Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Los autores desean agradecer al equipo de estudio y reconocer especialmente la asistencia técnica y el apoyo de los equipos de bioinvestigación y aerosoles de PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapur, y PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suiza. Los autores agradecen a Sam Ansari por gestionar el biobanco y agradecen el apoyo de Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy por editar un borrador del manuscrito.

Todos los autores son empleados de Philip Morris International. Philip Morris International es la única fuente de financiación y patrocinador de este proyecto.

El humo del cigarrillo (SC) es reconocido como un principal factor de riesgo asociado al desarrollo de enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón, incluyendo carcinoma pulmonar, bronquitis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)1. Más allá del impacto pulmonar, la exposición al SC juega un papel significativo en el desarrollo de otras enfermedades como la enfermedad arterial coronaria aterosclerótica y la enfermedad vascular periférica1. Las enfermedades cardiovasculares, junto con la EPOC, son la primera y tercera causa de muerte en todo el mundo, respectivamente. Los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Los modelos in vivo de ratas y ratones de cuerpo completo o solo nariz se usan comúnmente para estudiar los efectos a largo plazo de la exposición al CS.
Por ejemplo, generalmente, 6 meses de exposición al humo inducen anomalías histológicas y funcionales en los pulmones murinos que imitan a los de la enfermedad humana, incluyendo enfisema, remodelación de las vías respiratorias e hipertensión pulmonar, aunque los cambios son relativamente leves en comparación con los observados en fumadores humanos a largo plazo2. Tanto en tejidos animales como humanos, los estudios han observado una amplia gama de cambios moleculares en respuesta a la exposición a la CS, incluyendo respuestas al estrés oxidativo, inflamación y cambios estructurales en los tejidos 3,4. No es sorprendente que la exposición a SC también haya sido reportada para tener un impacto de gran alcance en el lipidoma pulmonar, incluyendo efectos sobre los lípidos surfactantes, mediadores de señalización lipídica y lípidos estructurales 4,5,6.
Para caracterizar los cambios lipídicos masivos inducidos por la exposición a largo plazo a SC de los pulmones de ratón, realizamos un análisis de espectrometría de masas de infusión directa rápida y cuantitativa. Después de la introducción del método lipidómico de escopeta en 20057, este método se ha utilizado eficazmente para ampliar nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10 en sistemas modelo como la levadura 11, Caenorhabditis elegans12 y Drosophila melanogaster13, así como en una amplia gama de tipos de muestras de mamíferos como las líneas celulares 14, 15,16 varios humanos17,18 y tejidos de roedores19,20 y fluidos corporales21,22.
En las últimas décadas, los estudios han revelado la complejidad de las respuestas celulares a los cambios ambientales, involucrando miles de proteínas, lípidos y metabolitos interconectados. Esto ha dejado claro que el uso de técnicas analíticas de vanguardia es esencial para obtener una visión en profundidad de las maquinarias moleculares y para descubrir la magnitud total de los impactos fisiológicos exógenos. En este contexto, las huellas dactilares lipídicas exhaustivas y cuantitativas producidas por los enfoques lipidómicos de escopeta pueden aumentar efectivamente nuestro conocimiento sobre el metabolismo celular lipídico 8,9,10.
Con respecto a la exposición a la CS como factor de riesgo para varias enfermedades, los enfoques de evaluación del riesgo toxicológico se han basado históricamente en el uso de modelos animales como los roedores. Shotgun lipidomics MS proporciona una herramienta analítica rápida, sensible y cuantitativa para evaluar la perturbación del lipidoma en numerosos tipos de muestras. La característica única de la lipidómica de escopeta es el análisis automatizado de inyección directa de un extracto lipídico total, enriquecido con estándares internos marcados, sin separación cromatográfica en un instrumento de EM de alta resolución mediante el uso de un nanochip conductor que genera un nanospray de ionización por electrospray (ESI)23.
La información de la relación masa-carga que se adquiere simultáneamente en el modo MS1 proporciona la huella lipídica total de todos los lípidos endógenos intactos. Opcionalmente, el modo MS2/MS3, en el que las moléculas lipídicas originales se fragmentan y analizan, proporciona información estructural adicional. El análisis de datos requiere un software especializado e incluye la deconvolución de espectros y asignaciones de picos en espectros agrupados que conducen a la identificación de lípidos y la elucidación putativa de la estructura química. Además, la cuantificación absoluta se puede realizar mediante la introducción de una mezcla de patrones internos etiquetados que contenga al menos un patrón lipídico por clase de lípidos de interés. En general, con la técnica actual, el análisis de EM que toma unos minutos por muestra puede cubrir la identificación y cuantificación de hasta 800 lípidos de 14 clases de lípidos24 en tejidos de roedores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Los lípidos juegan un papel vital como componentes esenciales de todas las células procariotas y eucariotas. Las constantes mejoras tecnológicas en la espectrometría de masas han hecho de la lipidómica una poderosa herramienta analítica para monitorear las composiciones de lipidomas tisulares en estados homeostáticos y de enfermedad. Este documento presenta un protocolo paso a paso para un método de análisis de lípidos de escopeta que admite la detección y cuantificación simultáneas de unos pocos cientos de especies de lípidos moleculares en diferentes muestras de tejidos y biofluidos a alto rendimiento. Este método aprovecha la inyección directa automatizada de nanoflujo de un extracto lipídico total enriquecido con estándares internos marcados sin separación cromatográfica en un instrumento de espectrometría de masas de alta resolución. A partir de cantidades inferiores a microgramos de tejido de roedores, el análisis de EM toma 10 minutos por muestra y cubre hasta 400 lípidos de 14 clases de lípidos en tejido pulmonar de ratón. El método presentado aquí es muy adecuado para estudiar los mecanismos de la enfermedad e identificar y cuantificar biomarcadores que indican toxicidad temprana o efectos beneficiosos dentro de los tejidos de roedores.

