Name: inner mitochondrial membrane sensitivity to na+ reveals partially segmented functional coq pools
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., dr C. Jimenez e E. R. Martínez-Jimenez per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato da MICIN: RTI2018-099357-B-I00 e HFSP (RGP0016/2018). Il CNIC è sostenuto dall'Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), dal Ministerio de Ciencia, dall'Innovación y Universidades (MCNU) e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figura 2 creata con BioRender.com.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato etico istituzionale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Spagna, in conformità con la direttiva dell'Unione europea del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE) e con il regio decreto spagnolo del 1 ° febbraio 2013 (53/2013). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e la loro sofferenza....

<ol>
	<li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice:+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool.">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li><li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish.">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV.">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li><li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+respiratory+Supercomplex+I+III2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk.">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex.">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+the+mammalian+respirasome.">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li><li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+respiratory+supercomplexes.">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li><li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome.">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290 (2016).</li><li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses.">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).</li><li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance.">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).</li><li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly:+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis.">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li><li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes.">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria.">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li><li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+the+supercomplex:+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li><li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex.">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li><li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex.">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).</li><li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria:+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET.">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).</li><li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CoQH2/CoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency.">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li><li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li><li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly,+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain:+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes.">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li><li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly.">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes.">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li><li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+formation+boosts+respiration.">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).</li><li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c:+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV.">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li><li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I.">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li><li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples.">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).</li><li>B&#246;ckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubm&#252;ller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer.">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li><li>Cordom&#237;, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study.">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li></ol>

Sebbene questo protocollo rappresenti una procedura molto semplice per identificare l'esistenza dei pool di CoQ parzialmente segmentati, ci sono alcuni passaggi critici da prendere in considerazione. I substrati (cioè NADH o succinato) sono preferibilmente aggiunti per ultimi poiché può verificarsi l'autoossidazione di questi composti. Il capovolgimento della cuvetta deve essere attento per evitare la formazione di bolle che potrebbero interferire con la lettura.
Inoltre, la presente tecnic...

