Name: intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

De auteurs willen dr. Pina Colarusso bedanken, die aanzienlijke expertise heeft geleverd bij het redigeren en herzien van dit manuscript.

Alle hier beschreven procedures werden uitgevoerd met voorafgaande goedkeuring van de Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA).
1. Voorbereiding
<ol><li>Longbeeldvormingssysteem: Om het venster voor te bereiden, dient u een dunne laag vacuümvet toe aan de bovenkant van de buitenste ring terwijl verontreiniging van het vacuümkanaal wordt vermeden. Plaats een schone glazen afdekplaat van 8 mm op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te c...

<ol>
	<li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection.">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).</li><li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics.">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li><li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice.">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).</li><li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats.">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).</li><li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung.">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li><li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window.">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).</li><li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts.">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li><li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation.">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li><li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis.">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li><li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung.">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li><li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury:+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse.">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li><li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level:+Insights+from+lung+intravital+microscopy.">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).</li><li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6%+Hydroxyethyl+starch+(HES+130/0.4)+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice.">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li><li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice.">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li><li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).</li><li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis.">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li><li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock:+Relationship+to+hemodynamics,+oxygen+transport,+and+survival.">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li><li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system.">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo:+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research.">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration.">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li><li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., H&#252;ttmann, G., K&#246;nig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice.">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li><li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+observations+of+15-&#181;m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopic observations of 15-&#181;m microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li><li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li></ol>

Het hier gepresenteerde protocol vereist oefening en aandacht voor een paar kritieke stappen. Ten eerste is het belangrijk om het beeldvormingsvenster voor te bereiden voordat de intubatie en operatie worden gestart. Gebruik een minimale hoeveelheid vacuümvet om de buitenste ring van het beeldvenster te coaten, breng het afdekglas aan en test de zuigkracht met een druppel gedestilleerd water. Door dit van tevoren voor te bereiden, voorkomt u dat de blootgestelde long tijdens de installatie uitdroogt. Hoewel het mogelijk...

