Name: shotgun lipidomics of rodent tissues
Uploaded: 2022-11-18T13:00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Författarna vill tacka studiegruppen och särskilt erkänna det tekniska biståndet och stödet från bioforsknings- och aerosolteamen vid PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapore, och PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Schweiz. Författarna tackar Sam Ansari för att ha hanterat biobanken och erkänner stödet från Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy för att redigera ett utkast till manuskriptet.

Alla författare är anställda av Philip Morris International. Philip Morris International är den enda finansieringskällan och sponsorn för detta projekt.

Även om framsteg inom MS har gett en mängd olika metoder för att noggrant övervaka många lipidarter, visade den tidigare lipidprofileringen av olika däggdjursvävnader inte konsekventa resultat och följaktligen är lipidernas specifika vävnadsspecifika funktioner fortfarande oklara. I jämförelse med proteinfunktionell analys, för vilken mer robusta metoder för att slå ut uttrycket av vissa föreningar finns tillgängliga, kan majoriteten av lipider inte selektivt stängas av eller överuttryckas i vävnader, vilket gör den funktionella utvärderingen av lipider svår. Avancerad profilering av vävnadslipidomkoncentrationer kan ge ett alternativt tillvägagångssätt för att identifiera samband mellan cirkulerande lipider och mänskliga sjukdomar.
Vid utvärdering av omfattande lipidomikmetoder som kvalitativt och kvantitativt kan täcka den endogena lipidprofilen hos vilken musvävnad som helst, föredrog vi hagelgevärets lipidomikmetod. I allmänhet är två motsatta typer av provanalys möjliga: antingen en helt oriktad screening av lipider med vätskekromatografi (LC) -baserad separation med ytterligare masspektrometrisk detektion för att avslöja provets totala lipidkomplexitet, eller riktade tillvägagångssätt, som mestadels möjliggör mycket exakt kvantifiering av specifika lipider av intresse. Däremot är det starka inslaget i det presenterade hagelgevärslipidomikarbetsflödet den snabba omfattande täckningen av hundratals endogena lipider från fördefinierade lipidklasser, som fortfarande kan utföras på ett robust semikvantitativt sätt.
Joniseringseffektiviteten hos olika lipidklasser är strukturberoende och kan variera drastiskt beroende på de olika experimentella joniseringsförhållandena. I motsats till LC-baserade separationsmetoder minimerar hagelgevärsanalys dessa skillnader på grund av direkt samtidig infusion av hela lipidextraktet under samma joniseringsförhållanden i MS-instrumentet. Användningen av isotopiskt märkta lipidanaloger eller strukturellt liknande icke-endogena standarder möjliggör semikvantifiering av alla lipidklasser. Hagelgevärslipidomik ger låg variabilitet mellan och inom loppet under MS-analys; Som ett resultat ger denna metod lägre koefficienter för variation21 än oriktade vätskekromatografibaserade metoder, vilket kräver flera standarder för adekvat kvantifiering. Det är viktigt att notera att även om ingen extern kalibreringskurva används i den nuvarande metoden, anses metoden fortfarande vara helt kvantitativ32.
En nivå av märkt intern standard (eller omärkt standard som inte uttrycks endogent) per lipidklass är tillräcklig för kvantifiering av de flesta lipider. Endast ett fåtal publikationer har rapporterat en partiell metodvalidering för en hagelgevärslipidomikmetod. Till exempel i Gryzbek et al.17 och Surma et al.21 utarbetades omvända kalibreringskurvor med hjälp av interna standarder och en fast mängd provmatris. Linjäriteten bedömdes genom linjär regression av logtransformerade lipidmängder och deras intensiteter och rapporterades som R2 respektive lutning. Detektionsgränsen (LOD) och kvantifieringsgränsen (LOQ) bestämdes genom viktad linjär regression baserat på ett signal-brusförhållande på 3 för LOD och 10 för LOQ. För de flesta lipidklasser definierades LOQ mellan 2-9,8 pmol för fettvävnad och 0,05-5μM i plasma. I båda fallen användes icke-endogena enskilda interna standarder per klass för att härleda uppskattningar för alla lipider i klassen. I detta arbete tillhandahåller vi dock inte LOD/LOQ på grund av flera problem: den endogena matrisen är inte föreningsfri och surrogatmatrisen för vävnader är inte tillgänglig - med detta är spiken av små kända mängder standarder inte möjlig. Vi utför inte en klassisk riktad kvantifieringsmetod med användning av en kalibreringskurvserie av en viss förening normaliserad med sin identiska isotopmärkta standard på grund av att det inte finns rena standarder och den mycket begränsade tillgängligheten av isotopiskt märkta lipider. Orbitrap-detektorer utför automatiskt omvandlingen av den transienta signalen genom att tillämpa en Fourier-transformation, och en viss signal är redan ersatt - som ett resultat kommer det lägre koncentrationsområdet endast att vara linjärt ner till någon minimisignal, under vilken molekylen inte längre kan detekteras. Xcalibur-programvarans signal-till-brus-värden beror på molekylens m / z-förhållande; Som ett resultat kommer föreningarna i varje lipidklass, innehållande olika kombinationer av fettsyror, att ha olika ljudvärden. Dessutom är LOQ/LOQ-värden strikt kopplade till typen av matris, och när kvantifiering av lipidomet görs i olika gnagarvävnader bör det återspeglas i bedömningen av LOQ för varje vävnadstyp individuellt.