Il sistema di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) è la principale via che guida la sintesi dell'adenosina trifosfato (ATP), la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e il consumo di equivalenti riducenti, come nicotinamide adenina dinucleotide (NADH) o succinato, da parte dei mitocondri. Il sistema OXPHOS è composto da cinque complessi proteici: il Complesso I (CI) ossida il NADH e riduce il CoQ in ubichinolo (CoQH2). Il Complesso II (CII) ossida il succinato in fumarato e riduce il CoQ in CoQH2. Il Complesso III (CIII) ossida nuovamente il CoQH2 in CoQ, riducendo il citocromo c (cyt c). Infine, il complesso IV (CIV) ossida cyt c e riduce l'ossigeno in acqua. Questa catena di ossidoriduzione, la cosiddetta catena di trasporto degli elettroni (mETC), è accoppiata al pompaggio di H + attraverso l'IMM, che crea un gradiente elettrochimico utilizzato dal complesso V (CV) per fosforilare l'adenosina difosfato (ADP) in ATP.
I complessi mETC possono essere soli nell'IMM o assemblarsi in strutture quaternarie chiamate supercomplessi. CIV può assemblarsi con CIII, formando il III2+IV o Q-respirasome (in quanto è in grado di respirare in presenza di CoQH2)1,2,3 o formando omodimeri o omooligomeri4. CIII può interagire con CI, formando il supercomplesso I+III25. Infine, CI è anche in grado di interagire con il Q-respirasome, costruendo l'I+III2+IV o N-respirasome (in quanto può respirare consumando NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ e cyt c sono portatori mobili di elettroni incaricati di trasferire elettroni da CI/CII a CIII e da CIII a CIV, rispettivamente. Se i supercomplessi impongano o meno una restrizione locale funzionale per questi vettori è stato oggetto di intenso dibattito negli ultimi due decenni 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, diversi gruppi indipendenti hanno dimostrato che CoQ e cyt c possono essere segmentati funzionalmente in pool nell'IMM. Per quanto riguarda il CoQ, può essere segmentato funzionalmente in uno specifico pool di CoQ per CI (CoQNAD) e un altro pool dedicato agli enzimi FAD-dipendenti (CoQFAD)1,7,12,18,19. Tuttavia, al fine di differenziare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, è stata richiesta la sovraespressione dell'ossidasi alternativa (AOX) e la generazione di specifici mutanti del mtDNA, che possono assemblare CI in assenza di CIII, 1,19,20.
Il meccanismo di produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) durante l'ipossia era sconosciuto fino a poco tempo fa. In caso di ipossia acuta, l'IC subisce la transizione attiva/disattivativa (A/D), che comporta la diminuzione della sua attività di pompaggio H+ della NADH-CoQ ossidoreduttasi. Tale diminuzione del pompaggio H+ acidifica la matrice mitocondriale e dissolve parzialmente i precipitati calcio-fosfato nella matrice mitocondriale, rilasciando Ca2+ solubile. Questo aumento di Ca2+ solubile attiva lo scambiatore Na+/Ca2+ (NCLX), che estrude Ca2+ in cambio di Na+. L'aumento mitocondriale di Na+ interagisce con i fosfolipidi nel lato interno dell'IMM, diminuendone la fluidità e il trasferimento di CoQ tra CII e CIII, producendo infine anione superossido, un segnale redox21. È interessante notare che il trasferimento di CoQ è diminuito solo tra CII e CIII, ma non tra CI e CIII, evidenziando che 1) Na + è stato in grado di modulare solo uno dei pool coQ esistenti nei mitocondri; 2) esistono pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM. Pertanto, un protocollo ampiamente utilizzato per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali può essere utilizzato per valutare l'esistenza dei pool di CoQ menzionati.
L'attuale protocollo si basa sulla misura della riduzione del cyt c ossidato, il substrato del CIII, per assorbanza in presenza di succinato (cioè substrato CII) o NADH (cioè substrato CI). Lo stesso campione è diviso in due, uno dei quali sarà trattato con KCl e l'altro con la stessa concentrazione di NaCl. In questo modo, dato che Na+ diminuisce la fluidità IMM, se coQ esistesse in un pool unico nell'IMM, sia CI+CIII che CII+CIII diminuirebbero in presenza di Na+. Tuttavia, se il CoQ esistesse in pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati, l'effetto di Na+ sarebbe per lo più (o solo) evidente sull'attività CII+CIII, ma non sull'IC+CIII. Come recentemente pubblicato21, Na+ influisce solo sul trasferimento di CoQ tra CII e CIII (Figura 1C,D), ma non tra CI e CIII (Figura 1A,B).
Questo protocollo, insieme a una panoplia di tecniche, è stato utilizzato per confermare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati nell'IMM, uno dedicato all'IC (cioè CoQNAD) e un altro dedicato agli enzimi legati alla FAD (cioè CoQFAD)1,3,7; un'osservazione che, sebbene continui ad essere discussa22, è stata corroborata indipendentemente da diversi gruppi 7,19. Pertanto, il superassemblaggio di CI in supercomplessi influisce sulla mobilità locale del CoQ, facilitandone l'utilizzo da parte del CIII all'interno del supercomplesso 1,7,13,14,23,24,25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10775835001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Manager software</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>version 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>UV/VISJASCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inner mitochondrial membrane sensitivity to na+ reveals partially segmented functional coq pools

I pool di ubichinone (CoQ) nella membrana mitocondriale interna (IMM) sono parzialmente segmentati in enzimi del complesso I o FAD-dipendenti. Tale suddivisione può essere facilmente valutata mediante un saggio comparativo che utilizza NADH o succinato come donatori di elettroni nei mitocondri congelati-scongelati, in cui viene misurata la riduzione del citocromo c (cyt c). Il test si basa sull'effetto di Na+ sull'IMM, diminuendone la fluidità. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi e le attività della succinato-cyt c ossidoreduttasi in presenza di NaCl o KCl. Le reazioni, che si basano sulla miscela di reagenti in una cuvetta in modo graduale, vengono misurate spettrofotometricamente durante 4 minuti in presenza di Na+ o K+. La stessa miscela viene eseguita in parallelo in presenza degli specifici inibitori enzimatici al fine di sottrarre la variazione aspecifica dell'assorbanza. L'attività della NADH-cyt c ossidoreduttasi non diminuisce in presenza di nessuno di questi cationi. Tuttavia, l'attività della succinato-cit c ossidoreduttasi diminuisce in presenza di NaCl. Questo semplice esperimento evidenzia: 1) l'effetto di Na+ nel diminuire la fluidità IMM e il trasferimento di CoQ; 2) che il supercomplesso I+III2 protegge il trasferimento di ubichinone (CoQ) dall'essere influenzato dall'abbassamento della fluidità IMM; 3) che il trasferimento di CoQ tra CI e CIII è funzionalmente diverso dal trasferimento di CoQ tra CII e CIII. Questi fatti supportano l'esistenza di pool di CoQ funzionalmente differenziati nell'IMM e mostrano che possono essere regolati dal mutevole ambiente Na+ dei mitocondri.

I risultati tipici di questo protocollo sono rappresentati di seguito (Figura 3). Poiché l'assorbanza cyt c ridotta si trova a 550 nm, tutti i sottocampioni disinibiti devono mostrare un aumento dell'assorbanza a 550 nm. I sottocampioni inibiti mostrano idealmente una pendenza piatta o leggermente crescente (Figura 3). Le pendenze dei sottocampioni inibiti devono essere sottratte dai sottocampioni disinibiti.
I campioni A e B, entram...

