Name: inner mitochondrial membrane sensitivity to na+ reveals partially segmented functional coq pools
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools at JoVE.com

Teknik yardım için Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez ve E. R. Martínez-Jimenez'e teşekkür ederiz. Bu çalışma MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ve HFSP (RGP0016/2018) tarafından desteklenmiştir. CNIC, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezidir (SEV-2015-0505). Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Tüm hayvan deneyleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve 22 Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Direktifi (2010/63/UE) ve 1 Şubat 2013 tarihli İspanya Kraliyet Kararnamesi (53/2013) uyarınca İspanya'nın Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Kullanılan hayvan sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.
NOT...

<ol>
	<li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice:+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool.">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li><li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish.">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).</li><li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li><li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV.">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li><li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+respiratory+Supercomplex+I+III2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk.">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes.">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li><li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex.">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li><li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+the+mammalian+respirasome.">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li><li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+respiratory+supercomplexes.">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li><li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome.">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290 (2016).</li><li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses.">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).</li><li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance.">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).</li><li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly:+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis.">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li><li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes.">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li><li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria.">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li><li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+the+supercomplex:+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain.">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li><li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex.">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li><li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex.">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).</li><li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria:+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET.">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).</li><li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CoQH2/CoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency.">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li><li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain.">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li><li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly,+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain.">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li><li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+the+respiratory+supercomplexes:+the+plasticity+model.">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li><li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain:+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes.">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li><li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly.">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li><li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes.">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li><li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercomplex+formation+boosts+respiration.">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).</li><li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c:+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV.">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li><li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I.">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li><li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples.">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).</li><li>B&#246;ckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubm&#252;ller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer.">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li><li>Cordom&#237;, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study.">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li></ol>

Bu protokol, kısmen bölümlere ayrılmış CoQ havuzlarının varlığını tanımlamak için çok basit bir prosedürü temsil etse de, dikkate alınması gereken birkaç kritik adım vardır. Substratlar (yani, NADH veya süksinat), bu bileşiklerin otooksidasyonu meydana gelebileceğinden, tercihen en son eklenir. Cuvette'in çevirmesi, okumaya müdahale edebilecek kabarcıkların oluşumunu önlemek için dikkatli olmalıdır.
Ek olarak, mevcut teknik, bahsetmeye değer birkaç sınırla...

Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sistemi (OXPHOS), adenozin trifosfat (ATP) sentezini, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini ve nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) veya süksinat gibi indirgeyici eşdeğerlerin mitokondri ile tüketimini yönlendiren ana yoldur. OXPHOS sistemi beş protein kompleksinden oluşur: Kompleks I (CI) NADH'yi oksitler ve CoQ'yu ubikinol (CoQH2) içine indirir. Kompleks II (CII), süksinatı fumarata oksitler ve CoQ'yu CoQH2'ye düşürür. Kompleks III (CIII), CoQH 2'yi tekrar CoQ'ya oksitleyerek sitokromc'yi (cyt c) azaltır. Son olarak, kompleks IV (CIV) cyt c'yi oksitler ve suya giden oksijeni azaltır. Elektron taşıma zinciri (mETC) olarak adlandırılan bu oksidoredüksiyon zinciri, adenozin difosfatı (ADP) ATP'ye fosforile etmek için kompleks V (CV) tarafından kullanılan bir elektrokimyasal gradyan oluşturan İBB boyunca H + 'nın pompalanmasıyla birleştirilir.
mETC kompleksleri İBB'de tek başına olabilir veya süperkompleksler adı verilen kuaterner yapılara toplanabilir. CIV CIV ile birleşerek III2+IV veya Q-solunum solunumu oluşturabilir (CoQH 2 varlığında yeniden canlanabildiği için)1,2,3 veya homodimerler veya homooligomerleroluşturabilir 4. CIII CI ile etkileşime girerek süperkompleks I+III2 5'i oluşturabilir. Son olarak, CI ayrıca Q-solunum ile etkileşime girebilir, I + III2 + IV veya N-solunum solunumu (NADH'yi tüketerek nefes alabildiği için) 1,6,7,8,9,10'u inşa edebilir.
CoQ ve cyt c, sırasıyla CI / CII'den CIII'ye ve CIII'den CIV'ye elektron aktarmaktan sorumlu mobil elektron taşıyıcılarıdır. Süper komplekslerin bu taşıyıcılar için işlevsel bir yerel kısıtlama getirip getirmediği, son yirmi yılda 2,7,11,12,13,14,15,16,17 tarihinde yoğun bir tartışma konusu olmuştur. Bununla birlikte, birkaç bağımsız grup, CoQ ve cyt c'nin İBB'deki havuzlara işlevsel olarak bölünebileceğini göstermiştir. CoQ ile ilgili olarak, işlevsel olarak CI için belirli bir CoQ havuzuna (CoQNAD) ve FAD'ye bağımlı enzimlere (CoQFAD) adanmış başka bir havuza ayrılabilir 1,7,12,18,19. Bununla birlikte, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını ayırt etmek için, alternatif oksidazın (AOX) aşırı ekspresyonu ve CIII'nin yokluğunda CI'yi bir araya getirebilen spesifik mtDNA mutantlarının üretilmesi gerekiyordu 1,19,20.
Hipoksi sırasında reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretim mekanizması yakın zamana kadar bilinmiyordu. Akut hipoksi üzerine, CI, H + pompalama NADH-CoQ oksidoredüktaz aktivitesindeki azalmayı içeren aktif / deaktif (A / D) geçişine uğrar. H + pompalamadaki böyle bir azalma, mitokondriyal matrisi asitleştirir ve mitokondriyal matristeki kalsiyum-fosfat çökeltilerini kısmen çözer ve çözünür Ca2 + 'yı serbest bırakır. Çözünür Ca 2+'daki bu artış, Na+ karşılığında Ca 2+'yı ekstrüzyon yapan Na+/Ca 2+ eşanjörünü (NCLX) aktive eder. Mitokondriyal Na + artışı, İBB'nin iç tarafındaki fosfolipitlerle etkileşime girerek akışkanlığını ve CII ile CIII arasındaki CoQ transferini azaltır ve sonunda bir redoks sinyali21 olan süperoksit anyonu üretir. İlginç bir şekilde, CoQ transferi sadece CII ve CIII arasında azaldı, ancak CI ve CIII arasında değil, 1) Na + 'nın mitokondrideki mevcut CoQ havuzlarından sadece birini modüle edebildiğini; 2) İBB'de işlevsel olarak farklılaştırılmış CoQ havuzları var. Bu nedenle, mitokondriyal enzim aktivitelerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılan bir protokol, söz konusu CoQ havuzlarının varlığını değerlendirmek için kullanılabilir.
Mevcut protokol, CIII'in substratı olan oksitlenmiş cyt c'nin, süksinat (yani CII substratı) veya NADH (yani CI substratı) varlığında absorbans yoluyla indirgenmesinin ölçülmesine dayanmaktadır. Aynı numune, biri KCl ile, diğeri aynı NaCl konsantrasyonuna sahip olacak şekilde ikiye ayrılır. Bu şekilde, Na+'nın İBB akışkanlığını azalttığı göz önüne alındığında, CoQ İBB'de benzersiz bir havuzda var olsaydı, hem CI+CIII hem de CII+CIII Na+'nın varlığında azalırdı. Bununla birlikte, CoQ kısmen segmentlere ayrılmış fonksiyonel CoQ havuzlarında mevcut olsaydı, Na + 'nın etkisi çoğunlukla (veya sadece) CII + CIII aktivitesi üzerinde belirgin olurdu, ancak CI + CIII üzerinde belirgin olmazdı. Yakın zamanda yayınlanan21 gibi, Na+ sadece CII ve CIII arasındaki CoQ transferini etkiler (Şekil 1C,D), ancak CI ve CIII arasında etkilemez (Şekil 1A,B).
Bu protokol, bir dizi teknikle birlikte, İBB'de kısmen parçalanmış fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını doğrulamak için kullanılmıştır, biri CI'ye (yani, CoQNAD) ve diğeri FAD'ye bağlı enzimlere (yani, CoQFAD) adanmıştır 1,3,7; 22 tartışılmaya devam etmesine rağmen, birkaç grup tarafından bağımsız olarak doğrulanan bir gözlem 7,19. Bu nedenle, CI'nin süperkomplekslere üst montajı, CoQ'nun yerel hareketliliğini etkiler ve CIII tarafından 1,7,13,14,23,24,25 süperkompleksi içinde kullanımını kolaylaştırır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10775835001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford protein assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>207810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra Manager software</td>
			<td>JASCO</td>
			<td>version 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>UV/VISJASCO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>398055</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inner mitochondrial membrane sensitivity to na+ reveals partially segmented functional coq pools

