Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer à equipe do estudo e, especialmente, agradecer a assistência técnica e o apoio das equipes de biopesquisa e aerossol do PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapura, e PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suíça. Os autores agradecem a Sam Ansari pela gestão do biobanco e agradecem o apoio do Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy pela edição de um rascunho do manuscrito.

Todos os autores são funcionários da Philip Morris International. A Philip Morris International é a única fonte de financiamento e patrocinadora deste projeto.

A fumaça do cigarro (SC) é reconhecida como um dos principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas do pulmão, incluindo carcinoma pulmonar, bronquite e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)1. Além do impacto pulmonar, a exposição ao SC desempenha um papel significativo no desenvolvimento de outras doenças, como a doença arterial coronariana aterosclerótica e a doença vascularperiférica1. As doenças cardiovasculares, juntamente com a DPOC, são a primeira e a terceira causas de morte no mundo, respectivamente. As abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Modelos in vivo de ratos e camundongos de nariz ou corpo inteiro são comumente usados para estudar os efeitos a longo prazo da exposição ao SC.
Por exemplo, geralmente, 6 meses de exposição à fumaça induzem anormalidades histológicas e funcionais nos pulmões murinos que mimetizam as da doença humana, incluindo enfisema, remodelamento das vias aéreas e hipertensão pulmonar, embora as alterações sejam relativamente leves em comparação com aquelas observadas em fumantes humanos de longa duração2. Em tecidos animais e humanos, estudos têm observado uma ampla gama de alterações moleculares em resposta à exposição ao SC, incluindo respostas ao estresse oxidativo, inflamação e alterações estruturais teciduais 3,4. Não surpreendentemente, a exposição ao SC também tem sido relatada como tendo um impacto de longo alcance sobre o lipidoma pulmonar, incluindo efeitos sobre os lipídios surfactantes, mediadores de sinalização lipídica e lipídios estruturais 4,5,6.
Para caracterizar as alterações lipídicas volumosas induzidas pela exposição a longo prazo do SC de pulmões de camundongos, realizamos uma análise rápida e quantitativa por espectrometria de massa com infusão direta de espingarda. Após a introdução do método lipidômico shotgun em 20057, esse método tem sido efetivamente utilizado para ampliar nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico8,9,10 em sistemas modelo como levedura 11, Caenorhabditis elegans 12 e Drosophila melanogaster13, bem como em uma ampla gama de tipos de amostras de mamíferos como linhagens celulares 14, 15,16 vários tecidos humanos17,18 e roedores19,20 e fluidos corpóreos21,22.
Nas últimas décadas, estudos têm revelado a complexidade das respostas celulares às mudanças ambientais, envolvendo milhares de proteínas, lipídios e metabólitos interconectados. Isso deixou claro que o uso de técnicas analíticas de última geração é essencial para obter uma visão aprofundada das máquinas moleculares e para descobrir toda a magnitude dos impactos fisiológicos exógenos. Nesse contexto, as impressões digitais lipídicas quantitativas e abrangentes produzidas por abordagens lipidômicas shotgun podem efetivamente agregar ao nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico 8,9,10.
Considerando a exposição ao SC como fator de risco para diversas doenças, as abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Shotgun lipidomics MS fornece uma ferramenta analítica rápida, sensível e quantitativa para avaliar a perturbação do lipidoma em vários tipos de amostras. A característica única da lipidômica shotgun é a análise automatizada por injeção direta de um extrato lipídico total - cravado com padrões internos marcados - sem separação cromatográfica em um instrumento MS de alta resolução usando um nanochip condutor gerando um nanospray de ionização por eletrospray (ESI)23.
A informação da relação massa/carga que é adquirida simultaneamente no modo MS1 fornece a pegada lipídica total de todos os lipídios endógenos intactos. Opcionalmente, o modo MS2/MS3, no qual as moléculas lipídicas de origem são fragmentadas e analisadas, fornece informações estruturais adicionais. A análise de dados requer software especializado e inclui a deconvolução de espectros e atribuições de picos em espectros agrupados que levam à identificação de lipídios e elucidação de estruturas químicas putativas. Além disso, a quantificação absoluta pode ser realizada através de uma mistura de padrões internos rotulados contendo pelo menos um padrão lipídico por classe lipídica de interesse. De modo geral, com a presente técnica, a análise da EM com poucos minutos por amostra pode abranger a identificação e quantificação de até 800 lipídios de 14 classeslipídicas24 em tecidos de roedores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Os lipídios desempenham um papel vital como componentes essenciais de todas as células procarióticas e eucarióticas. Os constantes avanços tecnológicos na espectrometria de massas tornaram a lipidômica uma poderosa ferramenta analítica para monitorar as composições do lipidoma tecidual em estados homeostáticos e patológicos. Este trabalho apresenta um protocolo passo-a-passo para um método de análise lipídica shotgun que suporta a detecção e quantificação simultâneas de algumas centenas de espécies de lipídios moleculares em diferentes amostras de tecidos e biofluidos em alto rendimento. Este método aproveita a injeção direta automatizada de nanofluxo de um extrato lipídico total cravado com padrões internos marcados sem separação cromatográfica em um instrumento de espectrometria de massa de alta resolução. A partir de quantidades de submicrogramas de tecido de roedores, a análise de EM leva 10 min por amostra e cobre até 400 lipídios de 14 classes lipídicas em tecido pulmonar de camundongos. O método aqui apresentado é adequado para estudar mecanismos de doenças e identificar e quantificar biomarcadores que indicam toxicidade precoce ou efeitos benéficos em tecidos de roedores.

