Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить исследовательскую группу и особенно отметить техническую помощь и поддержку групп биоисследований и аэрозолей в PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Сингапур, и PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Невшатель, Швейцария. Авторы благодарят Сэма Ансари за управление биобанкингом и выражают признательность за поддержку Синдхуре Бхаргави Гопале Редди за редактирование черновика рукописи.

Все авторы являются сотрудниками компании «Филип Моррис Интернэшнл». Компания «Филип Моррис Интернэшнл» является единственным источником финансирования и спонсором этого проекта.

Сигаретный дым (КС) признан основным фактором риска, связанным с развитием хронических воспалительных заболеваний легких, включая карциному легких, бронхит и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ)1. Помимо воздействия на легкие, воздействие КС играет важную роль в развитии других заболеваний, таких как атеросклеротическая ишемическая болезнь сердца и заболевание периферических сосудов1. Сердечно-сосудистые заболевания, наряду с ХОБЛ, являются первой и третьей по значимости причинами смерти во всем мире, соответственно. Подходы к оценке токсикологического риска исторически основывались на использовании моделей животных, таких как грызуны. Модели крыс и мышей in vivo, предназначенные только для носа или всего тела, обычно используются для изучения долгосрочных последствий воздействия CS.
Например, как правило, 6 месяцев воздействия дыма вызывают гистологические и функциональные нарушения в легких мышей, которые имитируют нарушения заболевания человека, включая эмфизему, ремоделирование дыхательных путей и легочную гипертензию, хотя изменения относительно мягкие по сравнению с теми, которые наблюдаются у длительно курильщиков2. Как в тканях животных, так и в тканях человека в исследованиях наблюдался широкий спектр молекулярных изменений в ответ на воздействие CS, включая реакции окислительного стресса, воспаление и структурные изменения тканей 3,4. Неудивительно, что воздействие CS также оказывает далеко идущее влияние на липидом легких, включая воздействие на липиды сурфактанта, липидные сигнальные медиаторы и структурные липиды 4,5,6.
Чтобы охарактеризовать объемные изменения липидов, вызванные длительным воздействием CS на легкие мышей, мы провели быстрый и количественный масс-спектрометрический анализ прямой инфузии дробовика. После введения метода липидомики дробовика в 2005году 7 этот метод был эффективно использован для расширения наших знаний о липидном клеточном метаболизме 8,9,10 в модельных системах, таких как дрожжи 11, Caenorhabditis elegans12 и Drosophila melanogaster13, а также в широком диапазоне типов образцов млекопитающих, таких как клеточные линии 14, 15,16 различные ткани человека17,18 и грызунов19,20 и биологические жидкости21,22.
За последние десятилетия исследования выявили сложность клеточных реакций на изменения окружающей среды, включая тысячи взаимосвязанных белков, липидов и метаболитов. Это ясно дало понять, что использование современных аналитических методов имеет важное значение для получения углубленного представления о молекулярных механизмах и для раскрытия полной величины экзогенных физиологических воздействий. В этом контексте всеобъемлющие количественные липидные отпечатки, полученные с помощью подходов к липидомике, могут эффективно дополнить наши знания о липидном клеточном метаболизме 8,9,10.
Что касается воздействия CS как фактора риска для ряда заболеваний, токсикологические подходы к оценке риска исторически основывались на использовании моделей животных, таких как грызуны. Дробовик липидомики МС предоставляет быстрый, чувствительный и количественный аналитический инструмент для оценки возмущения липидома в различных типах образцов. Уникальной особенностью липидомики дробовика является автоматизированный анализ с прямой инъекцией общего липидного экстракта с добавлением меченых внутренних стандартов без хроматографического разделения в прибор MS с высоким разрешением с использованием проводящего наночипа, генерирующего наноспрей с ионизацией электрораспылением (ESI)23.
