g i 5 min ved romtemperatur. Overfør 200 μL av den øvre fasen og kombiner med fraksjonene fra trinn 5.11 og trinn 5.15 i rør 2. MERK: Juster innsamlingsvolumet for den øvre fasen om nødvendig.</li>
	<li>Fordamp til tørrhet ved 35 °C i en vakuumkonsentrator. MERK: Tørkede prøver kan oppbevares ved -20 °C inntil analyse, om nødvendig.</li>
	<li>Oppløses på nytt i 300 mikrol MS-blandingsoppløsning (7,5 mM ammoniumacetat i isopropanol/metanol/kloroform, 4:2:1-løsning). Vortex hvert rør i 5 s for å sikre at alt er oppløst. Sentrifuge ved 18 200 × g i 5 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Overfør en alikot på 50 μL til mikroliterplaten i henhold til plateoppsettet i figur 2 for analyse av positiv ioniseringsmodus (kolonne 1-6) og fortynn med 50 μL MS-blandingsløsning.</li>
	<li>Overfør en alikot på 20 μL til MTP-platen i henhold til plateoppsettet i figur 2 for negativ ioniseringsmodusanalyse (kolonne 7-12) og fortynn med 80 μL MS-blanding. Pakk platen inn med folie og la den holde på 4 °C før analysen.</li>
</ol>6. MS-analyse
<ol><li>Kalibrer et massespektrometer (MS) både i positiv og negativ modus i samsvar med produsentens instruksjoner 5 dager eller mindre før analysen.</li>
	<li>Installer nanokilden med direkte infusjon på forhånd, og sørg for at den er riktig justert mot overføringskapillæren til MS. Installer en 4,1 μm dysebrikke i brikkeholderen og konfigurer den i programvaren.</li>
	<li>Bruk følgende parametere for oppsett av positiv og negativ modus: gasstrykk på 1,25 psi; kildespenning på 1,1 kV; 5 μL injeksjonsvolum av prøven; utgang kontakt lukking Rel1 for 2,5 s; 5 min leveringstid; platekjøling ved 4 °C.</li>
	<li>Sett opp analysesekvenskøen for roboten med direkte infusjon i positiv modus.</li>
	<li>Sett opp MS-metoden for positiv modus ved å bruke følgende MS-innstillinger:<ol><li>Still kapillærtemperaturen til 250 °C og RF-nivået for S-objektiv til 65,0. Utfør MS-innsamling med full skanning fra 0 til 1 min i området 550– 1000 m/z ved oppløsning på 140 000 med automatisert forsterkningskontroll på 1 ×106 og maksimal injeksjonstid på 50 ms. Påfør låsemasse på 680,48022.</li>
		<li>Angi datauavhengig MS/MS-innsamlingsmetode mellom tidsintervallet 1 og 5 minutter ved 17 500 oppløsning med en fast første masse på 250 m/z. Bruk en automatisert forsterkningskontroll for MS2 ved 1 × 105 og maksimal injeksjonstid på 64 ms, en kollisjonsenergi på 20 NCE og et isolasjonsvindu på 1 m/z. Bruk inklusjonsmasselisten fra 550 til 1000 m/z, med et massetrinn på 1 Da.</li>
	</ol></li>
	<li>For opptak i negativ modus, sett kapillærtemperaturen til 250 °C og S-objektivets RF-nivå til 65,0 i MS-tunefilen.<ol><li>Bruk følgende MS-metodeinnstillinger: fullskanneanskaffelsesmodus fra 0 til 1 min ved 140 000 oppløsning som dekker området 400–940 m/z, automatisk forsterkningskontroll på 1 × 106; maksimal injeksjonstid på 50 ms; Bruk en låsemasse på 529,46262.</li>
		<li>Sett MS2-opptak i DIA-modus mellom 1 og 5 minutter av kjøringen med en oppløsning på 17 500 med en fast første masse på 150 m / z; automatisert gevinstkontroll på 1 × 105; 64 ms maksimal injeksjonstid; og 35 prosent kollisjonsenergi. Bruk inkluderingsmasselisten fra 400 til 940 med et massetrinn på 1 Da.</li>
	</ol></li>
	<li>Opprett analysesekvenskøen i MS-programvare i positiv modus. Vent til prøvetakingen utløses av et kontaktlukkesignal som kommer fra den direkte infusjonsroboten for hver prøve.</li>
	<li>Når analysen av positiv modus er fullført, oppretter du sekvenskøen for roboten med direkte infusjon i negativ modus.</li>
	<li>Sett opp analysesekvenskøen i MS-programvare i negativ modus.</li>
</ol>7. Databehandling
<ol><li>For å konvertere datafilene fra de positive og negative modusene fra .raw format til .mzML-format, bruk konverteringsprogramvaren. MERK: Datafiler fra positiv og negativ modus må konverteres separat (på grunn av deres forskjellige innsamlingsinnstillinger og forskjellige støyterskel).<ol><li>Fyll følgende innstillinger for å utføre filkonvertering: støyterskelfaktor er 3 og 5 for henholdsvis MS og MS2; aktivere støyfjerningsfunksjonen for både MS og MS2, datakomprimering, gjennomsnittlig MS2-skanning og toppplukking. Angi TIC-terskler for positive og negative modi (f.eks. 10 000 og 5 000; som skal defineres basert på støynivået til den bestemte prøven produsert av et bestemt instrument). Generer XLC- og PDF-rapporter på slutten av behandlingen.</li>
	</ol></li>
	<li>Utfør lipididentifikasjonen. Definer følgende (eksempel) filimportinnstillingsparametere: valgvindu ±0,5 Da (avhenger av valgvinduet i MS-metoden); tidsintervall 2-300 s (avhenger av skannetid i MS-metoden); ingen kalibreringsmasser for MS og MS2; overføre og runde opp masseområdet fra metadatafilene for Peak by Peak-programvaren (min. masse [MS]) og (min. masse [MS2]); toleranse på 3 ppm og 10 ppm for henholdsvis MS og MS2; hold tom MS- og MS2-terskelfeltet, frekvensfilteret, MS1-forskyvningen og PMOen; Isotopkorreksjon for MS og MS2 valgt; overføringsoppløsningsgradient fra konverteringsmetadatafilen som (Resolution linear fit [MS]) og som (Resolution linear fit [MS2]). MERK: Lipididentifikasjon i positiv og negativ modus må utføres separat på grunn av deres forskjellige anskaffelsesinnstillinger.</li>
	<li>Etter at dataene er importert, gå til Run-menyen og last opp MFQL-filene for lipididentifikasjon. MERK: For detaljert informasjon om strukturen til MFQLs, se publikasjonen av Herzog et al.25. Se noen eksempler på MFQL-filer på https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library og se diskusjonen. Alle MFQL-er som brukes til databehandlingen, er gitt i tilleggsmaterialet.</li>
	<li>Kvantifiser de identifiserte artene på MS-nivå ved å dele forløperens masseintensitet av lipidfunksjonen med den respektive intensiteten av den merkede interne standarden og deretter multiplisere kvotienten med konsentrasjonen av den merkede interne standarden. Normaliser den endelige lipidkonsentrasjonen per mengde totalt protein målt ved Bradford-analysen.</li>
</ol>8. QC sjekk prosedyre
MERK: En kvalitetskontrollprosedyre er et viktig trinn for å verifisere metodens tekniske reproduserbarhet. For dette formål analyseres et kommersielt samlet plasma for å bestemme de endogene nivåene av forskjellige lipider over 5 dager i 15 identiske alikoter per batch (totalt fem batcher). Merk at i dette tilfellet ble en dataevalueringsrørledning opprettet som en Shiny-webapplikasjon ved hjelp av R-statistikkprogramvaremiljøet.