Faktum är att metoden erbjuder ett högt linjärt dynamiskt kvantifieringsområde på upp till fyra storleksordningar33 och mycket god känslighet för att täcka de viktigaste endogena strukturella lipiderna, vilket kan ökas ytterligare genom tekniska förbättringar i MS-förvärv32. Variationskoefficienterna för de genomsnittliga lipidkoncentrationerna var mestadels under 15%, vilket innebär att hagelgevärslipidomik uppfyller kraven från Food and Drug Administration (FDA) som en metod som ska beaktas för studier av god laboratoriesed (GLP) och god klinisk sed (GCLP)34.
Det måste dock noteras att på grund av deras olika polaritet påverkas vissa lipidklasser mycket mer av bidraget från specifika konjugerade FA. Detta leder till förvrängning av intensitetsresponsen i ekvimolära blandningar som innehåller ett brett spektrum av konjugerade FAs, vilket resulterar i kvantifieringsbias, vilket framhävs av Koivusalo et al.35 för fosfolipidklasser. Observera att dessa författare presenterade data för ett brett spektrum av FA, från 24-48 kedjelängd, vilket sannolikt inte återspeglar situationen i ett verkligt biologiskt prov. Svaret för fleromättade arter var 40% högre än för helt mättade arter, men denna effekt observerades endast för högre koncentrationer. När blandningen gradvis späddes minskade effekten av omättnad gradvis och försvann praktiskt taget vid 0,1 pmol/μl per art. Dessutom gjordes alla mätningar på jonfälla och tripplar kvadrupolinstrument och inte på Q-Exactive-utrustning.
En annan fördel med det presenterade arbetsflödet är dess tekniska flexibilitet, vilket möjliggör anpassning till specifika projektkrav. Till exempel kan alla lipidextraktionsprotokoll - såsom de modifierade Bligh och Dyer 36, metyl tert-butyleter37 eller butanol-metanol38-metoder - användas för att framställa ett totalt lipidextrakt före MS-analys. Huvudbegränsningen för kloroform-metanolextraktion är att den nedre fasen innehåller lipidfraktionen, vilket komplicerar rutinarbete och särskilt automatisering; Dessutom måste toxiciteten hos kloroform beaktas. Tert-butyleterextraktion används ofta för lipidanalys av plasmaprover37, och en automatiserad version har föreslagits21. I det här fallet valde vi BUME-metoden eftersom den ger ännu bättre återvinning för de spikade PG-, PI-, PA- och PS-lipidklasserna38, lägre lösningsmedelsförbrukning och möjligheten till automatisering39, medan de totala koncentrationerna kvantifierade för vävnadsprover extraherade med alla tre metoderna var jämförbara. Dessutom, medan provextraktionen utfördes manuellt i det aktuella arbetet, är det också möjligt att erhålla reproducerbara och exakta resultat från stora provuppsättningar genom automatiserad provberedning och lipidextraktion i ett 96-brunnsformat40,41. Detta gör att man kan genomföra lipidomikanalys i storskaliga kliniska och toxikologiska studier.
I det aktuella arbetet utförde vi MS-förvärvet av positiva och negativa lägen separat utan polaritetsväxling som beskrivs av Schuhmann et al.42. Nanomatsignalens stabilitet är bättre i negativt läge för en något mindre koncentrerad lösning än i positivt läge. Dessutom utvecklade vi en fullt spårbar procedur med konverteringsprogramvara från .raw filer till mzML, vilket ger de värden som ska anges i LipidXplorer-programvaran - med detta krävs inte manuella upplösningslutningsberäkningar. Vi tillämpade också olika brusinställningssubstitutioner eftersom spektras brusnivåer i positivt läge är högre än i negativt läge. Alla steg optimerades för spårbara rutinanalyser med hög genomströmning.
För identifiering kan hagelgevärslipidomikanalys utnyttja det unika beteendet hos olika lipidklasser, som bildar unika addukter i olika polaritetslägen. I denna metod kan PC- och PE-arter med samma molekylmassa som överlappar varandra i det positiva joniseringsläget separeras fullständigt i det negativa joniseringsläget, eftersom PC bildar acetat- eller formiataddukter och PE joniseras i en deprotonerad form. Dessutom är (partiell) strukturell dekonvolution möjlig för metoden som använder inte bara molekylformeln utan också bulkfettsyrastrukturen. Till exempel fungerar FA-identifiering på nivån av totalt kol och totalt omättnadsantal för alla fosfolipider, DAG, TAG och lysofosfolipider. Bottom-up-kvantifieringen av varje isomera form kan delvis utföras för några av fosfolipidklasserna43 men är mycket mer komplex för DAG och TAG på grund av det ojämna signalsvaret hos olika FA i MS2-spektra.
Det är också viktigt att betona behovet av att genomföra lämpliga förfaranden för kvalitetskontroll, helt i linje med de senaste initiativen på detta område44. Eftersom vi vill säkerställa korrekt dataspårbarhet och reproducerbarhet mellan och inom laboratoriet har ett antal steg tagits, såsom korrekt randomisering av proverna för alla steg i analysen, arbete med leverantörscertifierade standardblandningar, inkludering av kvalitetskontrollprover, procedurer för att verifiera batchgodkännande eller avslag och skapandet av en intern databas för att spåra QC-prestanda på lång sikt. I överensstämmelse med dessa initiativ är också behovet av en standardiserad metod för att hantera provstabilitet. I allmänhet påverkas majoriteten av strukturella lipider inte av lipidoxidation, vilket är mer relevant för oxilipiner, oxiderade lipider och fleromättade fettsyror som därför är mycket känsligare för lagrings- och hanteringsförhållanden. Korrekt bedömning av provstabilitet är dock fortfarande en tekniskt utmanande uppgift.