Информация об отношении массы к заряду, которая одновременно получается в режиме MS1, обеспечивает общий липидный след всех интактных эндогенных липидов. Опционально режим MS2/MS3, в котором родительские липидные молекулы фрагментируются и анализируются, предоставляет дополнительную структурную информацию. Анализ данных требует специализированного программного обеспечения и включает в себя деконволюцию спектров и присвоение пиков в объединенных спектрах, что приводит к идентификации липидов и выяснению предполагаемой химической структуры. Кроме того, абсолютное количественное определение может быть выполнено путем добавления меченой смеси внутренних стандартов, содержащей, по меньшей мере, один липидный стандарт для каждого интересующего класса липидов. В целом, с помощью данной методики анализ РС, занимающий несколько минут на образец, может охватывать идентификацию и количественное определение до 800 липидов из 14 классовлипидов 24 в тканях грызунов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Липиды играют жизненно важную роль в качестве основных компонентов всех прокариотических и эукариотических клеток. Постоянные технологические усовершенствования в масс-спектрометрии сделали липидомику мощным аналитическим инструментом для мониторинга липидомных составов тканей как при гомеостатических состояниях, так и при болезненных состояниях. В этой статье представлен пошаговый протокол для метода анализа липидов дробовика, который поддерживает одновременное обнаружение и количественное определение нескольких сотен молекулярных видов липидов в различных образцах тканей и биожидкостей с высокой пропускной способностью. В этом методе используется автоматизированная нанопоточная прямая инъекция общего липидного экстракта, снабженного мечеными внутренними стандартами, без хроматографического разделения в масс-спектрометрический прибор высокого разрешения. Начиная с субмикрограммового количества ткани грызунов, анализ рассеянного склероза занимает 10 минут на образец и охватывает до 400 липидов из 14 классов липидов в легочной ткани мыши. Представленный здесь метод хорошо подходит для изучения механизмов заболевания, а также для выявления и количественного определения биомаркеров, которые указывают на раннюю токсичность или благотворное воздействие на ткани грызунов.

Здесь, в качестве репрезентативных результатов, мы представляем данные, иллюстрирующие, как липидомика дробовика может быть использована для изучения влияния CS на легкие мышей. Протокол анализа липидов дробовика был успешно применен для исследования in vivo для сравнительного анализа двух групп образцов: тканей легких, рассеченных у девяти самок мышей Apoe-/-, подвергшихся воздействию CS (группа 3R4F; положительный контроль), и равного количества мышей, содержащихся в условиях свежего воздуха (фиктивная группа) в качестве отрицательного контроля, собранного через 3 месяца, 4 месяца и 6 месяцев времени воздействия. Животные содержались под фильтрованным и кондиционированным свежим воздухом при температуре 22 °C ± 2 °C и влажности 55% ± 15% и питались гранулированным диетой с гамма-облучением. Световой режим поддерживался на уровне 12 ч в сутки. В каждой клетке содержалось до восьми мышей. Эталонные сигареты 3R4F для обработки воздействия были приобретены в Университете Кентукки для получения аэрозоля 3R4F CS (600 мкг общего аэрозоля твердых частиц TPM/L) для целевой концентрации воздействия, эквивалентной 28 мкг никотина/л.CS дым от сигарет 3R4F производился с использованием 30-портовых ротационных коптильных машин, согласно Phillips et al.27 . В соответствии с Протоколом интенсивного курения Министерства здравоохранения Канады к сигаретам 3R4F применялось 55 мл объема затяжки, одна затяжка в 30 с и 100% закупорка вентиляционных отверстий, чтобы обеспечить достаточное воздействие. Все дополнительные подробности о дизайне исследования были сообщены ранее27,28.
В целом, ~ 400 молекулярных видов липидов из 14 наиболее распространенных классов липидов были идентифицированы и количественно оценены (рис. 3). Общая нормализованная концентрация липидов по классу была немного повышена для классов липидов PE, PEO, PC, PCO, PI и PG, и некоторое снижение наблюдалось для липидов SM, LPE и PA (рис. 3A), в то время как для TAG и PS различий не наблюдалось. Интересно, что повышенные уровни липидов плазмалогена PCO и PEO в группе CS были зарегистрированы в воспалительных клетках29 . Одной из внутриклеточных функций липидов плазмалогена является антиоксидантная активность. При воздействии активных форм кислорода (АФК) и азота (РНС) сообщалось о селективном окислении плазмалогенов по сравнению с диацилфосфолипидами30. Связь с енил-эфиром в химической структуре плазмалогенов чувствительна к радикальной атаке на окислительный стресс31. Основными продуктами радикальной атаки являются гидроксилированные эйкозатетраеновые кислоты, фосфолипиды 2-моноацилглицерина, пентадеканол, муравьиные кислоты, α-гидроксиальдегиды различной длины цепи, 1-формил-2-арахидоноилглицерофосфолипиды и лизофосфолипиды.