<ol><li>Definer referansegodkjenningsområdet som gjennomsnittsverdien beregnet for alle fem omgangene ±3 standardavvik.</li>
	<li>Bruk "bestått" akseptregler for hver analytisk batch: 90% av referansemålene må passere, tatt i betraktning at en referanseforbindelse representerer en lipidklasse. Hvis for eksempel 15 referansemål er inkludert i QC-verifiseringen, må du sørge for at 13 mål passerer for at partiet skal aksepteres. MERK: Med andre ord må 68% av QC-prøvene per referanseforbindelse passere for at dataene for denne lipidklassen skal aksepteres.</li>
	<li>Hvis studiegruppen ikke oppfyller akseptkriteriene for QC-sjekken, gjenta prosedyren.</li>
</ol>9. Estimering av (relative) konjugerte fettsyremengder
<ol><li>For hver lipidklasse, estimere mengdene av konjugerte fettsyrer basert på deres MS2-intensiteter. MERK: På grunn av fragmenterings- og ioniseringsforskjeller var de avledede verdiene bare ment for relative overflodssammenligninger på tvers av prøvegrupper i stedet for for eksempel å estimere det relative bidraget fra en spesifikk fettsyre til den totale konjugerte fettsyrepoolen til en lipidklasse.</li>
	<li>Normaliser MS2-intensitetene til fettsyrefragmentene med den gjennomsnittlige intensiteten av fettsyrefragmentene av den tilsvarende interne standarden. Basert på konsentrasjonen av den interne standarden og den målte vevsvekten, utleder en "normalisert konsentrasjon" for de konjugerte fettsyrene. Oppsummer disse verdiene per lipidklasse for å estimere den totale mengden av hver konjugert fettsyre per prøve.</li>
</ol>10. Statistisk analyse
<ol><li>Utfør statistisk analyse. Tilpass en lineær modell for hver betingelse og tilhørende kontrollgruppe, og beregn p-verdier fra en t-statistikk for log2-transformerte data. Bruk metoden Benjamini-Hochberg false discovery rate for å korrigere for flere testeffekter. MERK: Lipider med justerte p-verdier < 0,05 anses å være differensielt rikelig. Her ble det utført statistisk analyse i R-statistikkmiljøet26.</li>
</ol>

Alle forfatterne er ansatte i Philip Morris International. Philip Morris International er den eneste kilden til finansiering og sponsor av dette prosjektet.

Selv om fremskritt i MS har gitt en rekke metoder for nøyaktig overvåking av mange lipidarter, viste den tidligere lipidprofileringen av forskjellige pattedyrvev ikke konsistente resultater, og følgelig forblir de spesielle vevsspesifikke funksjonene til lipider uklare. Sammenlignet med proteinfunksjonell analyse, for hvilken mer robuste tilnærminger for å slå ut uttrykket av bestemte forbindelser er tilgjengelige, kan flertallet av lipider ikke selektivt slås av eller overuttrykkes i vev, noe som gjør funksjonell evaluering av lipider vanskelig. Avansert profilering av vevslipidomkonsentrasjoner kan gi en alternativ tilnærming for å identifisere sammenhenger mellom sirkulerende lipider og humane sykdommer.
Ved evaluering av omfattende lipidomics-metoder som var i stand til kvalitativt og kvantitativt å dekke den endogene lipidprofilen til et musevev, foretrakk vi haglelipidomikkmetoden. Generelt er to motsatte typer prøveanalyse mulig: enten en helt målrettet screening av lipider ved bruk av væskekromatografi (LC) -basert separasjon med ytterligere massespektrometrisk deteksjon for å avsløre prøvens totale lipidkompleksitet, eller målrettede tilnærminger, som for det meste tillater svært presis kvantifisering av spesifikke lipider av interesse. I motsetning til dette er den sterke egenskapen til den presenterte haglelipidomikkarbeidsflyten den raske omfattende dekningen av hundrevis av endogene lipider fra forhåndsdefinerte lipidklasser, som fortsatt kan utføres på en robust semi-kvantitativ måte.
Ioniseringseffektiviteten til forskjellige lipidklasser er strukturavhengig og kan variere drastisk avhengig av de forskjellige eksperimentelle ioniseringsbetingelsene. I motsetning til LC-baserte separasjonsmetoder minimerer hagleanalyse disse forskjellene på grunn av direkte samtidig infusjon av hele lipidekstraktet under de samme ioniseringsbetingelsene i MS-instrumentet. Bruken av isotopisk merkede lipidanaloger eller strukturelt lignende ikke-endogene standarder tillater halvkvantifisering av alle lipidklasser. Hagle lipidomics gir lav inter- og intra-run variabilitet under MS analyse; Som et resultat produserer denne metoden lavere variasjonskoeffisienter21 enn ikke-målrettede væskekromatografibaserte metoder, som krever flere standarder for tilstrekkelig kvantifisering. Det er viktig at selv om ingen ekstern kalibreringskurve brukes i den nåværende metoden, anses metoden fortsatt som fullstendig kvantitativ32.