Aquí, como resultados representativos, presentamos datos que ilustran cómo se puede utilizar la lipidómica de escopeta para estudiar los efectos del SC en los pulmones de ratones. El protocolo de análisis de lípidos de escopeta se aplicó con éxito para un estudio in vivo para el análisis comparativo de dos grupos de muestras: tejidos pulmonares disecados de nueve ratones hembra Apoe−/− expuestos a SC (grupo 3R4F; control positivo) y un número igual de ratones mantenidos en condiciones de aire fresco (grupo simulado) como control negativo recogido a los 3 meses, Puntos de tiempo de exposición de 4 meses y 6 meses. Los animales se mantuvieron bajo aire fresco filtrado y acondicionado a 22 °C ± 2 °C de temperatura y 55% ± 15% de humedad y se alimentaron con una dieta de pellets irradiados con rayos gamma. El régimen de luz se mantuvo a las 12 h por día. Se alojaron hasta ocho ratones por cada jaula. Los cigarrillos de referencia 3R4F para el tratamiento de exposición se compraron a la Universidad de Kentucky para generar el aerosol 3R4F CS (600 μg de partículas totales de aerosol TPM / L) para una concentración de exposición objetivo equivalente a 28 μg de nicotina / L.CS el humo de los cigarrillos 3R4F se produjo utilizando máquinas de fumar rotativas de 30 puertos según Phillips et al.27 . Según el Protocolo de Tabaquismo Intensivo de Health Canada, se aplicaron 55 ml de volumen de inhalación, una inhalación por cada 30 s y un bloqueo del 100% de los orificios de ventilación a los cigarrillos 3R4F para proporcionar una exposición suficiente. Todos los detalles adicionales sobre el diseño del estudio han sido reportados previamente27,28.
En general, se identificaron y cuantificaron ~ 400 especies de lípidos moleculares de las 14 clases de lípidos más abundantes (Figura 3). La concentración total normalizada de lípidos por clase fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG, y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA (Figura 3A), mientras que no se observaron diferencias para TAGs y PS. Curiosamente, se han reportado niveles elevados de PCO y lípidos plasmalógenos PEO en el grupo CS en células inflamatorias29 . Una de las funciones intracelulares de los lípidos plasmalógenos es la actividad antioxidante. Bajo exposición a especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno (RNS), se reportó oxidación selectiva de plasmalógenos en comparación con fosfolípidos diacil30. El enlace enil-éter en la estructura química de los plasmalógenos es sensible al ataque radical sobre el estrés oxidativo31. Los principales productos del ataque radical son ácidos eicosatetraenoicos hidroxilados, fosfolípidos de 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdehídos de varias longitudes de cadena, 1-formil-2-araquidonoilglicerofosfolípido y lisofosfolípidos.
Estos resultados muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, 100-120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición a CS (Figura 3D). La deconvolución detallada de la información de fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado (FA) representado en cada clase lipídica (Figura 3E) y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una clara disminución tanto en los FA completamente saturados como en los que tienen solo unas pocas insaturaciones, principalmente en el contexto de los lisolípidos. En contraste, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo CS para todos los puntos temporales. Los casos extremos de PC y PG conjugados con eicosapentanoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA) se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS (Figura 3E, color rojo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figura 1: Diseño de la placa para la distribución de muestras en el ensayo de Bradford. Las muestras en blanco y estándar se colocan por triplicado en las columnas 1-3; Las muestras desconocidas se colocan por duplicado en las columnas 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figura 2: Diseño de placas de la placa de microtitulación de 