İç mitokondriyal membrandaki (IMM) ubikinon (CoQ) havuzları kısmen kompleks I veya FAD'ye bağımlı enzimlere bölünmüştür. Bu tür bir alt bölüm, sitokrom c (cyt c) indirgemesinin ölçüldüğü dondurulmuş çözülmüş mitokondride elektron donörü olarak NADH veya süksinat kullanılarak karşılaştırmalı bir tahlil ile kolayca değerlendirilebilir. Tahlil, Na+'nın İBB üzerindeki etkisine dayanıyor ve akışkanlığını azaltıyor. Burada, NaCl veya KCl varlığında NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesini ve süksinat-cyt c oksidoredüktaz aktivitelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bir küvetteki reaktiflerin karışımına kademeli olarak dayanan reaksiyonlar, Na + veya K + varlığında 4 dakika boyunca spektrofotometrik olarak ölçülür. Aynı karışım, absorbanstaki spesifik olmayan değişikliği çıkarmak için spesifik enzim inhibitörlerinin varlığında paralel olarak gerçekleştirilir. NADH-cyt c oksidoredüktaz aktivitesi bu katyonların hiçbirinin varlığında azalmaz. Bununla birlikte, süksinat-sit-c oksidoredüktaz aktivitesi NaCl varlığında azalır. Bu basit deney şunları vurgulamaktadır: 1) Na+'nın İBB akışkanlığını ve CoQ transferini azaltmadaki etkisi; 2) süperkompleks I+III2'nin ubikinon (CoQ) transferini İBB akışkanlığını düşürerek etkilenmekten koruduğunu; 3) CI ve CIII arasındaki CoQ transferinin işlevsel olarak CII ve CIII arasındaki CoQ transferinden farklı olması. Bu gerçekler, İBB'de işlevsel olarak farklılaşmış CoQ havuzlarının varlığını desteklemekte ve mitokondrinin değişen Na + ortamı tarafından düzenlenebileceğini göstermektedir.

Bu protokolden elde edilen tipik sonuçlar aşağıda gösterilmiştir (Şekil 3). Azalmış cyt c absorbansı 550 nm'de bulunduğundan, tüm inhibe edilmemiş alt numuneler 550 nm'de absorbansta bir artış göstermelidir. İnhibe edilmiş alt örnekler ideal olarak düz bir çizgi veya biraz artan bir eğim gösterir (Şekil 3). İnhibe edilmiş alt örneklerden eğimler, inhibe edilmemiş alt numunelerden çıkarılmalıdır.
Her i...

Watch this Scientific Journal Video about Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools at JoVE.com

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Bu protokol, kısmen segmente edilmiş fonksiyonel CoQ havuzlarının varlığını incelemek için Na + 'nın varlığında veya yokluğunda mitokondriyal karmaşık aktiviteler CI + CIII ve CII + CIII kullanan karşılaştırmalı bir tahlili tanımlar.

