이 방법의 중요성은 라벨이 없는 미세소관이 높은 프레임 속도로 형광 표지된 단백질과 동시에 이미징될 수 있게 한다는 것이다. 이 기술의 가장 큰 장점은 쉬운 구현과 광학 부품에 대한 최소한의 요구입니다. 또한 미세 소관의 플루오로 -4 라벨링의 필요성을 회피합니다.
시작하여, 경화제와 베이스 엘라스토머를 1:10 질량비로 조합하여 PDMS 중합체를 제조하였다. 두 분 동안 혼합 한 다음 모든 기포가 사라질 때까지 진공 챔버에서 혼합물을 탈기하십시오. 그런 다음 혼합물을 약 0.5cm 두께의 마스터 몰드 위에 붓고 거품이 생기지 않도록주의하고 섭씨 70도의 예열 된 오븐에서 40 분 동안 혼합물을 굽습니다.
이어서, PDMS 펀처를 사용하여 채널의 각 말단에 있는 펀치 구멍과 폴리머의 구조화된 영역을 절단한다. 나중에 PDMS 블록의 구조화된 측면을 정리합니다. 그런 다음 이소프로판올과 메탄올로 세 번 헹구고 초순수로 불어 표면을 건조시킵니다.
다음으로, 플라즈마는 산소 또는 공기 플라즈마를 사용하여 PDMS를 청소하고 플라즈마로 세척된 PDMS를 적절하게 세척된 커버 글라스 위에 놓습니다. 핫 플레이트를 섭씨 80도에서 15 분 동안 가열하십시오. 적절한 크기의 저밀도 폴리에틸렌 튜브를 구멍에 삽입하고 출구 튜브를 0.5 밀리리터 주사기에 연결하십시오.
이어서, 유입 튜브를 용액에 침지시키고 주사기로 필요한 부피를 인출함으로써 용액을 마이크로채널 내로 유동시킨다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 IRM 이미징을 위해 에피 조명 광원을 켭니다. 현미경에 초점을 맞추려면 PDMS 솔루션 인터페이스 근처에서 올바른 초점 평면을 찾고 채널 중심 근처의 시야각을 선택합니다.
다음으로, BRB80 중의 형광 마이크로비드의 0.1-마이크로몰 용액을 제조하고, 마이크로비드 용액의 적어도 하나의 채널 부피로 유동시킨다. IRM 또는 TIRF를 통해 반응을 모니터링합니다. 마이크로비드의 원하는 밀도가 달성되면, 과량의 BRB80을 세척한다.
희석된 종자를 반응 챔버 내로 유동시키고 IRM을 통해 반응을 모니터링한다. 원하는 종자 밀도가 달성되면 BRB80으로 과잉을 씻어 내십시오. 다음에, BRB80 완충액 중의 12-마이크로몰 비표지된 튜불린, 1-밀리몰 GTP, 5-밀리몰 DTT를 함유하는 미세소관 연장 혼합물을 제조하였다.
이어서, 반응 온도가 섭씨 28도임을 보장하면서 연장 혼합물의 적어도 하나의 채널 부피로 유동시킨다. 시작하려면 현미경 소프트웨어에서 이미징 설정을 설정하십시오. 이미징을 시작하고 키네신 용액을 챔버 내로 흐른다.
이어서, GFP 표지된 키네신 1 수축되지 않는 미세소관을 시각화한다. 측정이 완료되면 스테이지가 원형 또는 횡방향 동작으로 천천히 변환되는 짧은 비디오를 녹화합니다. 이 비디오의 중앙값 투영은 배경 이미지 역할을 하며 원시 측정에서 뺍니다.
이미지를 클릭하여 배경 녹화에서 ImageJ의 중간 투영을 만듭니다. 그런 다음 스택 옵션을 선택하고 Z 프로젝트를 클릭하십시오. 그런 다음 프로세스를 클릭하여 원시 이미지 데이터에서 중앙값 배경 투영을 뺀 다음 32 비트 부동 소수점 결과 옵션을 확인하면서 이미지 계산기 옵션을 선택하십시오.
이미지 등록을 위해 관심 있는 미세소관 근처에 있는 마이크로비드 컬렉션을 선택하고 이를 사용하여 TIRF 및 IRM 이미지를 정렬합니다. 이 컬렉션의 각 비드에 대해 다중 점 선택 도구를 사용하여 TIRF 채널의 대략적인 위치를 표시한 다음 IRM 채널에서 해당 위치를 표시합니다. 그런 다음 제공된 ImageJ 매크로를 실행합니다.
마이크로비드는 오른쪽의 IRM 채널에서 어두운 점으로 나타나고 왼쪽의 TIRF 채널에서는 밝은 점으로 나타납니다. 정렬 절차는 선택 비드를 지역화하여 두 채널을 올바르게 오버레이합니다. 미세소관의 수축 말단을 향해 걸어가는 EGFP 표지된 키네신 분자의 키모그래프를 또한 이 프로토콜을 사용하여 수득하였다.
이 절차를 수행할 때는 전체 내부 반사를 달성하고 수집 효율과 이미지 대비를 극대화하기 위해 높은 수치 조리개 목표를 선택하는 것이 중요합니다. 이 방법은 세포막 또는 액틴 필라멘트와 같은 IRM에 의해 시각화될 수 있을 정도로 방대한 거대분자 구조 내에서 동시에 단일 형광 분자의 고분해능 이미징에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 또한 IRM, TIRF 및 epifluorescence의 모든 조합으로 동시 이미징을 위해 쉽게 적응할 수 있는 절차를 제공합니다.