Ett nivå av merket intern standard (eller umerket standard som ikke er endogent uttrykt) per lipidklasse er tilstrekkelig for kvantifisering av de fleste lipider. Kun et fåtall publikasjoner har rapportert en delvis metodevalidering for en haglelipidomikkmetode. For eksempel, i Gryzbek et al.17 og Surma et al.21, ble reverserte kalibreringskurver utarbeidet ved hjelp av interne standarder og en fast mengde prøvematrise. Linearitet ble vurdert ved lineær regresjon av log-transformerte lipidmengder og deres intensiteter og rapportert som henholdsvis R2 og helning. Deteksjonsgrensen (LOD) og kvantitasjonsgrensen (LOQ) ble bestemt ved vektet lineær regresjon basert på et signal-støy-forhold på 3 for LOD og 10 for LOQ. For de fleste lipidklasser ble LOQ definert mellom 2-9,8 pmol for fettvev og 0,05-5μM i plasma. I begge tilfeller ble ikke-endogene interne standarder per klasse brukt til å utlede estimater for alle lipider i klassen. I dette arbeidet gir vi imidlertid ikke LOD / LOQ på grunn av flere bekymringer: den endogene matrisen er ikke forbindelsesfri, og surrogatmatrisen for vev er utilgjengelig - med dette er piggen av små kjente mengder standarder ikke mulig. Vi utfører ikke en klassisk målrettet kvantifiseringstilnærming ved bruk av en kalibreringskurveserie av en bestemt forbindelse normalisert ved sin identiske isotopisk merkede standard på grunn av ikke-eksistensen av rene standarder og den svært begrensede tilgjengeligheten av isotopisk merkede lipider. Orbitrap-detektorer utfører automatisk konverteringen av det forbigående signalet ved å bruke en Fourier-transformasjon, og noe signal er allerede erstattet - som et resultat vil det lavere konsentrasjonsområdet bare være lineært ned til et minimumssignal, under hvilket molekylet ikke vil kunne oppdages lenger. Xcalibur-programvarens signal-til-støy-verdier avhenger av m/z-forholdet mellom molekylet. Som et resultat vil forbindelsene i hver lipidklasse, som inneholder forskjellige kombinasjoner av fettsyrer, ha forskjellige støyverdier. Videre er LOQ / LOQ-verdier strengt knyttet til matrisetypen, og når kvantifisering av lipidomet gjøres i forskjellige gnagervev, bør det gjenspeiles ved vurdering av LOQ for hver vevstype individuelt.
Faktisk tilbyr metoden et høyt lineært dynamisk kvantifiseringsområde på opptil fire størrelsesordener33 og meget god følsomhet for å dekke de viktigste endogene strukturelle lipidene, som kan økes ytterligere ved tekniske forbedringer i MS-oppkjøpet32. Koeffisientene for variasjon av gjennomsnittlige lipidkonsentrasjoner var for det meste under 15%, noe som betyr at hagle lipidomics oppfyller Food and Drug Administration (FDA) krav som en metode som skal vurderes for god laboratoriepraksis (GLP) og god klinisk praksis (GCLP) studier34.
Det må imidlertid bemerkes at på grunn av deres forskjellige polaritet blir noen lipidklasser mye mer påvirket av bidraget fra spesifikke konjugerte FA. Dette fører til forvrengningen i intensitetsresponsen i ekvimolare blandinger som inneholder et bredt spekter av konjugerte FAer, noe som resulterer i kvantifiseringsskjevhet, som fremhevet av Koivusalo et al.35 for fosfolipidklasser. Merk at disse forfatterne presenterte data for et bredt spekter av FA, fra 24-48 kjedelengde, noe som sannsynligvis ikke gjenspeiler situasjonen i en ekte biologisk prøve. Responsen for flerumettede arter var 40% høyere enn for fullt mettede arter, men denne effekten ble bare observert for høyere konsentrasjoner. Når blandingen ble gradvis fortynnet, avtok effekten av umettethet gradvis og forsvant nesten ved 0,1 pmol/μL per art. I tillegg ble alle målinger gjort på ionefelle og trippel kvadrupoler instrumenter og ikke på Q-Exactive utstyr.
En annen fordel med den presenterte arbeidsflyten er dens tekniske fleksibilitet, noe som gjør det mulig å tilpasse seg spesifikke prosjektkrav. For eksempel kan enhver lipidekstraksjonsprotokoll - som den modifiserte Bligh og Dyer 36, metyltert-butyleter37 eller butanol-metanol38-metoder - brukes til fremstilling av et totalt lipidekstrakt før MS-analyse. Hovedbegrensningen for kloroform-metanolekstraksjon er at den nedre fasen inneholder lipidfraksjonen, noe som kompliserer rutinemessig arbeid og spesielt automatisering; I tillegg må toksisiteten av kloroform vurderes. Tert-butyleter ekstraksjon er mye brukt for lipidanalyse av plasmaprøver37, og en automatisert versjon har blitt foreslått21. I dette tilfellet valgte vi BUME-metoden fordi den gir enda bedre utvinning for de piggete PG-, PI-, PA- og PS-lipidklassene38, lavere løsningsmiddelforbruk og muligheten for automatisering39, mens de totale konsentrasjonene kvantifisert for vevsprøver ekstrahert ved alle tre metodene var sammenlignbare. I tillegg, mens prøveutvinningen ble utført manuelt i det nåværende arbeidet, er det også mulig å oppnå reproduserbare og presise resultater fra store prøvesett ved automatisert prøvepreparering og lipidekstraksjon i et 96-brønnformat40,41. Dette gjør at man kan implementere lipidomikkanalyse i store kliniske og toksikologiske studier.
I det nåværende arbeidet utførte vi MS-oppkjøpet av positive og negative moduser separat uten polaritetsbytte som beskrevet av Schuhmann et al.42. Stabiliteten til nanomatesignalet er bedre i negativ modus for en litt mindre konsentrert løsning enn i positiv modus. I tillegg utviklet vi en fullt sporbar prosedyre med konverteringsprogramvare fra .raw-filer til mzML, som gir verdiene som skal spesifiseres i LipidXplorer-programvaren - med dette er det ikke nødvendig med manuelle oppløsningshellingsberegninger. Vi brukte også forskjellige støyinnstillingssubstitusjoner fordi støynivåene i spektra i positiv modus er høyere enn i negativ modus. Alle trinnene ble optimalisert for sporbare rutineanalyser med høy gjennomstrømning.