İç Mitokondriyal Membranın Na+' ya Duyarlılığı Kısmen Segmente Edilmiş Fonksiyonel CoQ Havuzlarını Ortaya Çıkarır

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Bu protokol, sodyumun ikinci bir haberci olarak rolünü vurgular ve ayrıca kısmen farklılaşmış ubikinol havuzlarının varlığını gösterir. Bu teknik, aksi takdirde çok spesifik hücre modelleri gerektiren ubikinol havuzlarının incelenmesi için son derece basit bir yaklaşım göstermektedir. Bu yaklaşım, diğer membranlarda, özellikle lipit damlaları içindeki enzimlerde elektron transferinin incelenmesi için kullanılabilir.Numuneleri her biri 20 mikrogramlık dört alt örneğe bölün ve bunları A ila D.Split numuneleri A ve B'yi her biri 10 mikrogramlık iki alt örneğe bölün ve A1, A2, B1 ve B2 olarak etiketleyin. C1/C2 arabelleğini metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Bir mililitrelik küvette, alt örneklerin her birini 30 mikrolitre sitokrom c ve 10 mikrolitre malonata ekleyin. A1 ve B1 küvetlerinde hacmi 980 mikrolitreye ve A2 ve B2'de 979 mikrolitreye çıkarmak için C1 / C2 tamponu ekleyin. A1 ve A2 küvetlerine 10 mikrolitre tek molar potasyum klorür ve B1 ve B2'ye 10 mikrolitre tek molar sodyum klorür ekleyin. A2 ve B2 küvetlerine bir mikrolitre bir milimolar rotenon ekleyin. Ölçümden hemen önce, tüm küvetlere 10 mikrolitre 10 milimolar NADH ekleyin.Küveti üç kez çevirin ve spektrofotometreye yerleştirin. Ekli bir yazılım, Ölçüm'e ve ardından Parametreler'e tıklayın, ardından Genel'e gidin ve ölçüm parametrelerini 550 nanometre dalga boyuna ve dört dakikalık okumada zamana ayarlayın. Denemeye başlamak için Tamam'a ve Başlat'a tıklayın.Ölçümün sonunda, Dosya üzerine tıklayarak emilimin doğrusal artışını içeren eğimi kaydedin ve C ve D örneklerini her biri 10 mikrogramlık iki alt örneğe kaydedin ve bunları C1, C2, D1 ve D2 olarak etiketleyin. Alt örneklerin her birini bir mililitrelik küvette 30 mikrolitre sitokrom c ve bir mikrolitre rotenon ile karıştırın. C1 ve D1 küvetlerinde hacmi 980 mikrolitreye ve C2 ve D2'de 970 mikrolitreye çıkarmak için 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış C1 / C2 tamponu ekleyin. C1 ve C2 küvetlerine 10 mikrolitre tek molar potasyum klorür ve D1 ve D2'ye 10 mikrolitre tek molar sodyum klorür ekleyin. Ölçümden hemen önce C2 ve D2 küvetlerine bir mikrolitre bir milimolar antimisin A ve tüm küvetlere 10 mikrolitre tek molar süksinat ekleyin. Küveti üç kez çevirin ve spektrofotometreye yerleştirin.Ölçümü gerçekleştirin ve ölçüm sonunda doğrusal absorbans artışını içeren eğimi kaydedin. Bu protokol, sodyum iyonlarının sitokrom c'nin mitokondriyal membranlar tarafından NADH veya süksinat ilavesi üzerine indirgenmesi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıldı. A ve B örnekleri için 550 nanometrede üretilen absorbans izleri, karşılık gelen inhibisyonları için düzeltildi.Bu izler, benzer NADH-sitokrom c oksidoredüktaz aktivitesini gösteren benzer bir eğim gösterdi. Bununla birlikte, C ve D örnekleri için izler farklıydı, bu da örnek C'nin süksinat-sitokrom c oksidoredüktaz aktivitesinin numuneninkinden daha yüksek olduğunu gösterdi D.In bu teknikle ölçülen değişim miktarını normalleştirmek için, izole kompleks I aktivitesi, kompleks II veya kompleks III gibi diğer yöntemler daha da uygulanabilir. Bu tekniği kullanarak, sodyumun ikinci bir haberci olarak dahil olabileceği fizyolojik ayarları araştırıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Karaciğer mitokondrial oksijen tüketimi ve Proton sızıntı kinetik Holstein süt sığır mitokondrial solunum tahmin etmek için ölçme

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitokondriyal Membran Dinamiğinin Yeniden İkasini için Model Membran Platformu

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membran Proteinlerini Hedefleyen Fonksiyonel Analiz ve Antikor Gelişimi için Proteolipozomların Hücresiz Üretimi

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...