Aqui, como resultados representativos, apresentamos dados que ilustram como a lipidômica shotgun pode ser usada para estudar os efeitos da SC nos pulmões de camundongos. O protocolo de análise lipídica shotgun foi aplicado com sucesso em um estudo in vivo para análise comparativa de dois grupos de amostras: tecidos pulmonares dissecados de nove camundongos fêmeas de Apoe−/− expostos ao SC (grupo 3R4F; controle positivo) e igual número de camundongos mantidos sob condições de ar fresco (grupo sham) como controle negativo coletado aos 3 meses, 4 meses e 6 meses de tempo de exposição. Os animais foram mantidos sob ar fresco filtrado e condicionado a 22 °C ± temperatura de 2 °C e umidade de 55% ± 15% e alimentados com dieta pellet irradiada por gama. O regime de luz foi mantido em 12 h por dia. Até oito camundongos foram alojados por cada gaiola. Os cigarros de referência 3R4F para o tratamento de exposição foram adquiridos da Universidade de Kentucky para gerar o aerossol 3R4F CS (600 μg de material particulado total TPM/L aerossol) para uma concentração-alvo de exposição equivalente a 28 μg de nicotina/L.CS fumaça de cigarros 3R4F foi produzida usando máquinas rotativas de 30 portas, de acordo com Phillips et al.27 . Com base no Health Canada Intensive Smoking Protocol, 55 mL de volume de sopro, um sopro por 30 s e 100% de bloqueio dos orifícios de ventilação foram aplicados aos cigarros 3R4F para proporcionar exposição suficiente. Todos os detalhes adicionais sobre o desenho do estudo foram relatados anteriormente27,28.
No total, ~400 espécies de lipídios moleculares das 14 classes lipídicas mais abundantes foram identificadas e quantificadas (Figura 3). A concentração total normalizada de lipídios por classe foi ligeiramente elevada para as classes lipídicas PE, PEO, PC, PCO, PI e PG, e alguma downregulation foi observada para os lipídios SM, LPE e PA (Figura 3A), enquanto nenhuma diferença pôde ser observada para TAGs e PS. Curiosamente, níveis elevados de lipídios plasmologênicos de PCO e PEO no grupo CS foram relatados em células inflamatórias29 . Uma das funções intracelulares dos lipídios plasmalogênicos é a atividade antioxidante. Sob exposição a espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), oxidação seletiva de plasmalogênios em comparação com diacilfosfolipídios foi relatada30. A ligação éter-enila na estrutura química dos plasmalogênios é sensível ao ataque de radicais ao estresse oxidativo31. Os principais produtos de ataque radical são os ácidos eicosatetraenóicos hidroxilados, fosfolipídios 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdeídos de vários comprimentos de cadeia, 1-formil-2-aracdonilglicerofosfolipídeo e lisofosfolipídios.
Esses resultados mostram que, dentre as características moleculares baseadas na fórmula molecular total, 100-120 compostos foram significativamente impactados pela exposição ao SC (Figura 3D). A deconvolução detalhada das informações de fragmentação do MS2 e a normalização das intensidades de sinal dos fragmentos permitiram a definição aproximada da quantidade total de cada ácido graxo conjugado (AG) representado em cada classe lipídica (Figura 3E) e a comparação desses dados entre os grupos exposto e controle. Observou-se uma clara diminuição tanto nos AGs totalmente saturados quanto naqueles com apenas algumas insaturações, principalmente no contexto de lisolipídios. Em contraste, os ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) na composição das classes de fosfolipídios PC, PE e PG estavam elevados no grupo CS para todos os momentos. Os casos extremos de PC e PG conjugados com ácido eicosapentanóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA) foram detectados exclusivamente no grupo de exposição 3R4F CS (Figura 3E, cor vermelha).