Intravitale microscopie (IVM) is een nuttig beeldvormingsinstrument voor het visualiseren en bestuderen van verschillende biofysische processen in vivo. De long is zeer uitdagend om in vivo in beeld te brengen vanwege de ingesloten locatie, de fragiele aard van het weefsel en bewegingsartefacten veroorzaakt door ademhaling en hartslag 1,2. Verschillende intravitale microscopie (IVM) opstellingen zijn ontwikkeld voor real-time beeldvorming van leukocyt-endotheel interacties in pulmonale microcirculatie om deze uitdagingen te overwinnen. Dergelijke benaderingen zijn gebaseerd op het chirurgisch blootstellen en stabiliseren van de long voor beeldvorming.
Dieren worden meestal voorbereid op long IVM door chirurgische ingrepen. Ten eerste worden dieren geïntubeerd en beademd, wat chirurgische excisie van een thoracale venster en daaropvolgende interventies mogelijk maakt om de long te stabiliseren voor beeldvorming. Eén techniek omvat het lijmen van het parenchym op een glazen afdekplaat3, een procedure die een aanzienlijk fysiek trauma aan het afgebeelde weefsel riskeert. Geavanceerder is het gebruik van een vacuümsysteem om de long te stabiliseren onder een glazen venster4. Deze opstelling vergemakkelijkt de losse hechting van het longoppervlak aan de coverslip via een omkeerbaar vacuüm verspreid over een groot lokaal gebied en breidt de long uit terwijl de beweging in x-, y- en z-dimensies4 nog steeds wordt beperkt. Het vacuüm wordt gelijkmatig aangebracht door een kanaal rond het beeldvormende gebied van de opstelling en trekt het weefsel in een ondiep conisch gebied tegenover de imaging-grade coverslip4. Via dit kijkvenster kan de longmicrocirculatie worden bestudeerd met behulp van verschillende optische beeldvormingsmodaliteiten.
Long IVM maakt kwantitatieve beeldvorming van een veelheid aan microcirculatieparameters mogelijk. Deze omvatten metingen zoals leukocytenspoorsnelheid en -lengte5, rode bloedcelstroomsnelheid6 en oxygenatie7, tumormetastasen8, het onderscheid van immuuncelsubpopulaties 9,10,11, visualisatie van microdeeltjes12, alveolaire dynamica13,14, vasculaire permeabiliteit15 en capillaire functie16 . De focus ligt hier op leukocytenrekrutering en capillaire functie. Initiatie van leukocytenrekrutering in de pulmonale microcirculatie omvat voorbijgaande rollende interacties en stevige kleefinteracties tussen leukocyten en endotheelcellen, die beide verhoogd zijn onder ontstekingsomstandigheden 16,17. Typisch wordt rollen gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat een door de operator gedefinieerde referentielijn passeert, terwijl de adhesie wordt gekwantificeerd door het aantal leukocyten dat onbeweeglijk is op het endotheel16. Capillaire functie kan ook worden beïnvloed in inflammatoire toestanden, vaak resulterend in verminderde perfusie. Dit kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder een vermindering van de vervormbaarheid van rode bloedcellen18 en bonte expressie van induceerbare NO-synthase door endotheelcellen, resulterend in pathologische rangering19. Doorgaans wordt de totale lengte van geperfuseerde haarvaten per gebied gemeten en gerapporteerd als functionele capillaire dichtheid (FCD).
Het bestuderen van leukocytenrekrutering in de longen in realtime vereist het labelen van biologische doelen met fluorescerende kleurstoffen of fluorescerend gelabelde antilichamen20. Als alternatief kunnen verschillende transgene muizenstammen zoals lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) muizen worden gebruikt om specifieke immuuncelsubsets zoals neutrofielen21,22 in beeld te brengen. De fluorescerend gelabelde leukocyten kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie, confocale microscopie of multifotonenmicroscopie. Deze technieken bereiken contrast door gebruik te maken van specifieke excitatiegolflengten en uitgezonden fluorescentie te detecteren, terwijl tegelijkertijd de detectie van de excitatiegolflengte wordt geblokkeerd, waardoor het gelabelde object wordt gemarkeerd.
Bestaand onderzoek naar de kwantificering van leukocytenrollen, adhesie en functionele capillaire dichtheid in de muizenlong is voornamelijk gebaseerd op handmatige video-analyse. Dit wordt mogelijk gemaakt door open-source software zoals Fiji 6,23, propriëtaire software zoals CapImage12, of op maat gemaakte beeldverwerkingssystemen24. Omgekeerd maken verschillende eigen softwareplatforms (bijv. NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) geautomatiseerde meting mogelijk van een breed scala aan andere fysiologische parameters, waaronder veel van de eerder hier genoemde 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Er zijn belangrijke observaties gedaan met betrekking tot de pathologie van acuut longletsel (ALI) en acute respiratory distress syndrome (ARDS) met behulp van long IVM. ARDS wordt gekenmerkt door een groot aantal pathofysiologische processen in de longen, waaronder longoedeem en alveolaire schade veroorzaakt door disfunctie van het endotheel en de epitheliale barrière25. Met behulp van een muizenmodel is gebleken dat sepsis-geïnduceerde ALI geassocieerd is met significante schadelijke veranderingen in de handel in immuuncellen in de longomgeving26. Neutrofielen die werden gerekruteerd voor de haarvaten van muizen met sepsis-geïnduceerde ALI bleken de microcirculatie te belemmeren, waardoor hypoxie in ALI26 toenam. Daarnaast is IVM gebruikt om inzicht te krijgen in het onderliggende reparatiemechanisme na het begin van ARDS27. Long IVM is ook een waardevol hulpmiddel geweest bij het begrijpen van pathofysiologische veranderingen in verschillende obstructieve longziekten. Visualisatie van slijmtransport bij ziekten zoals cystic fibrosis (CF) en chronische obstructieve longziekte (COPD) heeft bijvoorbeeld de studie van nieuwe en bestaande behandelingen voor slijmklaringvergemakkelijkt 28. Leukocytenhandel onder deze omstandigheden is ook geanalyseerd17.
