この方法の意義は、標識のない微小管を、蛍光標識されたタンパク質と同時に高いフレームレートで画像化することを可能にすることである。この技術の主な利点は、その容易な実装と光学部品に対する最小限の要求です。また、微小管のフルオロ-4標識の必要性を回避します。
まず、硬化剤と主剤エラストマーとを1:10の質量比で組み合わせることによってPDMSポリマーを調製する。それらを2分間混合し、次いですべての気泡が消えるまで真空チャンバ内で混合物を脱気する。その後、気泡を出さないように注意しながら、厚さ約0.5センチのマスターモールドに混合物を注ぎ、摂氏70度の予熱オーブンで40分間焼きます。
次いで、PDMSパンチャーを用いてチャネルの両端にポリマーおよびパンチ孔の構造化領域を切り出す。後で、PDMS ブロックの構造化された側をクリーニングします。続いて、イソプロパノールとメタノールで3回すすぎ、続いて超純水で表面を吹き付けて乾燥させます。
次に、酸素または空気プラズマを使用してPDMSをプラズマ洗浄し、プラズマ洗浄されたPDMSを適切に洗浄されたカバーガラスの上に置きます。それを摂氏80度のホットプレートで15分間加熱する。適切なサイズの低密度ポリエチレンチューブを穴に挿入し、出口チューブを0.5ミリリットルのシリンジに接続します。
次に、入口チューブを溶液に浸漬し、シリンジで必要な体積を描画することによって、溶液をマイクロチャネルに流す。サンプルを顕微鏡ステージに置き、IRMイメージング用の落射照明光源をオンにします。顕微鏡に焦点を合わせるには、PDMSソリューションインターフェースの近くで正しい焦点面を探し、チャンネルの中心付近の視野を選択します。
次に、BRB80中の蛍光マイクロビーズの0.1マイクロモル溶液を調製し、マイクロビーズ溶液の少なくとも1つのチャネル体積に流す。IRM または TIRF を介して反応を監視します。マイクロビーズの所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。
希釈した種子を反応チャンバに流し、IRMを通して反応を監視する。種子の所望の密度が達成されたら、過剰分をBRB80で洗い流す。次に、BRB80緩衝液中で12マイクロモルの非標識チューブリン、1ミリモルのGTP、5ミリモルDTTを含む微小管伸長混合物を調製する。
次いで、反応温度が摂氏28度であることを確認しながら伸長混合物の少なくとも1つの流路体積に流す。まず、顕微鏡ソフトウェアでイメージング設定を行います。イメージングを開始し、キネシン溶液をチャンバーに流します。
次いで、GFP標識キネシン1を収縮していない微小管に可視化する。測定が完了したら、ステージが円形または横方向の動きでゆっくりと平行移動する短いビデオを録画します。このビデオの中央値投影は背景画像として機能し、生の測定値から差し引かれます。
画像をクリックして、背景記録からImageJに中央値投影を作成します。次に、[スタック]オプションを選択し、[Zプロジェクト]をクリックします。次に、[プロセス]をクリックして生の画像データから背景投影の中央値を減算し、[画像計算機]オプションを選択しながら、32ビットのfloat結果オプションを確認します。
画像登録のために、目的の微小管の近くにあるマイクロビーズのコレクションを選択し、それらを使用してTIRFおよびIRM画像を整列させます。このコレクション内の各ビーズについて、マルチポイント選択ツールを使用して、TIRF チャンネル内のおおよその位置をマークし、次に IRM チャンネル内の対応する位置をマークします。次に、指定された ImageJ マクロを実行します。
マイクロビーズは、右側のIRMチャネルにダークスポットとして、左側のTIRFチャネルに明るいスポットとして表示されます。アライメント手順では、ビーズの選択をローカライズすることによって、2つのチャンネルを正しくオーバーレイします。微小管の収縮末端に向かって歩くEGFP標識キネシン分子のキモグラフも、このプロトコルを用いて得られた。
この手順を実行するときは、内部反射全体を達成し、収集効率と画像コントラストを最大化するために、高い開口数目標を選択することが重要です。この方法は、細胞膜やアクチンフィラメントなどのIRMによって可視化できるほど巨大な高分子構造内で同時に単一の蛍光分子の高解像度イメージングに使用することができます。このプロトコルは、IRM、TIRF、およびエピ蛍光の任意の組み合わせによる同時イメージングに容易に適応可能な手順も提供します。