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figura 1: Disposição da placa para distribuição da amostra no ensaio de Bradford. As amostras em branco e padrão são colocadas em triplicata nas colunas 1-3; amostras desconhecidas são colocadas em duplicado nas colunas 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figura 2: Disposição da placa de microtitulação de 96 poços para análise por espectrometria de massa de espingarda. A distribuição das amostras em branco, padrão, desconhecida e CQ para aquisição no modo de ionização positiva é mapeada no lado esquerdo da placa (colunas 1-6); Todas as amostras para o modo de ionização negativa são colocadas à direita (colunas 7-12). Abreviações: pos = positivo; CQ = controle de qualidade; neg = negativo; TB = total em branco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figura 3: Análise lipidômica de pulmões de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Camundongos Apoe−/− foram expostos ao SC do cigarro de referência 3R4F ou ao ar fresco (sham). (A) Concentrações de classes lipídicas e número de espécies lipídicas por classe. Para cada classe, o número de espécies lipídicas quantificadas é dado entre parênteses. Intervalos de confiança médios e de 95% para cada classe lipídica, separadamente para cada tipo de exposição (agregados em três momentos). (B) Gráficos vulcânicos mostrando o tamanho do efeito (mudança log2 dobra) e a significância (valor p ajustado por FDR -log10) das espécies lipídicas quantificadas para a comparação 3R4F CS versus sham nos três momentos. Lipídios significativamente elevados são marcados em amarelo; lipídios significativamente diminuídos são marcados no ciano (valor de p ajustado por FDR < 0,05). (C) Abundância diferencial das 25 espécies lipídicas com as maiores alterações de dobras médias absolutas. As alterações de dobras log2 para a comparação 3R4F CS versus sham são codificadas por cores, e a significância estatística é indicada: *: valor de p ajustado por FDR < 0,01; X: Valor de p ajustado por FDR < 0,05. (D) Gráficos de comparação. Os coeficientes de correlação para as comparações de mudança de dobra são codificados por cores, e o número de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados é indicado (números totais nas margens). Os gráficos de pizza mostram a porcentagem de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados com a mesma direção de mudança (sinal de CF). Asterisk indica uma sobreposição significativa dos lipídios diferencialmente abundantes. (E) Abundância diferencial de AGs conjugados por classe lipídica. Mapa de calor como no painel C para ácidos graxos conjugados com diferenças significativas de abundância entre 3R4F e exposição simulada em todos os três momentos (valor de p ajustado por FDR < 0,05). A quantidade de cada ácido graxo por classe lipídica foi estimada com base nas intensidades de SM2 dos fragmentos de ácidos graxos. Abreviações: CS = fumaça de cigarro; FDR = taxa de descoberta falsa; CF = mudança de dobra; AF = ácidos graxos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalogênica; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidil glicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = esterol/ésteres de colesterol; PCO = fosfatidilcolina plasmalogen; LPC = fosfatidilcolina liso; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentração final de SCQ (mg/mL)</td>
			<td>Solução de BSA a 2 mg/mL (μL)</td>
			<td>Tampão bicarbonato de amônio (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 de 0,125 mg/ml solução</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Esquema de diluição do padrão interno BSA para a curva de calibração do ensaio de Bradford. Abreviação: BSA = albumina de soro bovino.
Informações suplementares: arquivos MFQL usados para identificação lipídica LipidXplorer. O pacote .zip consiste nos arquivos MFQL individuais necessários, cada um nomeado seguindo este padrão: <abreviação de classe lipídica>_<modo de ionização>_MS2.mfql (por exemplo, PE_neg_MS2.mfql). Os nomes de arquivo para identificação do padrão interno rotulado incluem a tag D7(D9) na <abreviação lipídica> (por exemplo, PED7_neg_MS2.mfql). Esses arquivos MFQL são usados para verificar a quantidade de deutério no padrão interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