Emellertid, Detta protokoll har en begränsning när det gäller att bestämma submolekylära nivåer av föreningar. Med tanke på att det totala extraktet inte separeras slås alla isoformer av lipider med samma molekylmassa men olika fettsyrasammansättningar samman i MS-analysen. För de flesta klasser är det möjligt att uppnå partiell dekonvolution av strukturen genom att använda fragmenteringsförhållandena för kvarvarande fettsyrafragment i MS2. Den oberoende kvantifieringen av varje isoform är dock fortfarande en särskilt utmanande uppgift på grund av de stora skillnaderna i fragmenteringsbeteenden hos olika isoformer och det faktum att rena kemiska standarder inte finns tillgängliga i tillräckligt stor variation för att definiera kompensationsvärdena. En annan begränsning är att ESI-processen oundvikligen genererar artefakter, vilket resulterar i artificiell generering av toppar för vissa lipider såsom DAG, Pas och FA, vilket kan leda till felaktig kvantifiering.
Därefter sammanfattar vi de mest kritiska delarna av protokollet baserat på vår erfarenhet. Den första är relaterad till det faktum att varje musvävnadstyp har en unik lipidprofil när det gäller både lipidmängd och klassförhållanden. Med detta måste utgångsmängderna för vävnaden baserat på det totala proteininnehållet före extraktion noggrant bestämmas för att inte mätta MS-signalen och inte lämna det dynamiska kvantifieringsområdet på grund av lipidaggregering vid höga koncentrationer33 eller - vid motsatt ytterlighet - för att ge tillräckligt med MS-signal för att täcka de viktigaste lipidföreningarna för varje lipidklass.
Den andra kritiska aspekten är att säkerställa en korrekt inriktning av positionen för nanokällans chiputlopp med direktinfusionens nanokälla med masspektrometerns överföringskapillär. Med tanke på att fullständig kalibrering av masspektrometern i båda lägena utförs varje vecka, kan byte mellan kalibreringskällan och nanokällans chipinställning vara orsaken till dramatisk variation i signalintensitet på grund av felinriktning under installationen.
En annan kritisk del av protokollet är den noggranna hanteringen av den interna standardmixen. Eftersom denna blandning innehåller en betydande mängd diklormetan, när den har öppnats, bör den konsumeras snabbt för att undvika lång lagring och flera användningsområden som leder till avdunstning och artificiell koncentrationsförändring. Dessutom är det viktigt med konsekvent hantering av standardblandningen efter avlägsnande från −20 °C-lagring, eftersom temperaturskillnader kan leda till volyminkonsekvenser under pipettering med luftkuddepipetter. Ett alternativ skulle vara att ersätta diklormetan i standardresuspensionsbufferten med ren metanol, vilket skulle kunna förbättra hanteringsbekvämligheten men kan påverka lösligheten hos vissa lipidklasser negativt och därmed minska kvantifieringsnoggrannheten för dessa lipidklasser.
Den sista kritiska delen är databehandling. Databehandlingsarbetsflödet kombinerar programvarukonverteringen Peak by Peak från .raw till .mzML-format, med tillämpning av MS2-skanningsmedelvärde och MS1- och MS2-brusfiltrering samt toppplockning och datakomprimering. Som ett alternativ kan Proteowizard-programvaran också användas för datakonvertering, men i detta fall måste flera inställningar i LipidXplorer definieras manuellt. All komplexitet hos hagelgevärslipidomik är särskilt koncentrerad på dekonvolutionssteget av direktinsprutade MS1- och MS2-spektra. LipidXplorer-programvaran med öppen källkod importerar de konverterade spektra från mzML-filformat baserat på massnoggrannhet, massupplösning och lutningen på dess förändring med ökande m / z. Programvaran sammanfogar flera individuella MS- och MS/MS-spektra som förvärvats inom en analyskörning. Därefter justerar den enskilda toppar inom olika provkörningar, och i varje kluster av inriktade toppar ersätter den deras massor med deras enda intensitetsviktade genomsnittliga massa, medan deras överflöd i varje datafil förblir orörd. Representativa massor av inriktade toppkluster och individuella toppintensiteter lagras i en huvudskanningsdatabas. Master scan-databasen innehåller alla MS1- och MS2-spektra som genereras för alla prover i batchen och kan dekonvoluteras till lipididentifieringar genom frågor skrivna i molekylär fragmenteringsfrågespråk (MFQL).
Sammantaget täcker metoden identifiering av DAG-, TAG- och SE-lipider baserat på positivt läge och PC-, PE-, PS-, PI-, PA-, PG-, SM-, LPC- och LPE-lipider baserat på negativt lägesförvärv. Under lipididentifiering utförs isotopkorrigering för MS1 och MS2, och justerade intensiteter rapporteras i .xlsx utdatafilen. Alternativt finns flera andra programvaror tillgängliga för att bearbeta hagelgevärsdata, till exempel ALEX45 och LipidHunter46.