For identifikasjon kan hagle lipidomics analyse utnytte den unike oppførselen til forskjellige lipidklasser, som danner unike addukter i forskjellige polaritetsmoduser. I denne metoden kan PC- og PE-arter med samme molekylmasse som overlapper i positiv ioniseringsmodus separeres fullstendig i negativ ioniseringsmodus, da PC danner acetat- eller formataddukter, og PE ioniseres i deprotonert form. Videre er (delvis) strukturell dekonvolusjon mulig for metoden som benytter ikke bare molekylformelen, men også bulkfettsyrestrukturen. For eksempel fungerer FA-identifikasjon på nivået av totalt karbon og totalt umettet antall for alle fosfolipider, DAGs, TAGs og lyso-fosfolipider. Bottom-up-kvantifiseringen av hver isomere form kan delvis utføres for noen av fosfolipidklassene43 , men er mye mer komplisert for DAGs og TAGs på grunn av den ulik signalrespons av forskjellige FAer i MS2-spektrene.
Det er også viktig å understreke behovet for å implementere hensiktsmessige kvalitetskontrollprosedyrer, helt i tråd med nyere initiativer på dette feltet44. Ettersom vi ønsker å sikre riktig datasporbarhet og reproduserbarhet mellom og i laboratoriet, er det tatt en rekke skritt som riktig randomisering av prøvene for alle trinn i analysen, arbeid med leverandørsertifiserte standardblandinger, inkludering av kvalitetskontrollprøver, prosedyrer for å verifisere batchaksept eller avvisning, og opprettelse av en intern database for å spore QC-ytelse på lang sikt. Også i samsvar med disse initiativene er behovet for en standardisert metode for å håndtere utvalgsstabilitet. Generelt påvirkes flertallet av strukturelle lipider ikke av lipidoksidasjon, noe som er mer relevant for oksilipiner, oksiderte lipider og flerumettede fettsyrer som derfor er mye mer følsomme for lagrings- og håndteringsforhold. Riktig vurdering av utvalgsstabilitet er imidlertid fortsatt en teknisk utfordrende oppgave.
Imidlertid har denne protokollen en begrensning når det gjelder å bestemme submolekylære nivåer av forbindelser. Tatt i betraktning at det ikke er noen separasjon av det totale ekstraktet, blir alle isoformer av lipider med samme molekylmasse, men forskjellige fettsyresammensetninger, slått sammen i MS-analysen. For de fleste klasser er det mulig å oppnå delvis dekonvolusjon av strukturen ved å bruke fragmenteringsforholdene for gjenværende fettsyrefragmenter i MS2. Imidlertid er den uavhengige kvantifiseringen av hver isoform fortsatt en spesielt utfordrende oppgave på grunn av de store forskjellene i fragmenteringsoppførselen til forskjellige isoformer og det faktum at rene kjemiske standarder ikke er tilgjengelige i stort nok variasjon til å definere kompensasjonsverdiene. En annen begrensning er at ESI-prosessen uunngåelig genererer artefakter, noe som resulterer i kunstig generering av topper for noen lipider som DAG, Pas og FAs, noe som kan føre til feilaktig kvantifisering.
Deretter oppsummerer vi de mest kritiske delene av protokollen basert på vår erfaring. Den første er relatert til det faktum at hver musevevstype har en unik lipidprofil når det gjelder både lipidmengde og klasseforhold. Med dette må startmengdene av vevet basert på det totale proteininnholdet før ekstraksjon bestemmes nøye for ikke å mette MS-signalet og ikke forlate det dynamiske kvantifiseringsområdet på grunn av lipidaggregering ved høye konsentrasjoner33 eller - i motsatt ytterlighet - for å gi nok MS-signal til å dekke de viktigste lipidforbindelsene for hver lipidklasse.
Det andre kritiske aspektet er å sikre en riktig justering av posisjonen til nano-kilde-chiputløpet med overføringskapillæren til massespektrometeret. Tatt i betraktning at full kalibrering av massespektrometeret i begge modusene utføres ukentlig, kan bytte mellom kalibreringskilden og nanokildebrikkeoppsettet være årsaken til dramatisk variasjon i signalintensitet på grunn av feiljustering under installasjonen.
En annen kritisk del av protokollen er forsiktig håndtering av den interne standardblandingen. Siden denne blandingen inneholder en betydelig mengde diklormetan, når den er åpnet, bør den konsumeres raskt for å unngå lang lagring og flere bruksområder som fører til fordampning og kunstig konsentrasjonsendring. Videre er konsekvent håndtering av standardblandingen etter fjerning fra -20 °C lagring viktig, siden temperaturforskjeller kan føre til voluminkonsekvenser under pipetteringen med luftputepipetter. Et alternativ ville være å erstatte diklormetan i standard resuspensjonsbuffer med ren metanol, noe som kan forbedre håndteringsbekvemmeligheten, men kan negativt påvirke løseligheten av noen lipidklasser og dermed redusere kvantifiseringsnøyaktigheten for disse lipidklassene.
Den siste kritiske delen er databehandling. Databehandlingsarbeidsflyten kombinerer programvarekonverteringen Peak by Peak fra .raw til .mzML-format, bruker MS2-gjennomsnittsskanning og MS1- og MS2-støyfiltrering, samt toppplukking og datakomprimering. Som et alternativ kan Proteowizard-programvaren også brukes til datakonvertering, men i dette tilfellet må flere innstillinger i LipidXplorer defineres manuelt. All kompleksiteten til hagle lipidomics er spesielt konsentrert om trinnet med dekonvolusjon av direkte injeksjon MS1 og MS2 spektra. Open-source LipidXplorer-programvaren importerer de konverterte spektrene fra mzML-filformat basert på massenøyaktighet, masseoppløsning og helningen av endringen med økende m / z. Programvaren fusjonerer flere individuelle MS- og MS/MS-spektra ervervet i løpet av en analysekjøring. Etterpå justerer den individuelle topper innenfor forskjellige prøvekjøringer, og i hver klynge av justerte topper erstatter den massene med deres enkelt intensitetsvektede gjennomsnittsmasse, mens deres overflod i hver datafil forblir uberørt. Representative masser av justerte toppklynger og individuelle toppintensiteter lagres i en hovedskanningsdatabase. Hovedskanningsdatabasen inneholder alle MS1- og MS2-spektra generert for alle prøver i batchen, og kan dekonvoluteres til lipididentifikasjoner ved spørringer skrevet i MFQL (molecular fragmentation query language).
Samlet sett dekker metoden identifisering av DAG-, TAG- og SE-lipider basert på positiv modus og PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC og LPE lipider basert på negativ modusoppkjøp. Under lipididentifikasjon utføres isotopkorreksjon for MS1 og MS2, og justert intensitet rapporteres i .xlsx-utdatafilen. Alternativt er flere andre programvare tilgjengelig for å behandle hagledata, for eksempel ALEX45 og LipidHunter46.