Dit protocol borduurt voort op de aanpak die oorspronkelijk werd beschreven door Lamm et al.29 om leukocyten-endotheelinteracties te bestuderen met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie. De beschreven procedures maken gebruik van een in vivo longbeeldvormingssysteem, dat een metalen basis van 16,5 cm x 12,7 cm, micromanipulator en vacuümbeeldvormingsvenster omvat (figuur 1). Het systeem is gemonteerd in een 20 cm x 23,5 cm 3D-geprint platform (Supplemental File 1) om een veilige bevestiging voor de ventilatorbuis en het verwarmingskussen te bieden. Deze methode biedt reproduceerbare en kwantificeerbare beeldvorming van murine pulmonale microcirculatie in vivo. Belangrijke aspecten van de chirurgische voorbereiding en het juiste gebruik van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem worden in detail uitgelegd. Ten slotte wordt een experimenteel model van ALI gebruikt om representatieve beeldvorming en analyse te bieden van veranderde leukocytenrollen, leukocytenadhesie en capillaire perfusie geassocieerd met ontsteking. Het gebruik van dit protocol moet verder belangrijk onderzoek naar pathofysiologische veranderingen in de pulmonale microcirculatie tijdens acute ziektetoestanden vergemakkelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm</td>
			<td>RWD Life Science Co.</td>
			<td>F12002-12</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9771-1G</td>
			<td>FITC-albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v</td>
			<td>Canadian Custom Packaging Company</td>
			<td>80002455</td>
			<td>Alcohol wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>00631069602029</td>
			<td>Digital video converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B/W - CCD - Camera</td>
			<td>Horn Imaging</td>
			<td>BC-71</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories International</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Cotton applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS-8R 8mm Round Glass Coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0701</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>ITM Instruments Inc.</td>
			<td>DG2551L0NAM02L0IM&#38;V</td>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope</td>
			<td>Dr. Mom Otoscopes</td>
			<td>1001</td>
			<td>Otoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1590110</td>
			<td>Labeling tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>ZA-07061-40</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Hemostatic forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC976VF</td>
			<td>Vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL</td>
			<td>Teligent Canada</td>
			<td>0121AD01</td>
			<td>Lidocaine HCl 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung SurgiBoard</td>
			<td>Luxidea, Inc.</td>
			<td>IMCH-0001</td>
			<td>Designed for intravital microscopy of the lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Teva Canada</td>
			<td>00485802</td>
			<td>Mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Endotracheal Intubation Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>ETI-MSE</td>
			<td>Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MST49 Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 022</td>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>566035</td>
			<td>20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>AMD-Ritmed</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>Gauze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare Eye Lube Plus</td>
			<td>Aventix</td>
			<td>5914322</td>
			<td>Tear gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Compressed</td>
			<td>Linde Canada Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305106</td>
			<td>30 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td>Vacuum flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3&#34;</td>
			<td>Primed</td>
			<td>PM5-630709</td>
			<td>Cloth tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>602-205</td>
			<td>1.0 mm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01, SS-04-module</td>
			<td>Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501216</td>
			<td>Toothed forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td>
			<td>3M</td>
			<td>7000002795</td>
			<td>Medical tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.</td>
			<td>Grainger Canada</td>
			<td>USSZUSA-HT3314</td>
			<td>1.0 cm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>6720-5002</td>
			<td>Inline 0.2&#181;m filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system