Fettsyror - stora kärn- och cellmembrankomponenter - lagras i form av fosfolipider för vidare omvandling till bioaktiva molekyler. De kan omvandlas av lysofosfolipidacyltransferasenzymer till lysofosfolipider genom Lands väg47. LPCAT3-enzymet är till exempel känt för att visa hög specificitet för att införliva AA i lysofosfatidylkolin och lysofosfatidylserinintermediärer. Det relativt höga uttrycket av dessa enzymer rapporterades inom inflammatoriska celler, såsom alveolära makrofager och bronkialepitelceller47, vilket ledde till frisättning av större relativa proportioner av AA-innehållande fosfolipider i dessa celler. Efter deras frigörelse från membranfosfolipider med fosfolipas A2 katalyseras emellertid omvandlingen av PUFA till olika typer av lipidmediatorer av många enzymer48. Vidare kan dessa PUFA bli substratet för produktion av proinflammatoriska och antiinflammatoriska prostaglandiner via verkan av cyklooxygenas (COX) -1 och COX-2-enzymer47. Fosfolipider är en av källorna till lipidmediatorer som frigörs på särskilda platser där dessa mediatorer krävs för att visa sina biologiska effekter.
Lungan är ett komplext organ som består av flera celltyper, var och en spelar överlappande och nischroller för att underlätta normal lungutveckling och funktion. Endast ett fåtal studier har gjorts för att isolera och profilera olika celltyper i musen eller humana lungan (t.ex. alveolära typ 2-celler)49,50; Andra större lungcellstyper har inte karakteriserats. En annan intressant studie51 genomfördes för att isolera och utföra lipidanalys av endotel-, epitel-, mesenkymala och blandade immunceller i muslungan. Det observerades att koncentrationen av PUFAs införlivade i PCO och PG anrikades i immuncellerna. Med tanke på det faktum att CS inducerar en ökning av immunceller i lungan (4-5 gånger), bedömt av bronkoalveolär sköljning (BAL)52, kan de totala lipidförändringarna som observerats i denna studie förklaras av en kumulativ ökning av immuncellsrekrytering i muslungan.
Sammanfattningsvis kan den observerade snedvridningen av enkelomättade fettsyror och PUFAs införlivade i fosfolipider återspegla överskottet av vissa FA i cellen och / eller utgöra en intracellulär resurs av oxilipinprekursorer som överproduceras under oxidativ stress och inflammatoriska tillstånd. Ytterligare uppgifter om fri EPA, DHA och andra oxilipiner är dock nödvändiga för att klargöra denna punkt och ligger utanför tillämpningsområdet för den nuvarande metoden.

Cigarettrök (CS) erkänns som en viktig riskfaktor i samband med utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar i lungan, inklusive lungcancer, bronkit och kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL)1. Utöver lungpåverkan spelar CS-exponering en viktig roll i utvecklingen av andra sjukdomar som aterosklerotisk kranskärlssjukdom och perifer kärlsjukdom1. Hjärt-kärlsjukdom, tillsammans med KOL, är den första respektive tredje vanligaste dödsorsaken i världen. Toxikologiska riskbedömningsmetoder har historiskt sett förlitat sig på användningen av djurmodeller som gnagare. In vivo nos- eller helkroppsmodeller för råttor och möss används ofta för att studera de långsiktiga effekterna av exponering för CS.
Till exempel inducerar i allmänhet 6 månaders rökexponering histologiska och funktionella abnormiteter i murina lungor som efterliknar de av mänsklig sjukdom, inklusive emfysem, luftvägsremodellering och pulmonell hypertension, även om förändringarna är relativt milda jämfört med de som observerats hos långvariga mänskliga rökare2. I både djur- och humanvävnader har studier observerat ett brett spektrum av molekylära förändringar som svar på CS-exponering, inklusive oxidativa stressreaktioner, inflammation och strukturella vävnadsförändringar 3,4. Inte överraskande har CS-exponering också rapporterats ha en långtgående inverkan på lunglipidomet, inklusive effekter på ytaktiva lipider, lipidsignalmediatorer och strukturella lipider 4,5,6.
För att karakterisera de bulklipidförändringar som induceras av den långsiktiga CS-exponeringen av muslungor utförde vi en snabb och kvantitativ masspektrometrianalys med hagelgevärsdirektinfusion. Efter introduktionen av hagelgevärets lipidomikmetod 20057 har denna metod effektivt använts för att utöka vår kunskap om lipidcellulär metabolism 8,9,10 i modellsystem som jäst 11, Caenorhabditis elegans12 och Drosophila melanogaster13, liksom i ett brett spektrum av däggdjursprovtyper såsom cellinjer 14, 15,16 olika mänskliga17,18 och gnagarvävnader19,20 och kroppsvätskor21,22.
Under de senaste decennierna har studier avslöjat komplexiteten hos cellulära svar på miljöförändringar, som involverar tusentals sammankopplade proteiner, lipider och metaboliter. Detta har gjort det klart att användning av toppmoderna analytiska tekniker är avgörande för att få en djupgående bild av de molekylära maskinerna och för att avslöja den fulla omfattningen av exogena fysiologiska effekter. I detta sammanhang kan de omfattande, kvantitativa lipidfingeravtryck som produceras av hagelgevärslipidomikmetoder effektivt öka vår kunskap om lipidcellulär metabolism 8,9,10.
När det gäller CS-exponering som en riskfaktor för flera sjukdomar har toxikologiska riskbedömningsmetoder historiskt sett förlitat sig på användningen av djurmodeller som gnagare. Hagelgevär lipidomik MS tillhandahåller ett snabbt, känsligt och kvantitativt analytiskt verktyg för att bedöma lipidomstörning i många provtyper. Den unika egenskapen hos hagelgevärslipidomik är den automatiserade direktinsprutningsanalysen av ett totalt lipidextrakt spetsat med märkta interna standarder - utan kromatografisk separation i ett högupplöst MS-instrument med hjälp av ett ledande nanochip som genererar en elektrosprayjonisering (ESI) nanospray23.