A lipidômica baseada em espectrometria de massa Shotgun fornece um instantâneo quantitativo sensível de um amplo espectro de classes lipídicas simultaneamente em uma única medição de vários tecidos de roedores.

Shotgun Lipidômica de Tecidos de Roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

O protocolo apresentado permite quantificar uma ampla gama de lipídios em tecidos animais. É uma ferramenta fácil para estudar mecanismos lipídicos e também para identificar biomarcadores que indicam toxicidade precoce em modelos animais. O método fornece um perfil quantitativo de mais de 400 lipídios moleculares em 14 classes lipídicas diferentes em uma ampla variedade de matrizes de amostra com um tempo de tendência de 10 minutos por amostra.Para começar, dilua a alíquota da centrífuga 1 sobrenadante duas vezes a concentração com tampão de bicarbonato de amônio. Após a preparação da curva padrão de albumina de soro bovino, vórtex os tubos padrão e centrifugar os tubos a 18, 200 g por 15 segundos à temperatura ambiente. Dos tubos padrão preparados anteriormente, transfira 6 microlitros de cada um dos brancos, padrões e amostras para uma placa de fundo plano de 96 poços.Em seguida, adicione 250 microlitros do reagente Bradford a cada poço usando uma pipeta multicanal e misture. Após incubar por 5 minutos, meça a absorbância em um comprimento de onda de 595 nanômetros usando um leitor de placas. Prepare tubos de 2 mililitros com 100 microlitros de solução de bicarbonato de amônio em cada tubo do branco total e do padrão interno em branco e mantenha todas as amostras no gelo.Preparar amostras de controle de qualidade, considerando que uma amostra de controle de qualidade é colocada entre cada conjunto de 10 amostras. Adicione 10 microlitros de plasma humano agrupado a tubos de 2 mililitros e, em seguida, coloque 10 microlitros de solução padrão interna em todas as amostras de padrão interno em branco, controle de qualidade e estudo. Adicionar 300 microlitros de mistura de metanol butanol de menos 20 graus Celsius a cada amostra e agitar a 450 g durante 10 minutos à temperatura ambiente em termomisturador.Em seguida, adicione 300 microlitros da mistura de acetato de etila heptano e agite a 450 g por 10 minutos à temperatura ambiente no termomisturador, em seguida, adicione 300 microlitros de mistura de ácido ascético a 1% e agite por 5 minutos a 450 g à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 g por 5 minutos à temperatura ambiente e transferir 360 microlitros da fase superior para um novo tubo autoblocante de 2 mililitros rotulado como 2. Depois de adicionar 320 microlitros de acetato de etila de heptano ao tubo de fase de água rotulado como 1, agitar a 450 g durante 5 minutos à temperatura ambiente no termomisturador e, em seguida, centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos à temperatura ambiente, como demonstrado anteriormente.Transfira 320 microlitros da fase superior e combine-os com a fração da etapa anterior no tubo 2. Da mesma forma, adicionar 250 microlitros de acetato de etila de heptano à fase aquosa no tubo 1 e agitar a 450 g por 5 minutos à temperatura ambiente no termomisturador. Novamente, centrifugar a 2.800 g por 5 minutos à temperatura ambiente, depois transferir 200 microlitros da fase superior e combiná-la com as frações das etapas anteriores no tubo 2.Evaporar até secar a 35 graus Celsius em um concentrador a vácuo e dissolver novamente em 300 microlitros de solução de mistura MS. Vórtice cada tubo por 5 segundos para garantir que tudo esteja dissolvido e centrifugue a 18, 200 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Transfira uma alíquota de 50 microlitros para a placa de microlitros para análise do modo de ionização positiva e dilua com 50 microlitros de solução de mistura MS.Novamente, diluir com 80 microlitros de mistura MS e transferir uma alíquota de 20 microlitros para a placa MTP para análise do modo de ionização negativa. Embrulhe a placa com papel alumínio e mantenha a 4 graus Celsius antes da análise. Calibrar um MS nos modos positivo e negativo de acordo com as instruções do fabricante 5 dias ou menos antes da análise.Instale a nanofonte de infusão direta antecipadamente, garantindo que ela esteja devidamente alinhada contra o capilar de transferência do MS e um chip de bico de 4,1 micrômetros no suporte do chip, em seguida, verifique os parâmetros para infusão positiva e negativa correspondentes a uma pressão de gás de 1,25 psi, tensão de fonte de 1,1 quilovolt, 5 microlitros de volume de injeção de amostra, fechamento de contato de saída Rel1 por 2,5 segundos, 5 minutos de tempo de entrega, resfriamento da placa a 4 graus Celsius, em seguida, configure o controlador de temperatura e crie uma nova placa. Para o modo positivo, verifique e ajuste o software se o método MS está configurado com uma temperatura