Fettsyrer - store kjernefysiske og cellulære membrankomponenter - lagres i form av fosfolipider for videre omdannelse til bioaktive molekyler. De kan omdannes av lysofosfolipidacyltransferase enzymer til lysofosfolipider gjennom Lands vei47. LPCAT3-enzymet, for eksempel, er kjent for å vise høy spesifisitet for å inkorporere AA i lysofosfatidylkolin og lysofosfatidylserin-mellomprodukter. Det relativt høye uttrykket av disse enzymene ble rapportert i inflammatoriske celler, slik som alveolære makrofager og bronkiale epitelceller47, noe som førte til frigjøring av større relative proporsjoner av AA-inneholdende fosfolipider i disse cellene. Imidlertid, etter frigjøring fra membranfosfolipider av fosfolipase A2, blir omdannelsen av PUFA til forskjellige typer lipidmediatorer katalysert av mange enzymer48. Videre kan disse PUFA bli substratet for produksjon av proinflammatoriske og antiinflammatoriske prostaglandiner via virkningen av cyklooksygenase (COX)-1 og COX-2 enzymer47. Fosfolipider er en av kildene til lipidmediatorer frigjort på bestemte steder der disse mediatorene er pålagt å demonstrere deres biologiske effekter.
Lungen er et komplekst organ som består av flere celletyper, som hver spiller overlappende og nisjeroller for å lette normal lungeutvikling og funksjon. Bare noen få studier har blitt gjort for å isolere og profilere forskjellige celletyper i musen eller den menneskelige lungen (f.eks. alveolære type 2-celler)49,50; Andre store lungecelletyper er ikke karakterisert. En annen interessant studie51 ble utført for å isolere og utføre lipidanalyse av endotel-, epitel-, mesenkymal- og blandede immunceller i muselungen. Det ble observert at konsentrasjonen av PUFA inkorporert i PCO og PG var beriket i immuncellene. Tatt i betraktning det faktum at CS induserer en økning i immunceller i lungene (4-5 ganger), vurdert ved bronkoalveolær skylling (BAL)52, kan de totale lipidendringene observert i denne studien forklares av en kumulativ økning i immuncellerekruttering i muselungen.
Avslutningsvis kan den observerte forvrengningen av enumettede fettsyrer og PUFA inkorporert i fosfolipider gjenspeile overskuddet av visse FAs i cellen og/eller utgjøre en intracellulær ressurs av oksilipinforløpere som overproduseres under oksidativt stress og inflammatoriske tilstander. Imidlertid er ytterligere data om fri EPA, DHA og andre oksilipiner avgjørende for å klargjøre dette punktet og er utenfor omfanget av den nåværende metodeapplikasjonen.

Sigarettrøyk (CS) er anerkjent som en viktig risikofaktor forbundet med utvikling av kroniske inflammatoriske sykdommer i lungene, inkludert lungekarsinom, bronkitt og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)1. Utover lungepåvirkningen spiller CS-eksponering en betydelig rolle i utviklingen av andre sykdommer som aterosklerotisk koronararteriesykdom og perifer vaskulær sykdom1. Hjerte- og karsykdommer, sammen med KOLS, er henholdsvis den første og tredje største dødsårsaken på verdensbasis. Toksikologiske risikovurderingstilnærminger har historisk basert seg på bruk av dyremodeller som gnagere. In vivo nese- eller helkroppsmodeller for rotter og mus brukes ofte til å studere langtidseffektene av eksponering for CS.
For eksempel induserer generelt 6 måneders røykeksponering histologiske og funksjonelle abnormiteter i murine lunger som etterligner de av menneskelig sykdom, inkludert emfysem, luftveisremodellering og pulmonal hypertensjon, selv om endringene er relativt milde sammenlignet med de som er observert hos langsiktige humane røykere2. I både animalsk og menneskelig vev har studier observert et bredt spekter av molekylære endringer som respons på CS-eksponering, inkludert oksidativ stressrespons, betennelse og strukturelle vevsendringer 3,4. Ikke overraskende har CS-eksponering også blitt rapportert å ha en vidtrekkende innvirkning på lungelipidomet, inkludert effekter på overflateaktive lipider, lipidsignalmediatorer og strukturelle lipider 4,5,6.
For å karakterisere bulklipidendringene indusert av langvarig CS-eksponering av muselunger, utførte vi en rask og kvantitativ hagle direkte infusjonsmassespektrometrianalyse. Etter introduksjonen av hagle lipidomics metoden i 20057, har denne metoden blitt effektivt brukt til å utvide vår kunnskap om lipidcellulær metabolisme 8,9,10 i modellsystemer som gjær 11, Caenorhabditis elegans12 og Drosophila melanogaster13, samt i et bredt spekter av pattedyrprøvetyper som cellelinjer 14, 15,16 forskjellige mennesker17,18 og gnagervev19,20 og kroppsvæsker21,22.
I løpet av de siste tiårene har studier avslørt kompleksiteten av cellulære responser på miljøendringer, som involverer tusenvis av sammenkoblede proteiner, lipider og metabolitter. Dette har gjort det klart at bruk av state-of-the-art analytiske teknikker er avgjørende for å få en grundig oversikt over molekylære maskinerier og for å avdekke hele omfanget av eksogene fysiologiske påvirkninger. I denne sammenheng kan de omfattende, kvantitative lipidfingeravtrykkene produsert av hagle lipidomics tilnærminger effektivt legge til vår kunnskap om lipidcellulær metabolisme 8,9,10.
Når det gjelder CS-eksponering som en risikofaktor for flere sykdommer, har toksikologiske risikovurderingstilnærminger historisk basert seg på bruk av dyremodeller som gnagere. Shotgun lipidomics MS gir et raskt, sensitivt og kvantitativt analytisk verktøy for å vurdere lipidomforstyrrelser i mange prøvetyper. Den unike egenskapen til hagle lipidomics er den automatiserte direkteinjeksjonsanalysen av et totalt lipidekstrakt-spiked med merkede interne standarder uten kromatografisk separasjon i et høyoppløselig MS-instrument ved å bruke en ledende nanochip som genererer en elektrosprayionisering (ESI) nanospray23.
