इस विधि का महत्व यह है कि यह लेबल-मुक्त सूक्ष्मनलिकाएं को उच्च फ्रेम दरों पर फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन के साथ एक साथ चित्रित करने की अनुमति देता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ इसका आसान कार्यान्वयन और ऑप्टिकल घटकों पर न्यूनतम मांग है। यह सूक्ष्मनलिकाएं के फ्लोरो -4 लेबलिंग की आवश्यकता को भी दरकिनार करता है।
शुरू करने के लिए, इलाज एजेंट और आधार इलास्टोमर को 1: 10 द्रव्यमान अनुपात में जोड़कर पीडीएमएस बहुलक तैयार करें। उन्हें दो मिनट के लिए मिलाएं और फिर मिश्रण को एक वैक्यूम चैंबर में तब तक डीगैस करें जब तक कि सभी बुलबुले गायब न हो जाएं। इसके बाद, मिश्रण को लगभग 0.5-सेंटीमीटर मोटी परत में मास्टर मोल्ड पर डालें, बुलबुले बनाने से बचने के लिए ध्यान रखें, और मिश्रण को 40 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म ओवन में सेंकें।
फिर, बहुलक के संरचित क्षेत्रों को काट लें और पीडीएमएस पंचर का उपयोग करके चैनल के प्रत्येक छोर पर छेद करें। बाद में, PDMS ब्लॉक के संरचित पक्ष को साफ करें। इसके बाद, आइसोप्रोपेनॉल और मेथनॉल के साथ तीन बार कुल्ला करें, इसके बाद अल्ट्राप्योर पानी और सतह को सूखा दें।
इसके बाद, प्लाज्मा ऑक्सीजन या एयर प्लाज्मा का उपयोग करके पीडीएमएस को साफ करता है और प्लाज्मा-साफ पीडीएमएस को उचित रूप से साफ किए गए कवर ग्लास पर रखता है। इसे 80 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट को 15 मिनट के लिए गर्म करें। छेद में उचित आकार के कम घनत्व वाले पॉलीथीन टयूबिंग को सम्मिलित करें और आउटलेट टयूबिंग को 0.5-मिलीलीटर सिरिंज से कनेक्ट करें।
फिर, समाधान में इनलेट ट्यूब को डुबोकर और सिरिंज के साथ आवश्यक मात्रा खींचकर माइक्रोचैनल में समाधान प्रवाहित करें। माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें और आईआरएम इमेजिंग के लिए एपि-रोशनी प्रकाश स्रोत को चालू करें। माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, पीडीएमएस समाधान इंटरफ़ेस के पास सही फोकल प्लेन की तलाश करें और चैनल के केंद्र के पास एक फील्ड-ऑफ-व्यू चुनें।
अगला, BRB80 में फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स का 0.1-माइक्रोमोलर समाधान तैयार करें और माइक्रोबीड समाधान के कम से कम एक चैनल वॉल्यूम में प्रवाह करें। IRM या TIRF के माध्यम से प्रतिक्रिया की निगरानी करें। जब माइक्रोबीड्स का वांछित घनत्व प्राप्त हो जाता है, तो BRB80 के साथ अतिरिक्त को धो लें।
प्रतिक्रिया कक्ष में पतला बीज प्रवाह और आईआरएम के माध्यम से प्रतिक्रिया की निगरानी. जब बीज का वांछित घनत्व प्राप्त हो जाता है, तो BRB80 के साथ अतिरिक्त को धो लें। इसके बाद, एक सूक्ष्मनलिकाएं विस्तार मिश्रण तैयार करें जिसमें 12-माइक्रोमोलर अनलेबल ट्यूबुलिन, एक-मिलीमोलर जीटीपी, बीआरबी 80 बफर में पांच-मिलीमोलर डीटीटी शामिल हैं।
फिर, विस्तार मिश्रण के कम से कम एक चैनल की मात्रा में प्रवाहित करें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रतिक्रिया तापमान 28 डिग्री सेल्सियस है। प्रारंभ करने के लिए, माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर इमेजिंग सेटिंग्स सेट करें. इमेजिंग शुरू करें और कक्ष में kinesin समाधान प्रवाह.
फिर, GFP लेबल kinesin 1 unshrinking सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करें। माप पूरा होने के बाद, एक छोटा वीडियो रिकॉर्ड करें जिसमें चरण को धीरे-धीरे एक परिपत्र या पार्श्व गति में अनुवादित किया जाता है। इस वीडियो का माध्यिका प्रक्षेपण एक पृष्ठभूमि छवि के रूप में काम करेगा और कच्चे माप से घटाया जाएगा।
छवि पर क्लिक करके पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग से ImageJ में एक माध्यिका प्रक्षेपण बनाएँ। फिर, स्टैक्स विकल्प का चयन करें और Z Project पर क्लिक करें। इसके बाद, प्रक्रिया पर क्लिक करके कच्चे छवि डेटा से माध्य पृष्ठभूमि प्रक्षेपण घटाएं और फिर 32-बिट फ्लोट परिणाम विकल्प की जांच करना सुनिश्चित करते हुए विकल्प छवि कैलकुलेटर का चयन करें।
छवि पंजीकरण के लिए, ब्याज के सूक्ष्मनलिकाएं के पास माइक्रोबीड्स का एक संग्रह चुनें और उन्हें टीआईआरएफ और आईआरएम छवियों को संरेखित करने के लिए उपयोग करें। इस संग्रह में प्रत्येक मनका के लिए, TIRF चैनल में अनुमानित स्थान और उसके बाद IRM चैनल में संगत स्थान को चिह्नित करने के लिए multipoint चयन उपकरण का उपयोग करें। उसके बाद, प्रदान की गई ImageJ मैक्रो चलाएँ।
माइक्रोबीड्स दाईं ओर आईआरएम चैनल में अंधेरे धब्बों के रूप में और बाईं ओर टीआईआरएफ चैनल में उज्ज्वल धब्बों के रूप में दिखाई देते हैं। संरेखण प्रक्रिया सही ढंग से मोतियों के एक चयन स्थानीयकरण द्वारा दो चैनलों ओवरले. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं के सिकुड़ते सिरों की ओर चलने वाले ईजीएफपी-लेबल वाले किनेसिन अणुओं का एक काइमोग्राफ भी प्राप्त किया गया था।
इस प्रक्रिया को करते समय, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्राप्त करने के लिए और संग्रह दक्षता और छवि विपरीत को अधिकतम करने के लिए उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों का चयन करना महत्वपूर्ण है। इस विधि का उपयोग मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना के भीतर एक साथ एकल फ्लोरोसेंट अणुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए किया जा सकता है, जो आईआरएम द्वारा कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, जैसे कि सेल झिल्ली या एक्टिन फिलामेंट। यह प्रोटोकॉल भी IRM, TIRF, और epifluorescence के किसी भी संयोजन के साथ एक साथ इमेजिंग के लिए एक आसानी से अनुकूलनीय प्रक्रिया प्रदान करता है।