Эти результаты показывают, что среди молекулярных особенностей, основанных на общей молекулярной формуле, воздействие CS значительно повлияло на 100-120 соединений (рис. 3D). Детальная деконволюция информации о фрагментации MS2 и нормализация интенсивности сигнала фрагмента позволили приблизительно определить общее количество каждой конъюгированной жирной кислоты (ЖК), представленной в каждом классе липидов (рис. 3E), и сравнить эти данные между группами, подвергшимися воздействию, и контрольной группой. Наблюдалось явное снижение как полностью насыщенных ЖК, так и ненасыщенных ЖК, в основном в контексте лизолипидов. Напротив, полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) в составе классов фосфолипидов PC, PE и PG были повышены в группе CS для всех временных моментов. Крайние случаи ПК и ПГ, конъюгированные с эйкозапентановой (ЭПК) и докозагексаеновой кислотой (ДГК), были обнаружены исключительно в группе воздействия 3R4F CS (рис. 3E, красный цвет).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Рисунок 1: Расположение планшета для распределения образцов в анализе Брэдфорда. Заготовки и стандартные образцы размещаются в трех экземплярах в графах 1-3; Неизвестные образцы помещаются в двух экземплярах в графах 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Рисунок 2: Расположение 96-луночного микротитровального планшета для масс-спектрометрического анализа дробовика. Распределение холостых, стандартных, неизвестных и КК образцов для сбора в режиме положительной ионизации отображено на левой стороне планшета (столбцы 1-6); Все образцы для режима отрицательной ионизации размещены справа (столбцы 7-12). Сокращения: pos = положительный; QC = контроль качества; neg = отрицательный; TB = общее пустое. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Рисунок 3: Анализ липидомики легких мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма. Мыши Apoe-/− подвергались воздействию CS от эталонной сигареты 3R4F или свежего воздуха (фиктивный). А) Концентрации в классе липидов и количество видов липидов в каждом классе. Для каждого класса в скобках указано количество количественных видов липидов. Средние и 95% доверительные интервалы для каждого класса липидов, отдельно для каждого типа воздействия (агрегированные по трем временным точкам). (B) Графики вулканов, показывающие величину эффекта (изменение log2 раза) и значимость (значение p с поправкой на -log10 FDR) количественных видов липидов для сравнения 3R4F CS и фиктивного в три момента времени. Значительно повышенные липиды отмечены желтым цветом; значительно сниженные липиды отмечены в голубом цвете (скорректированное FDR значение p < 0,05). (C) Дифференциальная численность 25 видов липидов с наибольшими абсолютными средними изменениями складок. Изменения log2 fold для сравнения 3R4F CS и фиктивного сравнения имеют цветовую кодировку, и указывается статистическая значимость: *: значение p с поправкой на FDR < 0,01; X: значение p с поправкой на FDR < 0,05. (D) Сравнительные графики. Коэффициенты корреляции для сравнений с кратным изменением имеют цветовую кодировку, и указывается количество общих дифференциально распространенных липидов (общие числа на полях). Круговые диаграммы показывают процент общих дифференциально распространенных липидов с одинаковым направлением изменения (знак FC). Звездочка указывает на значительное перекрытие дифференциально обильных липидов. (E) Дифференцированное содержание конъюгированных ЖК по классу липидов. Тепловая карта, как показано на панели C , для конъюгированных жирных кислот со значительными различиями в численности между 3R4F и фиктивным воздействием во всех трех временных точках (скорректированное FDR значение p < 0,05). Количество каждой жирной кислоты на класс липидов оценивали на основе интенсивности MS2 фрагментов жирных кислот. Сокращения: CS = сигаретный дым; FDR = частота ложных обнаружений; FC = изменение крата; FA = жирные кислоты; ПК = фосфатидилхолин; PS = фосфатидилсерин; TAG = триацилглицерин; SM = сфингомиелин; ПЭО = плазмалоген фосфатидилэтаноламин; ПЭ = фосфатидилэтаноламин; PG = фосфатидилглицерин; PI = фосфатидилинозитол; DAG = диацилглицерин; SE = эфиры стерина/холестерина; PCO = плазмалоген фосфатидилхолин; ЛПК = лизофосфатидилхолин; LPE = лизофосфатидилэтаноламин; PA = фосфатидная кислота. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Конечная концентрация БСА (мг/мл)</td>
			<td>Раствор BSA в дозе 2 мг/мл (мкл)</td>
			<td>Буфер на основе бикарбоната аммония (мкл)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 раствора 0,125 мг/мл</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Таблица 1: Схема разбавления внутреннего стандарта BSA для калибровочной кривой для анализа Брэдфорда. Аббревиатура: BSA = бычий сывороточный альбумин.