Informasjonen om masse-til-ladningsforhold som samtidig anskaffes i MS1-modus, gir det totale lipidavtrykket til alle intakte endogene lipider. Eventuelt gir MS2/MS3-modusen, der de overordnede lipidmolekylene fragmenteres og analyseres, ytterligere strukturinformasjon. Dataanalyse krever spesialisert programvare og inkluderer dekonvolusjon av spektra og toppoppgaver i samlede spektra som fører til lipididentifikasjon og antatt kjemisk strukturoppklaring. I tillegg kan absolutt kvantifisering utføres ved å spike en merket intern standardblanding som inneholder minst en lipidstandard per lipidklasse av interesse. Samlet sett, med dagens teknikk, kan MS-analyse som tar noen få minutter per prøve, dekke identifisering og kvantifisering av opptil 800 lipider fra 14 lipidklasser24 i gnagervev.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Lipider spiller en viktig rolle som essensielle komponenter i alle prokaryote og eukaryote celler. Konstante teknologiske forbedringer i massespektrometri har gjort lipidomikk til et kraftig analytisk verktøy for overvåking av vevlipidomsammensetninger i homeostatiske så vel som sykdomstilstander. Denne artikkelen presenterer en trinnvis protokoll for en haglelipidanalysemetode som støtter samtidig påvisning og kvantifisering av noen få hundre molekylære lipidarter i forskjellige vevs- og biofluidprøver ved høy gjennomstrømning. Denne metoden utnytter automatisert nano-flow direkte injeksjon av et totalt lipidekstrakt pigget med merkede interne standarder uten kromatografisk separasjon i et høyoppløselig massespektrometriinstrument. Med utgangspunkt i submikrogrammengder gnagervev tar MS-analysen 10 minutter per prøve og dekker opptil 400 lipider fra 14 lipidklasser i musens lungevev. Metoden som presenteres her er velegnet til å studere sykdomsmekanismer og identifisere og kvantifisere biomarkører som indikerer tidlig toksisitet eller gunstige effekter i gnagervev.

Her, som representative resultater, presenterer vi data som illustrerer hvordan hagle lipidomics kan brukes til å studere effekten av CS på lungene til mus. Protokollen for haglelipidanalyse ble vellykket anvendt for en in vivo-studie for komparativ analyse av to grupper av prøver: lungevev dissekert fra ni kvinnelige Apoe-/- mus utsatt for CS (3R4F-gruppe; positiv kontroll) og like mange mus opprettholdt under friske luftforhold (sham-gruppe) som negativ kontroll samlet etter 3 måneder, 4 måneder og 6 måneders eksponeringstid. Dyrene ble holdt under filtrert og kondisjonert frisk luft ved 22 °C ± 2 °C temperatur og 55 % ± 15 % fuktighet og fôret med gammabestrålt pelletsdiett. Lysregimet ble opprettholdt ved 12 timer per dag. Opptil åtte mus ble plassert per hvert bur. 3R4F referansesigaretter for eksponeringsbehandling ble kjøpt fra University of Kentucky for å generere 3R4F CS-aerosolen (600 μg totalt partikkelformet TPM / L aerosol) for en måleksponeringskonsentrasjon tilsvarende 28 μg nikotin / L.CS røyk fra 3R4F-sigaretter ble produsert ved bruk av 30 port roterende røykemaskiner ifølge Phillips et al.27 . Basert på Health Canada Intensive Smoking Protocol ble 55 ml puffvolum, en puff per 30 s og 100% blokkering av ventilasjonshull påført 3R4F-sigaretter for å gi tilstrekkelig eksponering. Alle ytterligere detaljer om studiedesignet er rapportert tidligere27,28.
Totalt ble ~400 molekylære lipidarter fra de 14 mest tallrike lipidklassene identifisert og kvantifisert (figur 3). Den totale normaliserte lipidkonsentrasjonen per klasse var litt forhøyet for PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- og PG-lipidklassene, og noe nedregulering ble observert for SM-, LPE- og PA-lipider (figur 3A), mens ingen forskjell kunne ses for TAGs og PS. Interessant nok er forhøyede nivåer av PCO- og PEO-plasmalogenlipider i CS-gruppen rapportert i inflammatoriske celler29 . En av de intracellulære funksjonene til plasmalogenlipider er antioksidantaktivitet. Ved eksponering for reaktive oksygen- (ROS) og nitrogenarter (RNS) ble selektiv oksidasjon av plasmalogener sammenlignet med diacylfosfolipider rapportert30. Enyleterbindingen i plasmalogeners kjemiske struktur er følsom for radikalt angrep på oksidativt stress31. De viktigste produktene av radikale angrep er hydroksylerte eikosatetraensyrer, 2-monoacylglycerol fosfolipider, pentadekanol, myresyrer, α-hydroksyaldehyder av forskjellige kjedelengder, 1-formyl-2-arakidonoyl glycerofosfolipid og lysofosfolipider.