capilar de 250 graus Celsius e o nível de RF da lente S em 65,0. No software Xcalibur, abra o método positivo e verifique se a aquisição completa de MS está configurada de zero a 1 minuto na faixa de 550 a 1.000 m/z com resolução de 140.000 com controle de ganho automatizado de 1 milhão e tempo máximo de injeção de 50 milissegundos.Aplique a massa de bloqueio de 680,48022. Verifique se o método de aquisição MS/MS independente de dados está configurado entre o intervalo de tempo de 1 e 5 minutos com resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 250 m/z. Verifique se o controle de ganho automatizado para MS2 está configurado em 100.000 e um tempo máximo de injeção em 64 milissegundos, uma energia de colisão de 20 NCE, a janela de isolamento em 1 m/z e se uma lista de massa de inclusão de 398 a 1.100 m/z é usada com um passo de massa de 1 Dalton.Para a aquisição em modo negativo, verifique no software de sintonia se o método MS está configurado com a temperatura capilar a 250 graus Celsius no nível de RF da lente S a 65,0 no arquivo de sintonia MS. Em seguida, no software Xcalibur, verifique se o modo de aquisição de varredura completa está configurado de zero a 1 minuto com resolução de 140.000, cobrindo a faixa de 400 a 940 m/z, controle de ganho automatizado de 1 milhão, tempo máximo de injeção de 200 milissegundos e massa de bloqueio de 526,46262. Verifique se a aquisição MS2 no modo DIA está configurada entre 1 e 5 minutos da corrida em uma resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 150 m/z, controle de ganho automatizado de 100.000, 64 milissegundos de tempo máximo de injeção e 35 NCE de energia de colisão usando a lista de massa de inclusão de 400 a 940 com um passo de massa de 1 Dalton.Crie a fila de sequência de análise no software Xcalibur no modo positivo e acione-a, em seguida, crie a sequência no software ChipSoft e inicie a análise enquanto aguarda que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra. Quando a análise em modo positivo estiver concluída, crie a fila de sequência de análise no software Xcalibur no modo negativo e acione-a, em seguida, crie a sequência no software ChipSoft e inicie a análise enquanto aguarda que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra. A concentração total normalizada de lipídios foi identificada e quantificada a partir das 14 classes lipídicas mais abundantes, que foi ligeiramente elevada para as classes lipídicas PE, PEO, PC, PCO, PI e PG e alguma regulação negativa foi observada para os lipídios SM, LPE e PA.Enquanto nenhuma diferença pôde ser vista para TAGs e PS. Esses resultados também mostram que, entre as características moleculares baseadas na fórmula molecular total, 100 a 120 compostos foram significativamente impactados pela exposição à fumaça do cigarro. A deconvolução da fragmentação da MS2 e a normalização das intensidades de sinal dos fragmentos permitiram a definição aproximada da quantidade total de cada ácido graxo conjugado representado em cada vidro lipídico e a comparação desses dados entre os grupos exposto e controle. Observou-se diminuição de ácidos graxos totalmente saturados e poucos insaturados, enquanto os ácidos graxos poli-insaturados na composição das classes fosfolipídicos PC, PE e PG foram elevados no grupo fumaça de cigarro para todos os momentos.Os casos extremos de PC e PG conjugados com ácido eicosapentaenoico e docosahexaenóico foram detectados exclusivamente no grupo de exposição ao 3R4F CS. A pipetagem da amostra e da amostra de CQ deve ser feita com pontas de banda baixa e ser precisa, o que significa que as pontas devem ser verificadas entre cada amostra. A pipetagem da solução padrão interna é crítica e precisa ser precisa.A solução de 1 a 1 metanol diclorometano deve ser manuseada com cuidado e um não plastificante contendo pontas deve ser usado para evitar ter polímeros plásticos nas amostras. As pontas devem ser trocadas entre cada amostra.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Um método para medir RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine modificações nas células e tecidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Bioquímica

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para Caracterização em profundidade e Quantificação de Glutamina e Asparagina em desamidação da espingarda Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometria de massa folha Spray: Uma técnica de ionização ambiente rápida para avaliar diretamente a metabolitos de tecidos vegetais

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnologia de Microarray da proteína extracelular para a deteção de alta taxa de transferência de interações ligante-Receptor de baixa afinidade

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Quantificação da coenzima A em células e tecidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...