Дополнительная информация: Файлы MFQL, используемые для идентификации липидов LipidXplorer. Пакет .zip состоит из отдельных обязательных файлов MFQL, каждый из которых именуется следующим образом: <аббревиатура класса липидов>_<режим ионизации>_MS2.mfql (например, PE_neg_MS2.mfql). Имена файлов для маркированной внутренней стандартной идентификации включают тег D7 (D9) в <аббревиатуру липидов> (например, PED7_neg_MS2.mfql). Эти файлы MFQL используются для проверки количества дейтерия во внутреннем стандарте. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Липидомика на основе масс-спектрометрии дробовика обеспечивает чувствительный количественный снимок широкого спектра классов липидов одновременно в одном измерении из различных тканей грызунов.

Липидомика тканей грызунов

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Представленный протокол позволяет количественно оценить широкий спектр липидов в тканях животных. Это простой инструмент для изучения липидных механизмов, а также для выявления биомаркеров, указывающих на раннюю токсичность на животных моделях. Метод обеспечивает количественный профиль более 400 молекулярных липидов в 14 различных классах липидов в широком спектре матриц образцов с 10-минутным временем тренда на образец.Для начала разбавьте надосадочную жидкость центрифугой аликвот 1 в два раза больше концентрации буфером из бикарбоната аммония. После приготовления стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина переверните стандартные пробирки и центрифугируйте пробирки при 18, 200 г в течение 15 секунд при комнатной температуре. Из стандартных пробирок, подготовленных ранее, перенесите по 6 микролитров каждой заготовки, стандартов и образцов на 96-луночную пластину с плоским дном.Затем добавьте 250 микролитров реагента Брэдфорда в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и перемешайте. После инкубации в течение 5 минут измерьте поглощение на длине волны 595 нанометров с помощью планшетного считывателя. Подготовьте 2 миллилитровые пробирки со 100 микролитрами раствора бикарбоната аммония в каждую пробирку общей заготовки и внутренней стандартной заготовки и храните все образцы на льду.Подготовьте образцы контроля качества, учитывая, что один образец контроля качества помещается между каждым набором из 10 образцов. Добавьте 10 микролитров объединенной человеческой плазмы в 2-миллилитровые пробирки, затем добавьте 10 микролитров внутреннего стандартного раствора во все внутренние стандартные заготовки, образцы контроля качества и исследования. Добавьте 300 микролитров смеси бутанола и метанола минус 20 градусов Цельсия к каждому образцу и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксе.Затем добавьте 300 микролитров смеси гептана этилацетата и взбалтывайте при 450 г в течение 10 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем добавьте 300 микролитров 1%-ной смеси аскетической кислоты и взбалтывайте в течение 5 минут при 450 г при комнатной температуре на термомиксере. Центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре и перелить 360 микролитров верхней фазы в новую 2-миллилитровую самоблокирующуюся пробирку с маркировкой 2. После добавления 320 микролитров гептанэтилацетата в пробирку водной фазы, помеченную как 1, встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере, затем центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, как показано ранее.Перенесите 320 микролитров верхней фазы и соедините их с фракцией из предыдущего шага в пробирку 2. Аналогичным образом добавьте 250 микролитров гептанэтилацетата в водную фазу в пробирке 1 и встряхните при 450 г в течение 5 минут при комнатной температуре на термомиксере. Снова центрифугу при 2 800 г в течение 5 минут при комнатной температуре, затем переносят 200 микролитров верхней фазы и соединяют ее с фракциями из предыдущих этапов в пробирке 2.Выпарить досуха при 35 градусах Цельсия в вакуумном концентраторе и повторно растворить в 300 микролитрах раствора смеси МС. Встряхните каждую пробирку в течение 5 секунд, чтобы убедиться, что все растворилось, и центрифугу при 18, 200 г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия. Перенесите аликвоту 50 мкл в микролитровую пластину для анализа режима положительной ионизации и разбавьте 50 микролитрами раствора смеси МС.Опять же, разбавьте 80 микролитрами смеси MS и перенесите аликвоту из 20 микролитров в пластину MTP для анализа режима отрицательной ионизации. Оберните тарелку фольгой и держите при температуре 4 градуса Цельсия перед анализом. Калибруйте МС как в положительном, так и в отрицательном режимах в соответствии с инструкциями производителя не более чем за 5 дней до анализа.