Disse resultatene viser at blant de molekylære egenskapene basert på den totale molekylformelen ble 100-120 forbindelser signifikant påvirket av CS-eksponering (figur 3D). Den detaljerte dekonvolusjonen av MS2-fragmenteringsinformasjonen og normaliseringen av fragmentsignalintensitetene tillot den omtrentlige definisjonen av den totale mengden av hver konjugert fettsyre (FA) representert i hver lipidklasse (figur 3E) og sammenligning av disse dataene mellom eksponerte og kontrollgrupper. En klar reduksjon i både fullt mettede FA og de med bare noen få umettede, hovedsakelig i sammenheng med lyso-lipider, ble observert. I motsetning til dette ble flerumettede fettsyrer (PUFA) i sammensetningen av PC-, PE- og PG-fosfolipidklasser forhøyet i CS-gruppen for alle tidspunkter. De ekstreme tilfellene av PC og PG konjugert med eikosapentanoisk (EPA) og dokosaheksaensyre (DHA) ble utelukkende påvist i eksponeringsgruppen 3R4F CS (figur 3E, rød farge).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figur 1: Plateoppsett for prøvefordeling i Bradford-analysen. Blanke og standardprøver plasseres i tre eksemplarer i kolonne 1-3; Ukjente prøver plasseres i duplikater i kolonne 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figur 2: Plateoppsett av 96-brønns mikrotiterplate for analyse av haglemassespektrometri. Fordelingen av blanke, standard, ukjente og QC-prøver for oppkjøp i positiv ioniseringsmodus er kartlagt på venstre side av platen (kolonne 1-6); Alle prøver for negativ ioniseringsmodus er plassert til høyre (kolonne 7-12). Forkortelser: pos = positiv; QC = kvalitetskontroll; neg = negativ; TB = totalt tomt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figur 3: Haglelipidomikkanalyse av muselunger utsatt for sigarettrøyk. Apoe−/− -mus ble utsatt for CS fra 3R4F-referansesigaretten eller frisk luft (humbug). (A) Lipidklassekonsentrasjoner og antall lipidarter per klasse. For hver klasse er antall kvantifiserte lipidarter gitt i parentes. Gjennomsnittlig og 95 % konfidensintervall for hver lipidklasse, separat for hver eksponeringstype (aggregert over tre tidspunkter). (B) Vulkanplott som viser effektstørrelsen (log2 fold endring) og signifikans (-log10 FDR-justert p-verdi) av den kvantifiserte lipidarten for 3R4F CS versus humbug-sammenligningen ved de tre tidspunktene. Betydelig forhøyede lipider er merket i gult; signifikant reduserte lipider er merket i cyan (FDR-justert p-verdi < 0,05). (C) Differensiell overflod av de 25 lipidartene med de største absolutte gjennomsnittlige foldendringene. Log2 fold endringer for 3R4F CS versus humbug sammenligning er fargekodet, og statistisk signifikans er indikert: *: FDR-justert p-verdi < 0,01; X: FDR-justert p-verdi < 0,05. (D) Sammenligningsplott. Korrelasjonskoeffisientene for fold-endringssammenligningene er fargekodet, og antall delte differensielt rikelig lipider er angitt (totale tall i margene). Kakediagrammer viser prosentandelen av delte differensielt rikelig lipider med samme endringsretning (FC-tegn). Asterisk indikerer en signifikant overlapping av de differensielt rikelig lipider. (E) Differensiell overflod av konjugerte FAs per lipidklasse. Varmekart som i panel C for konjugerte fettsyrer med signifikante forskjeller i mengde mellom 3R4F og narreeksponering i alle tre tidsperioder (FDR-justert p-verdi < 0,05). Mengden av hver fettsyre per lipidklasse ble estimert basert på MS2-intensitetene til fettsyrefragmentene. Forkortelser: CS = sigarettrøyk; FDR = falsk oppdagelsesrate; FC = fold endring; FA = fettsyrer; PC = fosfatidylkolin; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol; SM = sfingomyelin; PEO = plasmalogen fosfatidyletanolamin; PE = fosfatidyletanolamin; PG = fosfatidylglyserol; PI = fosfatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol / kolesterylestere; PCO = plasmalogen fosfatidylkolin; LPC = lysofosfatidylkolin; LPE = lysofosfatidyletanolamin; PA = fosfatidsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA endelig konsentrasjon (mg/ml)</td>
			<td>BSA-oppløsning ved 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Ammoniumbikarbonatbuffer (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 av 0,125 mg/ml oppløsning</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Fortynningsskjema for BSAs interne standard for kalibreringskurven for Bradford-analysen. Forkortelse: BSA = bovint serumalbumin.
Tilleggsinformasjon: MFQL-filer som brukes til lipididentifikasjon av lipider. Den .zip pakken består av de enkelte nødvendige MFQL-filer, hver navngitt følgende dette mønsteret: <lipid klasse forkortelse>_<ioniseringsmodus>_MS2.mfql (f.eks PE_neg_MS2.mfql). Filnavnene for merket intern standardidentifikasjon inkluderer D7(D9)-taggen i <lipidforkortelsen> (f.eks. PED7_neg_MS2.mfql). Disse MFQL-filer brukes til å verifisere mengden av deuterium i den interne standarden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Haglemassespektrometribasert lipidomikk gir et sensitivt kvantitativt øyeblikksbilde av et bredt spekter av lipidklasser samtidig i en enkelt måling fra forskjellige gnagervev.

Hagle lipidomikk av gnagervev

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Den presenterte protokollen gjør det mulig å kvantifisere et bredt spekter av lipid i animalsk vev. Det er et enkelt verktøy for å studere lipidmekanismer og også for å identifisere biomarkør som indikerer tidlig toksisitet i dyremodeller. Metoden gir en kvantitativ profil av mer enn 400 molekylære lipider i 14 forskjellige lipidklasser i et bredt utvalg av prøvematriser med en 10-minutters trendtid per prøve.For å begynne, fortynn sentrifuge aliquot 1 supernatant to ganger konsentrasjonen med ammoniumbikarbonatbuffer. Etter fremstilling av standardkurven for bovint serumalbumin, virvel standardrørene og sentrifuge rørene ved 18.200 g i 15 sekunder ved romtemperatur. Fra standardrørene som er utarbeidet tidligere, overfør 6 mikroliter hver av emnet, standardene og prøvene til en 96-brønns flatbunnplate.Deretter tilsettes 250 mikroliter av Bradford-reagenset til hver brønn ved å bruke en flerkanals pipette og blande. Etter inkubering i 5 minutter måles absorbansen ved en 595 nanometer bølgelengde ved hjelp av en plateleser. Forbered 2 milliliter rør med 100 mikroliter ammoniumbikarbonatoppløsning i hvert rør av totalt blankt og internt standardemne og hold alle prøver på is.Forbered kvalitetskontrollprøver, med tanke på at en kvalitetskontrollprøve er plassert mellom hvert sett med 10 prøver. Legg til 10 mikroliter samlet humant plasma til 2 milliliter rør, og spike deretter 10 mikroliter intern standardløsning i alle interne standardblanke, kvalitetskontroll og studieprøver. Tilsett 300 mikroliter minus 20 grader Celsius