Betydningen af denne metode er, at den tillader etiketfrie mikrotubuli at afbilde samtidig med fluorescerende mærkede proteiner ved høje billedhastigheder. Den største fordel ved denne teknik er dens nemme implementering og minimale krav til optiske komponenter. Det omgår også behovet for fluor-4-mærkning af mikrotubuli.
Til at begynde med fremstilles PDMS-polymeren ved at kombinere hærdningsmidlet og baseelastomeren i et masseforhold på 1:10. Bland dem i to minutter, og afgas derefter blandingen i et vakuumkammer, indtil alle bobler forsvinder. Hæld derefter blandingen på masterformen i et cirka 0,5 centimeter tykt lag, pas på at undgå at skabe bobler, og bag blandingen i en forvarmet ovn ved 70 grader Celsius i 40 minutter.
Skær derefter de strukturerede områder af polymeren ud og stans huller i hver ende af kanalen ved hjælp af en PDMS-puncher. Senere skal du rengøre den strukturerede side af PDMS-blokken. Skyl derefter tre gange med isopropanol og methanol efterfulgt af ultrarent vand og føntør overfladen.
Derefter rengøres PDMS ved hjælp af ilt eller luftplasma og placeres det plasmarensede PDMS på et passende rengjort dækglas. Varm det en kogeplade op ved 80 grader Celsius i 15 minutter. Indsæt polyethylenrør med passende størrelse med lav densitet i hullerne, og tilslut udløbsslangen til en 0,5 ml sprøjte.
Derefter strømmer opløsningerne ind i mikrokanalerne ved at nedsænke indløbsrøret i opløsningen og tegne det krævede volumen med sprøjten. Placer prøven på mikroskopstadiet, og tænd epi-belysningslyskilden til IRM-billeddannelse. For at fokusere mikroskopet skal du kigge efter det korrekte brændplan nær PDMS-løsningsgrænsefladen og vælge et synsfelt nær midten af kanalen.
Derefter fremstilles 0,1-mikromolær opløsning af fluorescerende mikroperler i BRB80 og strømmer i mindst et kanalvolumen af mikroperleopløsningen. Overvåg reaktionen via IRM eller TIRF. Når den ønskede tæthed af mikroperler er opnået, vaskes overskydende ud med BRB80.
Flow fortyndede frø ind i reaktionskammeret og overvåg reaktionen gennem IRM. Når den ønskede tæthed af frø er opnået, vaskes overskuddet ud med BRB80. Derefter fremstilles en mikrotubuli forlængelsesblanding indeholdende 12-mikromolær umærket tubulin, en millimolær GTP, fem millimolær DTT i BRB80-buffer.
Derefter strømmes i mindst et kanalvolumen af forlængelsesblandingen, samtidig med at det sikres, at reaktionstemperaturen er 28 grader Celsius. Til at begynde med skal du indstille billedbehandlingsindstillingerne på mikroskopsoftwaren. Start billeddannelsen og flyd kinesinopløsningen ind i kammeret.
Visualiser derefter GFP-mærket kinesin 1 unshrinking microtubules. Når målingen er afsluttet, skal du optage en kort video, hvor scenen langsomt oversættes i en cirkulær eller lateral bevægelse. Medianprojektionen af denne video fungerer som et baggrundsbillede og trækkes fra de rå målinger.
Opret en medianprojektion i ImageJ fra baggrundsoptagelsen ved at klikke på Billede. Vælg derefter indstillingen Stakke, og klik på Z-projekt. Træk derefter medianbaggrundsprojektionen fra de rå billeddata ved at klikke på Behandl og vælg derefter indstillingen Billedberegner, mens du sørger for at kontrollere indstillingen 32-bit float-resultat.
Til billedregistrering skal du vælge en samling mikroperler nær mikrotubuli af interesse og bruge dem til at justere TIRF- og IRM-billederne. For hver perle i denne samling skal du bruge multipunktsmarkeringsværktøjet til at markere den omtrentlige placering i TIRF-kanalen og derefter den tilsvarende placering i IRM-kanalen. Kør derefter den medfølgende ImageJ-makro.
Mikroperler vises som mørke pletter i IRM-kanalen til højre og som lyse pletter i TIRF-kanalen til venstre. Justeringsproceduren overlejrer de to kanaler korrekt ved at lokalisere et udvalg af perler. En kymograf af EGFP-mærkede kinesinmolekyler, der gik mod de krympende ender af mikrotubuli, blev også opnået ved anvendelse af denne protokol.
Når du udfører denne procedure, er det vigtigt at vælge mål for høj numerisk blænde for at opnå total intern refleksion og også for at maksimere indsamlingseffektiviteten og billedkontrasten. Denne metode kan anvendes til billeddannelse i høj opløsning af enkelte fluorescerende molekyler samtidigt inden for den makromolekylære struktur, der er massiv nok til at blive visualiseret af IRM, såsom cellemembran eller actinfilament. Denne protokol giver også en let tilpasningsdygtig procedure til samtidig billeddannelse med enhver kombination af IRM, TIRF og epifluorescens.