Watch this Scientific Journal Video about Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools at JoVE.com

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Questo protocollo descrive un test comparativo, utilizzando attività complesse mitocondriali CI+CIII e CII+CIII in presenza o assenza di Na+, per studiare l'esistenza di pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati.

La sensibilità della membrana mitocondriale interna a Na+ rivela pool di CoQ funzionali parzialmente segmentati

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Questo protocollo evidenzia il ruolo del sodio come secondo messaggero e mostra anche l'esistenza di pool di ubichinolo parzialmente differenziati. Questa tecnica dimostra un approccio estremamente semplice per lo studio delle piscine di ubichinolo che altrimenti richiede modelli cellulari molto specifici. Questo approccio può essere utilizzato per lo studio del trasferimento di elettroni in altre membrane, in particolare di enzimi all'interno di gocce lipidiche.Dividere i campioni in quattro sottocampioni di 20 microgrammi ciascuno ed etichettarli da A a D.Dividere i campioni A e B in due sottocampioni di 10 microgrammi ciascuno ed etichettarli come A1, A2, B1 e B2. Preparare il buffer C1/C2 come descritto nel protocollo di testo e preriscaldare a 37 gradi Celsius. In una cuvetta da un millilitro, aggiungere ciascuno dei sottocampioni a 30 microlitri di citocromo c e 10 microlitri di malonato. Aggiungere il buffer C1/C2 per portare il volume a 980 microlitri nelle cuvette A1 e B1 e 979 microlitri in A2 e B2. Aggiungere 10 microlitri di cloruro di potassio monofusolare nelle cuvette A1 e A2 e 10 microlitri di cloruro di sodio monofusolare in B1 e B2. Aggiungere un microlitro di rotenone monomillolare nelle cuvette A2 e B2. Subito prima della misurazione, aggiungere 10 microlitri di NADH 10 millimolare in tutte le cuvette.Capovolgere la cuvetta tre volte e posizionarla nello spettrofotometro. Al software allegato, clicca su Misura quindi su Parametri, quindi vai su Generale e imposta i parametri di misura a lunghezza d'onda di 550 nanometri e tempo a quattro minuti di lettura. Fare clic su OK e Start per iniziare l'esperimento.Al termine della misurazione, salvare la pendenza che comprende l'aumento lineare dell'assorbanza facendo clic su File e Salva con nome.Dividere i campioni C e D in due sottocampioni di 10 microgrammi ciascuno ed etichettarli come C1, C2, D1 e D2. Mescolare ciascuno dei sottocampioni in una cuvetta da un millilitro con 30 microlitri di citocromo c e un microlitro di rotenone. Aggiungere il buffer C1/C2 preriscaldato a 37 gradi Celsius per portare il volume a 980 microlitri nelle cuvette C1 e D1 e 970 microlitri in C2 e D2. Aggiungere 10 microlitri di cloruro di potassio monofusolare nelle cuvette C1 e C2 e 10 microlitri di cloruro di sodio monofusolare in D1 e D2. Aggiungere un microlitro di antimicina A da un millimolare nelle cuvette C2 e D2 subito prima della misurazione e 10 microlitri di succinato monomastre in tutte le cuvette. Capovolgere la cuvetta tre volte e posizionarla nello spettrofotometro.Eseguire la misurazione e salvare la pendenza che comprende l'aumento lineare dell'assorbanza alla fine della misurazione. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare l'effetto degli ioni sodio sulla riduzione del citocromo c da parte delle membrane mitocondriali su NADH o aggiunta di succinato. Le tracce di assorbanza generate a 550 nanometri per i campioni A e B sono state corrette per la loro corrispondente inibizione.Queste tracce hanno mostrato una pendenza simile, indicando un'attività simile della NADH-citocromo c ossidoreduttasi. Tuttavia, le tracce per i campioni C e D erano diverse, dimostrando che l'attività della succinato-citocromo c ossidoreduttasi del campione C è superiore a quella del campione D.In fine di normalizzare la quantità di cambiamento misurata con questa tecnica, altri metodi possono essere ulteriormente eseguiti, come l'attività isolata del complesso I, il complesso II o il complesso III. Usando questa tecnica, stiamo esplorando le impostazioni fisiologiche in cui il sodio può essere coinvolto come secondo messaggero.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Display interno-membrana batterica per lo screening di una libreria di frammenti di anticorpi

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Misurazione del consumo dell'ossigeno mitocondriale del fegato e cinetica di perdita del protone per stimare la respirazione mitocondriale nei bovini da latte Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...