butanol metanolblanding til hver prøve og rist ved 450 g i 10 minutter ved romtemperatur på thermomixer.Deretter tilsettes 300 mikroliter heptanetylacetatblanding og ristes ved 450 g i 10 minutter ved romtemperatur på termomixeren, tilsett deretter 300 mikroliter 1% asketsyreblanding og rist i 5 minutter ved 450 g ved romtemperatur på thermomixeren. Sentrifuge ved 2.800 g i 5 minutter ved romtemperatur og overfør 360 mikroliter av den øvre fasen til et nytt 2 milliliter selvlåsende rør merket som 2. Etter tilsetning av 320 mikroliter heptanetylacetat til vannfaserøret merket som 1, rist ved 450 g i 5 minutter ved romtemperatur på termomixeren, deretter sentrifuge ved 2.800 g i 5 minutter ved romtemperatur som vist tidligere.Overfør 320 mikroliter av den øvre fasen og kombiner dem med fraksjonen fra forrige trinn i rør 2. Tilsett på samme måte 250 mikroliter heptanetylacetat til vannfasen i rør 1 og rist ved 450 g i 5 minutter ved romtemperatur på thermomixeren. Igjen, sentrifuge ved 2.800 g i 5 minutter ved romtemperatur, overfør deretter 200 mikroliter av den øvre fasen og kombiner den med fraksjonene fra de forrige trinnene i rør 2.Fordamp til tørrhet ved 35 grader Celsius i en vakuumkonsentrator og oppløs på nytt i 300 mikroliter MS-blandingsløsning. Vortex hvert rør i 5 sekunder for å sikre at alt er oppløst og sentrifuge ved 18.200 g i 5 minutter ved 4 grader Celsius. Overfør en aliquot på 50 mikroliter inn i mikroliterplaten for analyse av positiv ioniseringsmodus og fortynn med 50 mikroliter MS-blandingsløsning.Igjen, fortynn med 80 mikroliter MS-blanding og overfør en aliquot på 20 mikroliter inn i MTP-platen for analyse av negativ ioniseringsmodus. Pakk platen med folie og hold ved 4 grader Celsius før analysen. Kalibrer en MS både i positiv og negativ modus i samsvar med produsentens instruksjoner 5 dager eller mindre før analysen.Installer nanokilden med direkte infusjon på forhånd, og sørg for at den er riktig justert mot overføringskapillæren til MS og en 4,1 mikrometer dysebrikke i brikkeholderen, og kontroller deretter parametrene for positiv og negativ infusjon som tilsvarer et gasstrykk på 1,25 psi, kildespenning på 1,1 kilovolt, 5 mikroliter prøveinjeksjonsvolum, utgangskontaktlukking Rel1 i 2.5 sekunder, 5 minutters leveringstid, platekjøling ved 4 grader Celsius, sett deretter opp temperaturregulatoren og lag en ny plate. For positiv modus, sjekk og still inn programvare som MS-metoden er satt opp med en kapillærtemperatur på 250 grader Celsius og S Lens RF-nivå på 65,0. I Xcalibur-programvaren åpner du den positive metoden og kontrollerer at MS-oppkjøpet er satt opp fra null til 1 minutt i området 550 til 1.000 m / z ved 140.000 oppløsning med automatisk forsterkningskontroll på 1 million og maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder.Påfør låsemasse på 680,48022. Kontroller at den datauavhengige MS/MS-innsamlingsmetoden er satt opp mellom 1 og 5 minutters tidsintervall ved 17 500 oppløsning med en fast første masse på 250 m/z. Kontroller at den automatiserte forsterkningskontrollen for MS2 er satt opp ved 100 000 og en maksimal injeksjonstid ved 64 millisekunder, en kollisjonsenergi på 20 NCE, isolasjonsvinduet ved 1 m/z og at en inklusjonsmasseliste fra 398 til 1 100 m/z brukes med et massetrinn på 1 Dalton.For oppkjøpet i negativ modus, sjekk i tune programvare at MS-metoden er satt opp med kapillærtemperaturen ved 250 grader Celsius i S-objektivet RF-nivå på 65,0 i MS-tunefilen. Deretter, i Xcalibur-programvaren, sjekk at fullskanningsoppkjøpsmodus er satt opp fra null til 1 minutt ved 140 000 oppløsning som dekker 400 til 940 m / z-området, automatisert forsterkningskontroll på 1 million, maksimal injeksjonstid på 200 millisekunder og en låsemasse på 526,46262. Kontroller at MS2-anskaffelsen i DIA-modus er satt opp mellom 1 og 5 minutters kjøring med en oppløsning på 17 500 med en fast første masse på 150 m / z, automatisert forsterkningskontroll på 100 000, 64 millisekunder maksimal injeksjonstid og 35 NCE kollisjonsenergi ved bruk av inklusjonsmasselisten fra 400 til 940 med et massetrinn på 1 Dalton.Opprett analysesekvenskøen i Xcalibur-programvaren i positiv modus og utløs den, opprett deretter sekvensen i ChipSoft-programvaren og start analysen mens du venter på at prøveinnsamlingen skal utløses av et kontaktlukkingssignal som kommer fra den direkte infusjonsroboten for hver prøve. Når analyse av positiv modus er fullført, oppretter du analysesekvenskøen i Xcalibur-programvaren i negativ modus og utløser den, oppretter deretter sekvensen i ChipSoft-programvaren og starter analysen mens du venter på at prøveinnsamlingen skal utløses av et kontaktlukkesignal som kommer fra den direkte infusjonsroboten for hver prøve. Den totale normaliserte lipidkonsentrasjonen ble identifisert og kvantifisert fra de 14 mest tallrike lipidklassene, som var litt forhøyet for PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- og PG-lipidklassene, og noe nedregulering ble observert for SM-, LPE- og PA-lipider.Selv om ingen forskjell kunne sees for TAGs og PS. Disse resultatene viser også at blant de molekylære egenskapene basert på den totale molekylformelen ble 100 til 120 forbindelser signifikant påvirket av sigarettrøykeksponering. Dekonvolusjonen av MS2-fragmenteringen og normaliseringen av fragmentsignalintensitetene tillot den omtrentlige definisjonen av den totale mengden av hver konjugert fettsyre representert i hvert lipidglass og sammenligning av disse dataene mellom eksponerte og kontrollgrupper. En reduksjon i fullt mettede og få umettede fettsyrer ble observert, mens de flerumettede fettsyrene i sammensetningen av PC-, PE- og PG-fosfolipidklasser ble forhøyet i sigarettrøykgruppen for alle tidspunkter.De ekstreme tilfellene av PC og PG konjugert med eikosapentaensyre og dokosaheksaensyre ble utelukkende påvist i eksponeringsgruppen for 3R4F CS. Pipettering av prøven og QC-prøven må gjøres med lavbåndsspisser og for å være nøyaktig, noe som betyr at spissene må kontrolleres mellom hver prøve. Pipetteringen av den interne standardløsningen er kritisk og må være nøyaktig.Løsningen av 1 til 1 diklormetanol må håndteres med forsiktighet, og en ikke-mykner som inneholder spisser må brukes for å unngå å ha plastpolymerer i prøvene. Tipsene må endres mellom hver prøve.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS for inngående karakterisering og kvantifisering av glutamin og asparagin Deamidering i hagle Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifisering av koenzym A i celler og vev

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Berikelse av pattedyrvev og Xenopus oocytter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...