Установите наноисточник прямой инфузии заранее, убедившись, что он правильно выровнен по переносному капилляру MS и чипу сопла 4,1 микрометра в держателе чипа, затем проверьте параметры положительной и отрицательной инфузии, соответствующие давлению газа 1,25 фунта на квадратный дюйм, напряжение источника 1,1 киловольта, 5 микролитров объема впрыска образца, выход контакта замыкания Rel1 на 2,5 секунды, 5 минут времени подачи, охлаждение пластины при 4 градусах Цельсия, затем настройка регулятора температуры и создание новой пластины. Для положительного режима проверьте и настройте программное обеспечение, которое настроено на метод MS с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия и уровнем RF объектива S на уровне 65,0. В программном обеспечении Xcalibur откройте положительный метод и убедитесь, что полное сканирование MS установлено от нуля до 1 минуты в диапазоне от 550 до 1 000 м/з при разрешении 140 000 с автоматической регулировкой усиления 1 миллион и максимальным временем впрыска 50 миллисекунд.Применим замок массой 680.48022. Убедитесь, что независимый от данных метод сбора данных MS/MS настроен в диапазоне времени от 1 до 5 минут с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 250 м/z. Убедитесь, что автоматическая регулировка усиления для MS2 настроена на 100 000, а максимальное время впрыска - на 64 миллисекунды, энергия столкновения - 20 NCE, изолирующее окно - на 1 m/z и что используется список масс включения от 398 до 1 100 м/z с шагом массы 1 Дальтон.Для сбора данных в отрицательном режиме проверьте в программном обеспечении настройки, что метод MS настроен с капиллярной температурой 250 градусов Цельсия на уровне RF объектива S-lens на уровне 65.0 в файле настройки MS. Затем в программном обеспечении Xcalibur убедитесь, что режим сбора данных с полным сканированием настроен от нуля до 1 минуты с разрешением 140 000, охватывающим диапазон от 400 до 940 м/з, автоматическая регулировка усиления 1 миллион, максимальное время впрыска 200 миллисекунд и масса блокировки 526,46262. Убедитесь, что сбор данных MS2 в режиме DIA настроен между 1 и 5 минутами прогона с разрешением 17 500 с фиксированной первой массой 150 м/з, автоматической регулировкой усиления 100 000, 64 миллисекунды максимального времени впрыска и 35 NCE энергии столкновения с использованием списка масс включения от 400 до 940 с шагом массы 1 Дальтон.Создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в положительном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока сбор образца будет инициирован сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Когда анализ положительного режима завершен, создайте очередь последовательности анализа в программном обеспечении Xcalibur в отрицательном режиме и запустите ее, затем создайте последовательность в программном обеспечении ChipSoft и начните анализ, ожидая, пока захват образца будет запущен сигналом замыкания контакта, поступающим от робота прямой инфузии для каждого образца. Общая нормализованная концентрация липидов была идентифицирована и количественно определена из 14 наиболее распространенных классов липидов, которая была немного повышена для классов липидов PE, PEO, PC, PCO, PI и PG, и некоторое снижение регуляции наблюдалось для липидов SM, LPE и PA.В то время как никакой разницы не было видно для тегов и PS. Эти результаты также показывают, что среди молекулярных особенностей, основанных на общей молекулярной формуле, от 100 до 120 соединений были значительно затронуты воздействием сигаретного дыма. Деконволюция фрагментации MS2 и нормализация интенсивности сигнала фрагмента позволили приблизительно определить общее количество каждой конъюгированной жирной кислоты, представленной в каждом липидном стакане, и сравнить эти данные между группами, подвергшимися воздействию, и контрольной группой. Наблюдалось снижение полностью насыщенных и ненасыщенных ненасыщенных жирных кислот, тогда как полиненасыщенные жирные кислоты в составе классов фосфолипидов PC, PE и PG были повышены в группе сигаретного дыма за все моменты времени.Крайние случаи ПК и ПГ, конъюгированные с эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислотой, были выявлены исключительно в группе воздействия 3R4F CS. Пипетирование образца и образца контроля качества должно выполняться с помощью низкочастотных наконечников и быть точным, то есть наконечники должны проверяться между каждым образцом. Пипетирование внутреннего стандартного решения имеет решающее значение и должно быть точным.С раствором 1-1 дихлорметан-метанола следует обращаться осторожно, и следует использовать наконечники, не содержащие пластификатор, чтобы избежать попадания пластиковых полимеров в образцы. Наконечники необходимо менять между каждыми образцами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Enhanced Sample мультиплексирование тканей с использованием комбинированного прекурсорами изотопной метки и изобарической Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging амилоида тканей витражи с светящиеся конъюгированных Oligothiophenes путем использования гиперспектральных конфокальная микроскопия и флуоресценции жизни изображений

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Надежные сравнение уровня белка через ткани и на протяжении развития с использованием стандартизированных количественных западный Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Количественная оценка коэнзима А в клетках и тканях

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Обогащение тканей млекопитающих и ксенопусов с холестерином

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...