Intravitale beeldvorming van leukocyten-endotheelinteracties biedt waardevolle inzichten in immuungemedieerde ziekten bij levende dieren. De studie van acute longbeschadiging (ALI) / acute respiratory distress syndrome (ARDS) en andere respiratoire pathologieën in vivo is moeilijk vanwege de beperkte toegankelijkheid en inherente bewegingsartefacten van de longen. Niettemin zijn er verschillende benaderingen ontwikkeld om deze uitdagingen het hoofd te bieden. Dit protocol beschrijft een methode voor intravitale fluorescentiemicroscopie om real-time leukocyten-endotheelinteracties in de pulmonale microcirculatie te bestuderen in een experimenteel model van ALI. Een in vivo longbeeldvormingssysteem en een 3D-geprint intravitaal microscopieplatform worden gebruikt om de verdoofde muis te beveiligen en de long te stabiliseren, terwijl verstorend longletsel wordt geminimaliseerd. Na voorbereiding wordt widefield fluorescentiemicroscopie gebruikt om leukocytenadhesie, leukocytenrollen en capillaire functie te bestuderen. Hoewel het hier gepresenteerde protocol zich richt op beeldvorming in een acuut model van inflammatoire longziekte, kan het ook worden aangepast om andere pathologische en fysiologische processen in de long te bestuderen.