Mass-till-laddningsförhållandeinformationen som samtidigt förvärvas i MS1-läget ger det totala lipidavtrycket för alla intakta endogena lipider. Eventuellt ger MS2 / MS3-läget, där de ursprungliga lipidmolekylerna fragmenteras och analyseras, ytterligare strukturell information. Dataanalys kräver specialiserad programvara och inkluderar dekonvolution av spektra och topptilldelningar i poolade spektra som leder till lipididentifiering och förmodad kemisk strukturbelysning. Dessutom kan absolut kvantifiering utföras genom spikning av en märkt intern standardblandning som innehåller minst en lipidstandard per lipidklass av intresse. Sammantaget, med den nuvarande tekniken, kan MS-analys som tar några minuter per prov täcka identifiering och kvantifiering av upp till 800 lipider från 14 lipidklasser24 i gnagarvävnader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1, 5, and 2 mL self-lock tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086, 30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mm stainless still beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.1 &#181;m nozzle chip</td>
			<td>Advion</td>
			<td>HD-D-384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>45754-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>14267-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&#160;23209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33065-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650498-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>34856-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>33211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR 96 well plates</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34873-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse pooled plasma</td>
			<td>BioIvt</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse SPLASH standard</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>330710X</td>
			<td>Internal standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 96-flat bottom well transparent plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62409-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spatula</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z560049-300EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Start Bradford 1x Dye reagent</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum diluent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D5197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment/software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoPrep CP02 impactor instrument</td>
			<td>Covaris</td>
<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Magnetic hammer</td>
			
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChipSoft 8.3</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>LipidXplorer 1.2.8.1</td>
			<td>N/A</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to identify lipids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak By Peak</td>
			<td>SpectroSwiss</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoWizard</td>
			<td>ProteoWizard</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-Exactive MS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>High resolution orbitrap mass spectrometer</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen Tissue Lyser II</td>
			<td>Qiagen</td>
<td>.&#160; &#160;</td>		
	<td>Tissue lyser</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac SPD140DDA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Vacuum concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite M nano plus</td>
			<td>Tecan</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Plate reader</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Thermomixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriVersa Nanomate</td>
			<td>Advion Biosciences</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
			<td>Direct infusion nano-source</td>
		
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur 4.3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>.&#160; &#160;</td>
	<td>Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

shotgun lipidomics of rodent tissues

Lipider spelar en viktig roll som väsentliga komponenter i alla prokaryota och eukaryota celler. Ständiga tekniska förbättringar inom masspektrometri har gjort lipidomik till ett kraftfullt analysverktyg för övervakning av vävnadslipidomkompositioner i såväl homeostatiska som sjukdomstillstånd. Denna artikel presenterar ett steg-för-steg-protokoll för en lipidanalysmetod med hagelgevär som stöder samtidig detektion och kvantifiering av några hundra molekylära lipidarter i olika vävnads- och biofluidprover vid hög genomströmning. Denna metod utnyttjar automatiserad nanoflödes direktinjektion av ett totalt lipidextrakt spetsat med märkta interna standarder utan kromatografisk separation i ett högupplöst masspektrometriinstrument. Med utgångspunkt från submikrogram mängder gnagarvävnad tar MS-analysen 10 minuter per prov och täcker upp till 400 lipider från 14 lipidklasser i lungvävnad från mus. Metoden som presenteras här är väl lämpad för att studera sjukdomsmekanismer och identifiera och kvantifiera biomarkörer som indikerar tidig toxicitet eller gynnsamma effekter i gnagarvävnader.

Här presenterar vi som representativa resultat data som illustrerar hur hagelgevärslipidomik kan användas för att studera effekterna av CS på lungorna hos möss. Hagelgevärets lipidanalysprotokoll tillämpades framgångsrikt för en in vivo-studie för jämförande analys av två grupper av prover: lungvävnader dissekerade från nio kvinnliga Apoe−/−-möss exponerade för CS (3R4F-grupp; positiv kontroll) och lika många möss som hölls under friskluftsförhållanden (skengrupp) som negativ kontroll som samlades in vid 3 månader, 4 månader och 6 månaders exponeringstid. Djuren hölls under filtrerad och konditionerad frisk luft vid 22 °C ± 2 °C temperatur och 55 % ± 15 % luftfuktighet och utfodrades med gammabestrålad pelletsdiet. Ljusregimen upprätthölls vid 12 timmar per dag. Upp till åtta möss var inrymda per bur. 3R4F-referenscigaretter för exponeringsbehandlingen köptes från University of Kentucky för att generera 3R4F CS-aerosolen (600 μg TPM/L-aerosol för totala partiklar) för en målexponeringskoncentration motsvarande 28 μg nikotin/L.CS rök från 3R4F-cigaretter producerades med 30-portars roterande rökmaskiner enligt Phillips et al.27 . Baserat på Health Canada Intensive Smoking Protocol applicerades 55 ml puffvolym, en puff per 30 s och 100% blockering av ventilationshål på 3R4F-cigaretter för att ge tillräcklig exponering. Alla ytterligare detaljer om studiedesignen har rapporterats tidigare27,28.
