Betydningen av denne metoden er at den tillater etikettfrie mikrotubuler til bildet samtidig med fluorescerende merkede proteiner med høye bildefrekvenser. Den største fordelen med denne teknikken er enkel implementering og minimale krav til optiske komponenter. Det omgår også behovet for fluor-4 merking av mikrotubuler.
Til å begynne med, forberede PDMS-polymeren ved å kombinere herdemiddelet og baseelastomeren i et 1: 10 masseforhold. Bland dem i to minutter og avfett deretter blandingen i et vakuumkammer til alle bobler forsvinner. Deretter hell blandingen på mesterformen i et ca. 0,5 centimeter tykt lag, pass på å unngå å lage bobler, og stek blandingen i en forvarmet ovn ved 70 grader Celsius i 40 minutter.
Klipp deretter ut de strukturerte områdene av polymeren og hull hull i hver ende av kanalen ved hjelp av en PDMS-stanser. Senere rengjør du den strukturerte siden av PDMS-blokken. Skyll deretter tre ganger med isopropanol og metanol etterfulgt av ultrapure vann og blås tørr overflaten.
Deretter rengjør plasma PDMS ved hjelp av oksygen eller luftplasma og plasser plasmarengjort PDMS på et riktig rengjort dekselglass. Varm den en varm plate ved 80 grader Celsius i 15 minutter. Sett inn polyetylenrør med riktig størrelse med lav tetthet i hullene og koble utløpsslangen til en 0,5 milliliter sprøyte.
Deretter strømmer du løsningene inn i mikrokanalene ved å nedsenke innløpsrøret i løsningen og tegne det nødvendige volumet med sprøyten. Plasser prøven på mikroskopstadiet og slå på lyskilden for epibelysning for IRM-avbildning. Hvis du vil fokusere mikroskopet, ser du etter riktig brennplan i nærheten av PDMS-løsningsgrensesnittet og velger et synsfelt nær midten av kanalen.
Deretter forbereder du 0,1 mikromolaroppløsning av fluorescerende mikrober i BRB80 og strømmer i minst ett kanalvolum av mikrobeadløsningen. Overvåk reaksjonen via IRM eller TIRF. Når ønsket tetthet av mikrober oppnås, vask ut overskuddet med BRB80.
Strømning fortynnet frø inn i reaksjonskammeret og overvåk reaksjonen gjennom IRM. Når ønsket tetthet av frø oppnås, vask ut overskuddet med BRB80. Deretter forbereder du en mikrotubul forlengelsesblanding som inneholder 12-mikromolar umerket tubulin, en millimolar GTP, fem millimolar DTT i BRB80 buffer.
Deretter strømmer du i minst ett kanalvolum av forlengelsesblandingen samtidig som reaksjonstemperaturen er 28 grader Celsius. Angi bildeinnstillingene på mikroskopprogramvaren for å begynne. Start avbildningen og strømning kinesinoppløsningen inn i kammeret.
Deretter visualiserer du GFP-merkede kinesin 1 unshrinking mikrotubules. Etter at målingen er fullført, ta opp en kort video der scenen sakte oversettes i en sirkulær eller lateral bevegelse. Medianprojeksjonen av denne videoen vil fungere som et bakgrunnsbilde og vil bli trukket fra råmålingene.
Lag en median projeksjon i ImageJ fra bakgrunnsopptaket ved å klikke på Bilde. Velg deretter alternativet Stabler og klikk på Z Project. Deretter trekker du median bakgrunnsprojeksjon fra råbildedataene ved å klikke på Prosess og deretter velge alternativet Bildekalkulator samtidig som du sikrer å sjekke 32-biters flytresultatalternativet.
For bilderegistrering velger du en samling mikrober i nærheten av mikrotubulen av interesse og bruker dem til å justere TIRF- og IRM-bildene. For hver perle i denne samlingen bruker du flerpunktsvalgverktøyet til å markere den omtrentlige plasseringen i TIRF-kanalen og deretter den tilsvarende plasseringen i IRM-kanalen. Kjør deretter den medfølgende ImageJ-makroen.
Mikrober vises som mørke flekker i IRM-kanalen til høyre og som lyse flekker i TIRF-kanalen til venstre. Justeringsprosedyren overlapper de to kanalene riktig ved å lokalisere et utvalg perler. En kymograf av EGFP-merkede kinesinmolekyler som gikk mot de krympende endene av mikrotubuler ble også oppnådd ved hjelp av denne protokollen.
Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å velge høye numeriske blendermål for å oppnå total intern refleksjon og også for å maksimere innsamlingseffektiviteten og bildekontrasten. Denne metoden kan brukes til høyoppløselig avbildning av enkelt fluorescerende molekyler samtidig i den makromolekylære strukturen som er massiv nok til å visualiseres av IRM, for eksempel cellemembran eller aktinfilament. Denne protokollen gir også en lett tilpasningsdyktig prosedyre for samtidig avbildning med en hvilken som helst kombinasjon av IRM, TIRF og epifluorescence.