96 pocillos para análisis de espectrometría de masas de escopeta. La distribución de muestras en blanco, estándar, desconocidas y de control de calidad para su adquisición en el modo de ionización positiva se mapea en el lado izquierdo de la placa (columnas 1-6); Todas las muestras para el modo de ionización negativa se colocan a la derecha (columnas 7-12). Abreviaturas: pos = positivo; QC = control de calidad; neg = negativo; TB = total en blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figura 3: Análisis lipidómico de escopeta de pulmones de ratón expuestos al humo del cigarrillo. Los ratones Apoe−/− fueron expuestos a CS del cigarrillo de referencia 3R4F o aire fresco (simulado). A) Concentraciones de clase lipídica y número de especies lipídicas por clase. Para cada clase, el número de especies lipídicas cuantificadas se indica entre paréntesis. Media e intervalos de confianza del 95% para cada clase de lípidos, por separado para cada tipo de exposición (agregados a lo largo de tres puntos temporales). (B) Gráficos de volcanes que muestran el tamaño del efecto (cambio log2 veces) y la significación (-log10 valor p ajustado por FDR) de las especies lipídicas cuantificadas para la comparación 3R4F CS versus simulada en los tres puntos temporales. Los lípidos significativamente elevados están marcados en amarillo; Los lípidos significativamente disminuidos se marcan en cian (valor de p ajustado por FDR < 0,05). (C) Abundancia diferencial de las 25 especies lipídicas con los mayores cambios absolutos medios en el pliegue. Los cambios en el pliegue log2 para la comparación 3R4F CS versus simulado están codificados por colores, y se indica significación estadística: *: valor de p ajustado por FDR < 0.01; X: El valor de p ajustado por FDR < 0,05. (D) Gráficos de comparación. Los coeficientes de correlación para las comparaciones de cambio de pliegue están codificados por colores, y se indica el número de lípidos diferencialmente abundantes compartidos (números totales en los márgenes). Los gráficos circulares muestran el porcentaje de lípidos diferencialmente abundantes compartidos con la misma dirección de cambio (signo FC). El asterisco indica una superposición significativa de los lípidos diferencialmente abundantes. (E) Abundancia diferencial de AF conjugados por clase lipídica. Mapa de calor como en el panel C para ácidos grasos conjugados con diferencias significativas de abundancia entre 3R4F y exposición simulada en los tres puntos de tiempo (valor de p ajustado por FDR < 0.05). La cantidad de cada ácido graso por clase lipídica se estimó en función de las intensidades MS2 de los fragmentos de ácidos grasos. Abreviaturas: CS = humo de cigarrillo; FDR = tasa de descubrimiento falso; FC = cambio de pliegue; FA = ácidos grasos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalógena; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = ésteres de esteroles/colesterilos; PCO = fosfatidilcolina plasmalógena; LPC = liso fosfatidilcolina; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentración final de BSA (mg/ml)</td>
			<td>Solución de BSA a 2 mg/ml (μL)</td>
			<td>Tampón bicarbonato de amonio (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 de solución de 0,125 mg/ml</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Esquema de dilución del patrón interno BSA para la curva de calibración para el ensayo Bradford. Abreviatura: BSA = albúmina sérica bovina.
Información complementaria: Archivos MFQL utilizados para la identificación de lípidos LipidXplorer. El paquete .zip consta de los archivos MFQL individuales requeridos, cada uno nombrado siguiendo este patrón: <abreviatura de clase lipídica>_<modo de ionización>_MS2.mfql (por ejemplo, PE_neg_MS2.mfql). Los nombres de archivo para la identificación estándar interna etiquetada incluyen la etiqueta D7(D9) en la <abreviatura lipídica> (por ejemplo, PED7_neg_MS2.mfql). Estos archivos MFQL se utilizan para verificar la cantidad de deuterio en el estándar interno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