Sammantaget identifierades och kvantifierades ~ 400 molekylära lipidarter från de 14 vanligaste lipidklasserna (figur 3). Den totala normaliserade lipidkoncentrationen per klass var något förhöjd för PE-, PEO-, PC-, PCO-, PI- och PG-lipidklasserna, och viss nedreglering observerades för SM-, LPE- och PA-lipider (figur 3A), medan ingen skillnad kunde ses för TAG och PS. Intressant nog har förhöjda nivåer av PCO- och PEO-plasmalogenlipider i CS-gruppen rapporterats i inflammatoriska celler29 . En av de intracellulära funktionerna hos plasmalogenlipider är antioxidantaktivitet. Vid exponering för reaktivt syre (ROS) och kvävearter (RNS) rapporterades selektiv oxidation av plasmalogen i jämförelse med diacylffolipider30. Enyleterbindningen i plasmalogens kemiska struktur är känslig för radikala angrepp på oxidativ stress31. De viktigaste produkterna av radikal attack är hydroxylerade eikosatetraensyror, 2-monoacylglycerol fosfolipider, pentadekanol, myrsyror, α-hydroxialdehyder med olika kedjelängder, 1-formyl-2-arakidonoylglycerofosfolipid och lysofosfolipider.
Dessa resultat visar att bland de molekylära egenskaperna baserade på den totala molekylformeln påverkades 100-120 föreningar signifikant av CS-exponering (figur 3D). Den detaljerade dekonvolutionen av MS2-fragmenteringsinformationen och normaliseringen av fragmentsignalintensiteterna möjliggjorde en ungefärlig definition av den totala mängden av varje konjugerad fettsyra (FA) representerad i varje lipidklass (figur 3E) och jämförelse av dessa data mellan exponerade och kontrollgrupper. En tydlig minskning av både helt mättade FA och sådana med endast ett fåtal omättnader, främst i samband med lysolipider, observerades. Däremot var fleromättade fettsyror (PUFA) i sammansättningen av PC-, PE- och PG-fosfolipidklasser förhöjda i CS-gruppen för alla tidpunkter. De extrema fallen av PC och PG konjugerade med eikosapentanosyra (EPA) och dokosahexaensyra (DHA) detekterades uteslutande i 3R4F CS-exponeringsgruppen (figur 3E, röd färg).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig01.jpg"> Figur 1: Plattlayout för provfördelning i Bradford-testet. Blindprov och standardprover placeras i tre exemplar i kolumnerna 1–3. Okända prover placeras i två exemplar i kolumnerna 4-11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig02.jpg"> Figur 2: Plattlayout för 96-brunns mikrotiterplatta för analys av hagelgevärets masspektrometri. Fördelningen av blank-, standard-, okänd- och QC-prover för förvärv i positivt joniseringsläge kartläggs på vänster sida av plattan (kolumnerna 1-6); Alla prover för det negativa joniseringsläget placeras till höger (kolumnerna 7-12). Förkortningar: pos = positiv; QC = kvalitetskontroll; neg = negativ; TB = totalt tomt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63726/63726fig03.jpg"> Figur 3: Hagelgevärslipidomikanalys av muslungor utsatta för cigarettrök. Apoe−/− möss utsattes för CS från 3R4F-referenscigaretten eller frisk luft (sham). a) Koncentrationer av lipidklass och antalet lipidarter per klass. För varje klass anges antalet kvantifierade lipidarter inom parentes. Genomsnittliga och 95 % konfidensintervall för varje lipidklass, separat för varje exponeringstyp (aggregerat över tre tidpunkter). (B) Vulkandiagram som visar effektstorleken (log2-faldig förändring) och signifikans (-log10 FDR-justerat p-värde) för de kvantifierade lipidarterna för jämförelsen av 3R4F CS kontra bluff vid de tre tidpunkterna. Signifikant förhöjda lipider är markerade i gult; signifikant minskade lipider markeras i cyan (FDR-justerat p-värde < 0,05). (C) Differentiell förekomst av de 25 lipidarter som har de största absoluta genomsnittliga veckförändringarna. Log2-vikningsförändringar för 3R4F CS kontra skenjämförelse är färgkodade och statistisk signifikans anges: *: FDR-justerat p-värde < 0,01; X: FDR-justerat p-värde < 0,05. d) Jämförelsediagram. Korrelationskoefficienter för jämförelserna av vikningsförändringar är färgkodade och antalet delade differentiellt rikliga lipider anges (totalt antal i marginalerna). Cirkeldiagram visar procentandelen delade differentiellt rikliga lipider med samma förändringsriktning (FC-tecken). Asterisk indikerar en signifikant överlappning av de differentiellt rikliga lipiderna. (E) Differentiell förekomst av konjugerade FA per lipidklass. Värmekarta som i panel C för konjugerade fettsyror med signifikanta överflödsskillnader mellan 3R4F och skenexponering i alla tre tidpunkterna (FDR-justerat p-värde < 0,05). Mängden av varje fettsyra per lipidklass uppskattades baserat på MS2-intensiteterna hos fettsyrafragmenten. Förkortningar: CS = cigarettrök; FDR = falsk upptäcktsfrekvens; FC = vikförändring; FA = fettsyror; PC = fosfatidylkolin; PS = fosfatidylserin; TAG = triacylglycerol; SM = sfingomyelin; PEO = plasmalogenfosfatidyletanolamin, PE = fosfatidyletanolamin, PG = fosfatidylglycerol; PI = fosfatidylinositol; DAG = diacylglycerol; SE = sterol-/kolesterylestrar, PCO = plasmalogenfosfatidylkolin; LPC = lysofosfatidylkolin; LPE = lysofosfatidyletanolamin, PA = fosfatidinsyra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/63726fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>BSA slutlig koncentration (mg/ml)</td>
			<td>BSA-lösning vid 2 mg/ml (μl)</td>
			<td>Ammoniumbikarbonatbuffert (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0.75</td>
			<td>37.5</td>
			<td>62.5</td>
		</tr><tr><td>0.5</td>
			<td>25</td>
			<td>75</td>
		</tr><tr><td>0.25</td>
			<td>12.5</td>
			<td>87.5</td>
		</tr><tr><td>0.125</td>
			<td>12.5</td>
			<td>187.5</td>
		</tr><tr><td>0.0625</td>
			<td>50 av 0,125 mg/ml lösning</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Utspädningsschema för BSA:s interna standard för kalibreringskurvan för Bradford-testet. Förkortning: BSA = bovint serumalbumin.
