Betydelsen av denna metod är att den tillåter etikettfria mikrotubuli till de avbildade samtidigt med fluorescerande märkta proteiner vid höga bildhastigheter. Den största fördelen med denna teknik är dess enkla implementering och minimala krav på optiska komponenter. Det kringgår också behovet av fluor-4-märkning av mikrotubuli.
För att börja, förbered PDMS-polymeren genom att kombinera härdningsmedlet och baselastomeren i ett massförhållande på 1:10. Blanda dem i två minuter och avgasa sedan blandningen i en vakuumkammare tills alla bubblor försvinner. Häll sedan blandningen på huvudformen i ett cirka 0,5 centimeter tjockt lager, var noga med att undvika att skapa bubblor och baka blandningen i en förvärmd ugn vid 70 grader Celsius i 40 minuter.
Skär sedan ut de strukturerade områdena i polymeren och stanshålen i varje ände av kanalen med en PDMS-puncher. Rengör senare den strukturerade sidan av PDMS-blocket. Skölj därefter tre gånger med isopropanol och metanol följt av ultrarent vatten och föna ytan.
Därefter plasmarengör PDMS med syre eller luftplasma och placera det plasmarengjorda PDMS på ett lämpligt rengjort täckglas. Värm den en kokplatta vid 80 grader Celsius i 15 minuter. Sätt i polyetenslangar av lämplig storlek i hålen och anslut utloppsslangen till en spruta på 0,5 milliliter.
Strömma sedan lösningarna in i mikrokanalerna genom att nedsänka inloppsröret i lösningen och dra den önskade volymen med sprutan. Placera provet på mikroskopsteget och slå på epi-belysningsljuskällan för IRM-avbildning. För att fokusera mikroskopet, leta efter rätt fokalplan nära PDMS-lösningsgränssnittet och välj ett synfält nära kanalens mitt.
Förbered sedan 0,1-mikromolär lösning av fluorescerande mikrober i BRB80 och flöde i minst en kanalvolym av mikropärlösningen. Övervaka reaktionen via IRM eller TIRF. När den önskade densiteten av mikrober uppnås, tvätta ut överskottet med BRB80.
Flöda utspädda frön in i reaktionskammaren och övervaka reaktionen genom IRM. När den önskade densiteten av frön uppnås, tvätta ut överskottet med BRB80. Förbered sedan en mikrotubulär förlängningsblandning innehållande 12-mikromolär omärkt tubulin, en-millimolär GTP, fem-millimolär DTT i BRB80-buffert.
Flöda sedan i minst en kanalvolym av förlängningsblandningen samtidigt som reaktionstemperaturen är 28 grader Celsius säkerställs. För att börja, ställ in bildinställningarna på mikroskopprogramvaran. Starta avbildning och flöde kinesinlösningen in i kammaren.
Visualisera sedan GFP-märkta kinesin 1 unshrinking mikrotubuli. När mätningen är klar spelar du in en kort video där scenen långsamt översätts i en cirkulär eller lateral rörelse. Medianprojektionen för den här videon kommer att fungera som en bakgrundsbild och kommer att subtraheras från de råa mätningarna.
Skapa en medianprojektion i ImageJ från bakgrundsinspelningen genom att klicka på Bild. Välj sedan alternativet Stacks och klicka på Z Project. Subtrahera sedan medianbakgrundsprojektionen från råbilddata genom att klicka på Process och välj sedan alternativet Bildkalkylator samtidigt som du ser till att kontrollera alternativet 32-bitars flottörresultat.
För bildregistrering, välj en samling mikropärlor nära mikrotubuli av intresse och använd dem för att justera TIRF- och IRM-bilderna. För varje pärla i den här samlingen använder du flerpunktsvalsverktyget för att markera den ungefärliga platsen i TIRF-kanalen och sedan motsvarande plats i IRM-kanalen. Kör sedan det medföljande ImageJ-makrot.
Mikropärlor visas som mörka fläckar i IRM-kanalen till höger och som ljuspunkter i TIRF-kanalen till vänster. Justeringsproceduren överlagrar de två kanalerna korrekt genom att lokalisera ett urval av pärlor. En kymograf av EGFP-märkta kinesinmolekyler som går mot de krympande ändarna av mikrotubuli erhölls också med användning av detta protokoll.
När du utför denna procedur är det viktigt att välja höga numeriska bländarmål för att uppnå total intern reflektion och även för att maximera samlingseffektiviteten och bildkontrasten. Denna metod kan användas för högupplöst avbildning av enstaka fluorescerande molekyler samtidigt inom den makromolekylära strukturen som är tillräckligt massiv för att visualiseras av IRM, såsom cellmembran eller aktinfilament. Detta protokoll ger också en lätt anpassningsbar procedur för samtidig avbildning med valfri kombination av IRM, TIRF och epifluorescens.