La lipidómica basada en espectrometría de masas de escopeta ofrece una instantánea cuantitativa sensible de un amplio espectro de clases de lípidos simultáneamente en una sola medición de varios tejidos de roedores.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

El protocolo presentado permite cuantificar una amplia gama de lípidos en tejido animal. Es una herramienta fácil para estudiar los mecanismos lipídicos y también para identificar biomarcadores que indican toxicidad temprana en modelos animales. El método ofrece un perfil cuantitativo de más de 400 lípidos moleculares en 14 clases diferentes de lípidos en una amplia variedad de matrices de muestra con un tiempo de tendencia de 10 minutos por muestra.Para comenzar, diluir la centrífuga alícuota 1 sobrenadante dos veces la concentración con tampón de bicarbonato de amonio. Después de preparar la curva estándar de albúmina sérica bovina, haga un vórtice de los tubos estándar y centrifugue los tubos a 18, 200 g durante 15 segundos a temperatura ambiente. De los tubos estándar preparados previamente, transfiera 6 microlitros cada uno de los espacios en blanco, los estándares y las muestras a una placa de fondo plano de 96 pocillos.A continuación, agregue 250 microlitros del reactivo Bradford a cada pocillo usando una pipeta multicanal y mezcle. Después de incubar durante 5 minutos, mida la absorbancia a una longitud de onda de 595 nanómetros utilizando un lector de placas. Prepare tubos de 2 mililitros con 100 microlitros de solución de bicarbonato de amonio en cada tubo del blanco total en blanco y del blanco estándar interno y mantenga todas las muestras en hielo.Preparar muestras de control de calidad, considerando que se coloca una muestra de control de calidad entre cada conjunto de 10 muestras. Agregue 10 microlitros de plasma humano agrupado a tubos de 2 mililitros, luego ingrese 10 microlitros de solución estándar interna en todas las muestras de estudio y control de calidad y en blanco estándar interno. Agregue 300 microlitros de mezcla de metanol butanol a menos 20 grados centígrados a cada muestra y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador.A continuación, agregue 300 microlitros de mezcla de acetato de etilo de heptano y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego agregue 300 microlitros de mezcla de ácido ascético al 1% y agite durante 5 minutos a 450 g a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y transferir 360 microlitros de la fase superior a un nuevo tubo autoblocante de 2 mililitros etiquetado como 2. Después de agregar 320 microlitros de acetato de etilo de heptano al tubo de fase acuosa etiquetado como 1, agitar a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente como se demostró anteriormente.Transfiera 320 microlitros de la fase superior y combínelos con la fracción del paso anterior en el tubo 2. Del mismo modo, agregue 250 microlitros de acetato de etilo de heptano a la fase acuosa en el tubo 1 y agite a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador. Nuevamente, centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego transferir 200 microlitros de la fase superior y combinarlo con las fracciones de los pasos anteriores en el tubo 2.Evaporar a sequedad a 35 grados centígrados en un concentrador de vacío y volver a disolver en 300 microlitros de solución de mezcla MS. Vortex cada tubo durante 5 segundos para asegurarse de que todo se disuelva y centrifugar a 18, 200 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera una alícuota de 50 microlitros a la placa de microlitros para el análisis del modo de ionización positiva y diluya con 50 microlitros de solución de mezcla MS.Nuevamente, diluya con 80 microlitros de mezcla MS y transfiera una alícuota de 20 microlitros a la placa MTP para el análisis del modo de ionización negativa. Envuelva la placa con papel de aluminio y manténgala a 4 grados centígrados antes del análisis. Calibre un MS tanto en modo positivo como negativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante 5 días o menos antes del análisis.Instale la nanofuente de infusión directa por adelantado, asegurándose de que esté correctamente alineada contra el capilar de transferencia del MS y un chip de boquilla de 4.1 micrómetros en el soporte del chip, luego verifique los parámetros de infusión positiva y negativa correspondientes a una presión de gas de 1.25 psi, voltaje de fuente de 1.1 kilovoltios, 5 microlitros de volumen de inyección de muestra, cierre de contacto de salida