Bu yöntemin önemi, etiketsiz mikrotübüllerin, yüksek kare hızlarında floresan olarak etiketlenmiş proteinlerle aynı anda görüntülenenlere izin vermesidir. Bu tekniğin temel avantajı, kolay uygulanması ve optik bileşenler üzerindeki minimum taleptir. Ayrıca mikrotübüllerin floro-4 etiketleme ihtiyacını da ortadan kaldırır.
Başlamak için, kürleme maddesini ve baz elastomeri 1:10 kütle oranında birleştirerek PDMS polimerini hazırlayın. Bunları iki dakika karıştırın ve ardından tüm kabarcıklar kaybolana kadar karışımı bir vakum odasında gazdan arındırın. Daha sonra, karışımı ana kalıba yaklaşık 0,5 santimetre kalınlığında bir tabaka halinde dökün, kabarcıklar oluşturmamaya özen gösterin ve karışımı 70 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir fırında 40 dakika pişirin.
Ardından, polimerin yapılandırılmış bölgelerini kesin ve bir PDMS zımba kullanarak kanalın her iki ucundaki delikleri delin. Daha sonra, PDMS bloğunun yapılandırılmış tarafını temizleyin. Daha sonra, izopropanol ve metanol ile üç kez durulayın, ardından ultra saf su ve yüzeyi fön ile kurutun.
Daha sonra, plazma PDMS'yi oksijen veya hava plazması kullanarak temizler ve plazma ile temizlenmiş PDMS'yi uygun şekilde temizlenmiş bir kapak camına yerleştirin. Sıcak bir plakayı 15 dakika boyunca 80 santigrat derecede ısıtın. Uygun boyutta düşük yoğunluklu polietilen boruları deliklere yerleştirin ve çıkış borusunu 0,5 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın.
Daha sonra, giriş tüpünü çözeltiye batırarak ve gerekli hacmi şırınga ile çizerek çözeltileri mikro kanallara akıtın. Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve IRM görüntüleme için epi-aydınlatma ışık kaynağını açın. Mikroskopu odaklamak için, PDMS çözüm arabiriminin yakınında doğru odak düzlemini arayın ve kanalın merkezine yakın bir görüş alanı seçin.
Daha sonra, BRB80'de 0.1 mikromolar floresan mikroboncuk çözeltisi hazırlayın ve mikroboncuk çözeltisinin en az bir kanal hacminde akın. IRM veya TIRF ile reaksiyonu izleyin. İstenilen mikroboncuk yoğunluğu elde edildiğinde, fazlalığı BRB80 ile yıkayın.
Seyreltilmiş tohumları reaksiyon odasına aktarın ve IRM aracılığıyla reaksiyonu izleyin. İstenilen tohum yoğunluğu elde edildiğinde, fazlalığı BRB80 ile yıkayın. Daha sonra, BRB80 tamponunda 12 mikromolar etiketsiz tübülin, bir milimolar GTP, beş milimolar DTT içeren bir mikrotübül uzatma karışımı hazırlayın.
Daha sonra, reaksiyon sıcaklığının 28 santigrat derece olmasını sağlarken, uzatma karışımının en az bir kanal hacminde akın. Başlamak için, mikroskop yazılımındaki görüntüleme ayarlarını yapın. Görüntülemeyi başlatın ve kinesin çözeltisini odaya akıtın.
Ardından, GFP etiketli kinesin 1 küçülmeyen mikrotübülleri görselleştirin. Ölçüm tamamlandıktan sonra, sahne alanının dairesel veya yanal bir hareketle yavaşça çevrildiği kısa bir video kaydedin. Bu videonun medyan projeksiyonu bir arka plan görüntüsü görevi görecek ve ham ölçümlerden çıkarılacaktır.
ImageJ'de ImageJ'de arka plan kaydından Image'a tıklayarak medyan projeksiyon oluşturun. Ardından, Yığınlar seçeneğini seçin ve Z Projesi'ne tıklayın. Ardından, İşlem'e tıklayarak ham görüntü verilerinden medyan arka plan projeksiyonunu çıkarın ve ardından 32 bit float sonucu seçeneğini işaretlediğinizden emin olurken Görüntü Hesaplayıcı seçeneğini seçin.
Görüntü kaydı için, ilgilendiğiniz mikrotübülün yakınında bir mikroboncuk koleksiyonu seçin ve bunları TIRF ve IRM görüntülerini hizalamak için kullanın. Bu koleksiyondaki her boncuk için, TIRF kanalındaki yaklaşık konumu ve ardından IRM kanalındaki karşılık gelen konumu işaretlemek üzere çok noktalı seçim aracını kullanın. Ardından, sağlanan ImageJ makrosunu çalıştırın.
Mikroboncuklar sağdaki IRM kanalında koyu lekeler ve soldaki TIRF kanalında parlak noktalar olarak görünür. Hizalama prosedürü, bir dizi boncuğu yerelleştirerek iki kanalı doğru şekilde kaplar. Bu protokol kullanılarak mikrotübüllerin küçülen uçlarına doğru yürüyen EGFP etiketli kinesin moleküllerinin bir kimografı da elde edildi.
Bu prosedürü gerçekleştirirken, toplam dahili yansımayı elde etmek ve ayrıca koleksiyon verimliliğini ve görüntü kontrastını en üst düzeye çıkarmak için yüksek sayısal diyafram açıklığı hedeflerini seçmek önemlidir. Bu yöntem, hücre zarı veya aktin filamenti gibi IRM tarafından görselleştirilebilecek kadar büyük makromoleküler yapı içinde aynı anda tek floresan moleküllerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için kullanılabilir. Bu protokol aynı zamanda IRM, TIRF ve epifloresanın herhangi bir kombinasyonu ile eşzamanlı görüntüleme için kolayca uyarlanabilir bir prosedür sağlar.