Kompletterande information: MFQL-filer som används för LipidXplorer lipididentifiering. Det .zip paketet består av de enskilda MFQL-filer som krävs, var och en namngiven enligt det här mönstret: <lipidklassförkortning>__<joniseringsläge>_MS2.mfql (t.ex. PE_neg_MS2.mfql). Filnamnen för märkt intern standardidentifiering inkluderar D7 (D9) -taggen i <lipidförkortningen> (t.ex. PED7_neg_MS2.mfql). Dessa MFQL filer används för att verifiera mängden deuterium i den interna standarden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63726/-_Supplementary%20Information%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues at JoVE.com

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Hagelgevärsmasspektrometribaserad lipidomik ger en känslig kvantitativ ögonblicksbild av ett brett spektrum av lipidklasser samtidigt i en enda mätning från olika gnagarvävnader.

Hagelgevär lipidomik av gnagare vävnader

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Det presenterade protokollet gör det möjligt att kvantifiera ett brett spektrum av lipider i djurvävnad. Det är ett enkelt verktyg att studera lipidmekanismer och även att identifiera biomarkörer som indikerar tidig toxicitet i djurmodeller. Metoden levererar en kvantitativ profil av mer än 400 molekylära lipider i 14 olika lipidklasser i en mängd olika provmatriser med en 10-minuters trendtid per prov.Börja med att späda centrifugalikvot 1 supernatant två gånger koncentrationen med ammoniumbikarbonatbuffert. Efter beredning av standardkurvan för bovint serumalbumin, virvla standardrören och centrifugera rören vid 18, 200 g i 15 sekunder vid rumstemperatur. Från de tidigare förberedda standardrören överförs 6 mikroliter vardera av ämnet, standarderna och proverna till en 96-brunns plattbottenplatta.Tillsätt sedan 250 mikroliter Bradford-reagenset till varje brunn med hjälp av en flerkanalig pipett och blanda. Efter inkubation i 5 minuter, mät absorbansen vid en våglängd på 595 nanometer med hjälp av en plattläsare. Bered 2 ml rör med 100 mikroliter ammoniumbikarbonatlösning i varje rör av det totala blindprovet och det interna standardämnet och håll alla prover på is.Förbered kvalitetskontrollprover, med tanke på att ett kvalitetskontrollprov placeras mellan varje uppsättning av 10 prover. Tillsätt 10 mikroliter poolad human plasma till 2 milliliterrör, spika sedan 10 mikroliter intern standardlösning i alla interna standardämnen, kvalitetskontroll och studieprover. Tillsätt 300 mikroliter minus 20 grader Celsius butanolmetanolblandning till varje prov och skaka vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur på termomixer.Tillsätt sedan 300 mikroliter heptanetylacetatblandning och skaka vid 450 g i 10 minuter vid rumstemperatur på termomixern, tillsätt sedan 300 mikroliter 1% asketisk syrablandning och skaka i 5 minuter vid 450 g vid rumstemperatur på termomixern. Centrifugera vid 2 800 g i 5 minuter vid rumstemperatur och överför 360 mikroliter av den övre fasen till ett nytt 2-milliliter självlåsrör märkt som 2. Efter tillsats av 320 mikroliter heptanetylacetat till vattenfasröret märkt som 1, skaka vid 450 g i 5 minuter vid rumstemperatur på termomixern och centrifugera sedan vid 2 800 g i 5 minuter vid rumstemperatur som visats tidigare.Överför 320 mikroliter av den övre fasen och kombinera dem med fraktionen från föregående steg i rör 2. På samma sätt tillsätt 250 mikroliter heptanetylacetat till vattenfasen i rör 1 och skaka vid 450 g i 5 minuter vid rumstemperatur på termomixern. Centrifugera igen vid 2 800 g i 5 minuter vid rumstemperatur, överför sedan 200 mikroliter av den övre fasen och kombinera den med fraktionerna från föregående steg i rör 2.Indunsta till torrhet vid 35 grader Celsius i en vakuumkoncentrator och lös upp igen i 300 mikroliter MS-blandningslösning. Vortex varje rör i 5 sekunder för att säkerställa att allt är upplöst och centrifugera vid 18 200 g i 5 minuter vid 4 grader Celsius. Överför en alikvot på 50 mikroliter till mikroliterplattan för analys av positivt joniseringsläge och späd med 50 mikroliter MS-blandningslösning.Späd igen med 80 mikroliter MS-blandning och överför en alikvot på 20 mikroliter till MTP-plattan för analys av negativt joniseringsläge. Vik in plattan med folie och håll vid 4 grader Celsius före analysen. Kalibrera en MS både i positiva och negativa lägen i enlighet med tillverkarens instruktioner 5 dagar eller mindre före analysen.Installera nanokällan med direktinfusion i förväg och se till att den är korrekt inriktad mot MS: s överföringskapillär och ett 4,1 mikrometer munstyckschip i chiphållaren och kontrollera sedan parametrarna för positiv och negativ infusion motsvarande ett gastryck på 1,25 psi, källspänning på 1,1 