Rel1 durante 2,5 segundos, 5 minutos de tiempo de entrega, enfriamiento de la placa a 4 grados centígrados, luego configure el controlador de temperatura y cree una nueva placa. Para el modo positivo, verifique y ajuste el software que el método MS esté configurado con una temperatura capilar de 250 grados centígrados y el nivel de RF de la lente S a 65.0. En el software Xcalibur, abra el método positivo y verifique que la adquisición de MS de escaneo completo esté configurada de cero a 1 minuto en el rango de 550 a 1, 000 m / z a una resolución de 140, 000 con control de ganancia automatizado de 1 millón y tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos.Aplique una masa de bloqueo de 680.48022. Compruebe que el método de adquisición MS/MS independiente de los datos está configurado entre el intervalo de tiempo de 1 y 5 minutos a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 250 m/z. Compruebe que el control de ganancia automatizado para MS2 esté configurado en 100, 000 y un tiempo máximo de inyección en 64 milisegundos, una energía de colisión de 20 NCE, la ventana de aislamiento a 1 m / z y que se use una lista de masa de inclusión de 398 a 1, 100 m / z con un paso de masa de 1 Dalton.Para la adquisición en modo negativo, compruebe en el software de ajuste que el método MS está configurado con la temperatura capilar a 250 grados centígrados en el nivel de RF de lente S a 65.0 en el archivo de sintonización MS. A continuación, en el software Xcalibur, verifique que el modo de adquisición de escaneo completo esté configurado de cero a 1 minuto con una resolución de 140, 000 que cubra el rango de 400 a 940 m / z, control de ganancia automatizado de 1 millón, tiempo máximo de inyección de 200 milisegundos y una masa de bloqueo de 526.46262. Compruebe que la adquisición MS2 en modo DIA se configura entre 1 y 5 minutos de la carrera a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 150 m/z, control de ganancia automatizado de 100.000, 64 milisegundos de tiempo máximo de inyección y 35 NCE de energía de colisión utilizando la lista de masas de inclusión de 400 a 940 con un paso de masa de 1 Dalton.Cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo positivo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Cuando se complete el análisis de modo positivo, cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo negativo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Se identificó y cuantificó la concentración total normalizada de lípidos a partir de las 14 clases de lípidos más abundantes, que fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA.Si bien no se pudo ver ninguna diferencia para TAGs y PS. Estos resultados también muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, de 100 a 120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición al humo del cigarrillo. La deconvolución de la fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado representado en cada vidrio lipídico y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una disminución en los ácidos grasos totalmente saturados y pocos insaturados, mientras que los ácidos grasos poliinsaturados en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo de humo de cigarrillo para todos los puntos temporales.Los casos extremos de PC y PG conjugados con ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS. El pipeteo de la muestra y la muestra de control de calidad debe hacerse con puntas de banda baja y ser precisas, lo que significa que las puntas deben verificarse entre cada muestra. El pipeteo de la solución estándar interna es crítico y debe ser preciso.La solución de 1 a 1 diclorometano metanol debe manejarse con cuidado y se debe usar un no plastificante que contenga puntas para evitar que haya polímeros plásticos en las muestras. Las puntas deben cambiarse entre cada muestra.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Un método para medir el ARN<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Modificaciones en células y tejidos

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Investigación

Bioquímica

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS para la caracterización en profundidad y cuantificación de glutamina y asparagina desamidación en escopeta Proteómica

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Espectrometría de masa de hoja aerosol: Una técnica rápida ionización ambiental evaluar directamente los metabolitos de los tejidos vegetales

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...