kilovolt, 5 mikroliter provinjektionsvolym, utgångskontaktstängning Rel1 i 2,5 sekunder, 5 minuters leveranstid, plattkylning vid 4 grader Celsius, ställ sedan in temperaturregulatorn och skapa en ny platta. För positivt läge, kontrollera och ställa in programvaran att MS-metoden är inställd med en kapillärtemperatur på 250 grader Celsius och S Lens RF-nivå vid 65,0. I Xcalibur-programvaran öppnar du den positiva metoden och kontrollerar att MS-förvärvet med full skanning är inställt från noll till 1 minut i intervallet 550 till 1 000 m / z vid 140 000 upplösning med automatiserad förstärkningskontroll på 1 miljon och maximal injektionstid på 50 millisekunder.Applicera låsmassa på 680.48022. Kontrollera att den dataoberoende MS/MS-insamlingsmetoden är inställd mellan tidsintervallet 1 och 5 minuter med 17 500 pixlars upplösning med en fast första massa på 250 m/z. Kontrollera att den automatiska förstärkningskontrollen för MS2 är inställd på 100 000 och en maximal injektionstid på 64 millisekunder, en kollisionsenergi på 20 NCE, isoleringsfönstret på 1 m / z och att en inklusionsmasslista från 398 till 1 100 m / z används med ett masssteg på 1 Dalton.För förvärvet i negativt läge, kontrollera i tune-programvaran att MS-metoden är inställd med kapillärtemperaturen vid 250 grader Celsius i S-linsens RF-nivå vid 65,0 i MS-tune-filen. Kontrollera sedan i Xcalibur-programvaran att fullskanningsförvärvsläget är inställt från noll till 1 minut vid 140 000 upplösning som täcker intervallet 400 till 940 m / z, automatiserad förstärkningskontroll på 1 miljon, maximal injektionstid på 200 millisekunder och en låsmassa på 526, 46262. Kontrollera att MS2-förvärvet i DIA-läge är inställt mellan 1 och 5 minuter av körningen med en upplösning på 17 500 med en fast första massa på 150 m / z, automatiserad förstärkningskontroll på 100 000, 64 millisekunder maximal injektionstid och 35 NCE kollisionsenergi med hjälp av inkluderingsmasslistan från 400 till 940 med ett masssteg på 1 Dalton.Skapa analyssekvenskön i Xcalibur-programvaran i positivt läge och utlös den, skapa sedan sekvensen i ChipSoft-programvaran och starta analysen medan du väntar på att provförvärvet ska utlösas av en kontaktstängningssignal som kommer från direktinfusionsroboten för varje prov. När analysen av positivt läge är klar, skapa analyssekvenskön i Xcalibur-programvaran i negativt läge och utlös den, skapa sedan sekvensen i ChipSoft-programvaran och starta analysen medan du väntar på att provförvärvet ska utlösas av en kontaktstängningssignal som kommer från direktinfusionsroboten för varje prov. Den totala normaliserade lipidkoncentrationen identifierades och kvantifierades från de 14 vanligaste lipidklasserna, vilket var något förhöjt för lipidklasserna PE, PEO, PC, PCO, PI och PG och viss nedreglering observerades för SM-, LPE- och PA-lipider.Medan ingen skillnad kunde ses för TAGs och PS. Dessa resultat visar också att bland de molekylära egenskaperna baserade på den totala molekylformeln påverkades 100 till 120 föreningar signifikant av exponering för cigarettrök. Dekonvolutionen av MS2-fragmenteringen och normaliseringen av fragmentsignalintensiteterna möjliggjorde den ungefärliga definitionen av den totala mängden av varje konjugerad fettsyra representerad i varje lipidglas och jämförelse av dessa data mellan exponerade och kontrollgrupper. En minskning av helt mättade och få omättade fettsyror observerades, medan de fleromättade fettsyrorna i sammansättningen av PC-, PE- och PG-fosfolipidklasser var förhöjda i cigarettrökgruppen för alla tidpunkter.De extrema fallen av PC och PG konjugerade med eikosapentaensyra och dokosahexaensyra detekterades uteslutande i 3R4F CS-exponeringsgruppen. Pipettering av provet och QC-provet måste göras med lågbandsspetsar och för att vara korrekt, vilket innebär att spetsarna måste kontrolleras mellan varje prov. Pipetteringen av den interna standardlösningen är kritisk och måste vara korrekt.Lösningen av 1 till 1 diklormetanmetanol måste hanteras med försiktighet och en icke-mjukgörare som innehåller spetsar måste användas för att undvika att ha plastpolymerer i proverna. Spetsarna måste ändras mellan varje prov.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

LERLIC-MS / MS för Djupgående Karakterisering och kvantifiering av glutamin och asparagin Deamidering i Shotgun proteomik

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging Amyloid vävnader färgas med självlysande konjugerade Oligothiophenes av Hyperspektrala Confocal Microscopy och fluorescens livstid Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Anrikning av däggdjursvävnader och Xenopus Oocyter med kolesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...