Om de resultaten te illustreren die via dit protocol kunnen worden bereikt, werd acuut longletsel (ALI) geïnduceerd 6 uur voorafgaand aan beeldvorming met behulp van een model van intranasale bacteriële lipopolysaccharide (LPS) instillatie. In het kort werden muizen (n = 3) verdoofd met isofluraan en kleine druppeltjes LPS van Pseudomonas aeruginosa in steriele zoutoplossing (10 mg / ml) werden in de linker naris gepipetteerd in een dosering van 5 mg / kg. Dit werd vergeleken met naïeve muizen (n = 3; geen in...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

Intravitale fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om leukocyten-endotheelinteracties en capillaire perfusie in realtime te bestuderen. Dit protocol beschrijft methoden om deze parameters in de pulmonale microcirculatie in beeld te brengen en te kwantificeren met behulp van een vacuümgestabiliseerd longbeeldvormingssysteem.

Intravitale widefield fluorescentiemicroscopie van pulmonale microcirculatie bij experimenteel acuut longletsel met behulp van een vacuümgestabiliseerd beeldvormingssysteem

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Dit protocol beschrijft in detail de chirurgische voorbereiding en het gebruik van een vacuümgestabiliseerd systeem om pulmonale leukocytenadhesie en capillaire perfusie in vivo in beeld te brengen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het stabiele intravitale beeldvorming met hoge resolutie van de intacte spiegelende long mogelijk maakt met minimaal fysiek trauma. Bereid om te beginnen het beeldvormingsvenster voor door een dunne laag vacuümvet aan de bovenkant van de buitenste ring toe te dienen en tegelijkertijd verontreiniging van het vacuümkanaal te voorkomen.Plaats een schone 8-millimeter glazen afdekplaat op het raam en druk zachtjes naar beneden om een afdichting te creëren. Sluit het beeldvenster aan op een vacuümpomp die is uitgerust met een digitale manometer en die 50 tot 60 millimeter kwikconstante zuigkracht kan leveren. Laat een lengte glasvezelkabel door een 20-gauge endotracheale canule gaan en dompel de punt onder in lidocaïne HCL.Breng na anesthesie een gemodificeerde otoscoop in, zodat de bovenste snijtanden binnen de opening in het speculum passen. Pas de scope en tongpositie aan totdat de epiglottis en de stembanden duidelijk zichtbaar zijn. Steek de glasvezelkabel door de opening in het speculum en gebruik kleine cirkelvormige bewegingen om de kabel tussen de stembanden te passeren, gebruik vervolgens de glasvezelkabel als gids en schuif de canule voorzichtig in de luchtpijp om de muis te intuberen.Na het starten van de ventilatie met 1,5% isofluraan, bevestigt u de diepte van de anesthesie door te testen op pedaalreflex. Bevestig de canule aan de snuit met medische tape. Gebruik labeling tape om de rechter voorpoot op de positie van negen uur aan het verwarmingskussen te bevestigen en de linker achterpoot caudaal uit te strekken en vast te zetten op de zes uur positie.Span met behulp van een doektape de linker voorpoot lichtjes uit tot de positie van 12 uur en bevestig het andere uiteinde van de tape aan de bovenkant van het intravitale microscopieplatform en breng vervolgens een rectale temperatuursonde en pootpulsoximeter aan om de vitale functies tijdens het experiment te bewaken. Om de muis voor te bereiden op een operatie, steriliseert u de thorax en de buik met een 70% alcoholdoekje en brengt u een lichte laag minerale olie aan om het haar aan de linkerkant van de muis te bevochtigen. Maak een kleine incisie aan de onderkant van de ribbenkast om de onderliggende spierlaag bloot te leggen, verleng vervolgens de initiële incisie en gebruik stompe dissectie om de ribbenkast bloot te leggen.Pak met behulp van een hemostatische tang het ontleedde epitheel- en vetweefsel vast en plaats het operatiegebied vrij. Om leukocyten en bloedstroom fluorescerend te labelen, dient u een bolus van 2,5 milliliter per kilogram Rhodamine 6G en FITC-albumine toe via de staartader. Gebruik een getande tang om de rib onmiddellijk inferieur te maken aan de positie van de basis van de long aan het einde van de inspiratie.Trek de tang iets terug om de rib weg te trekken van de long en snijd vervolgens de rib door om een pneumothorax te induceren. Verleng de incisie zijdelings in beide richtingen en zorg ervoor dat u de long niet aanraakt. Pak de op een na hoogste rib vast met een stompe tang en trek je iets terug om de long van de borstwand af te laten vallen.Als de long niet loslaat, druk de borstwand dan lichtjes tegen de long om ervoor te zorgen dat de long zich hecht aan het onderliggende borstvlies en dus gemakkelijker wegvalt. Ga door met de oorspronkelijke incisie uiteindelijk tot het borstbeen en craniaal totdat de top van de long wordt blootgesteld. Gebruik katoenen applicators en gaas om eventuele bloedingen te verzachten.Verhoog de ribbenkast om de intercostale bloedvaten op het dorsale aspect van de thoracale holte bloot te leggen, zorg ervoor dat de long niet wordt beschadigd, dichtschroei het meest inferieure intercostale vat in de buurt van de wervelkolom en snijd vervolgens de aangrenzende rib door. Craniaal bewegen en uiteindelijk een herhaald patroon van cauterisatie en snijden gebruiken om een deel van ongeveer één bij twee centimeter van de ribbenkast te snijden. Om u voor te bereiden op beeldvorming, brengt u het intravitale microscopieplatform over naar het microscoopstadium en plaatst u het beeldvormingsvenster direct boven de blootgestelde long.Gebruik de micromanipulator om het beeldvormingsvenster voorzichtig te laten zakken totdat het zich hecht aan het longoppervlak en het stabiliseert. Om de pulmonale microcirculatie te visualiseren, gebruikt u een breedveldfluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x objectief en standaard FITC- en Rhodamine-filtersets. Gebruik een zwart-wit CCD-camera om de video's met optimaal contrast op te nemen.Identificeer met behulp van de FITC-filterset een pulmonale locatie op basis van het convergente patroon van de bloedstroom en neem een video van 30 seconden op met de locatie in focus, herhaal vervolgens de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren. Om een pulmonale arteriele te lokaliseren, gebruikt u de FITC-filterset om een vat met een divergent patroon van de bloedstroom te identificeren en een video van 30 seconden op te nemen. Herhaal de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren.Om de interessante capillaire gebieden te lokaliseren, gebruikt u de FITC-filterset om een gebied van longblaasjes en haarvaten te identificeren dat niet door grotere vaten wordt doorsneden en neemt u een video van 30 seconden op. Herhaal de opname in hetzelfde gezichtsveld met behulp van de Rhodamine-filterset om leukocyten te visualiseren. Deze video toont FITC-beeldvorming van de bloedstroom binnen een pulmonale locatie zoals aangegeven door de groene pijl.Rhodamine beeldvorming maakt visualisatie van leukocyten op dezelfde locatie mogelijk met twee adherente leukocyten aangegeven door de rode pijlen. Deze methoden werden ook toegepast om dezelfde verschijnselen en pulmonale arteriëlen en capillaire regio's van belang te visualiseren. Om de kwantificering van microcirculatieparameters aan te tonen, werden muizen behandeld met intranasale LPS om longontsteking te induceren.Leukocytenhandel in pulmonale locaties wordt hier getoond met geschetste gebieden die de geanalyseerde endotheelgebieden vertegenwoordigen bij naïeve en met LPS behandelde muizen. Leukocytenadhesie en rollen waren verhoogd bij met LPS behandelde muizen. Leukocytenhandel in pulmonale arterialen wordt hier getoond met geschetste gebieden die de geanalyseerde endotheelgebieden vertegenwoordigen bij naïeve en met LPS behandelde muizen.De adhesie van leukocyten was hoger bij met LPS behandelde muizen. Deze figuur toont de adhesie van leukocyten in pulmonale haarvaten bij naïeve en met LPS behandelde muizen. De adhesie van leukocyten bleek hoger te zijn bij met LPS behandelde muizen versus naïeve.Deze figuur toont perfusie van pulmonale haarvaten bij naïeve en met LPS behandelde muizen. Functionele capillaire dichtheid bleek lager te zijn bij met LPS behandelde muizen versus naïef. Er zijn veel uitdagende aspecten van dit protocol.Het optimaliseren van de positionering van de muis op het platform is een eenvoudige stap die de chirurgische en beeldvormende stappen veel reproduceerbaarder kan maken. Deze procedure is aanpasbaar aan een breed scala aan studieparameters en microscopiebenaderingen. Daarom moet het verder onderzoek naar pulmonale microcirculatie in zowel gezonde als zieke toestanden vergemakkelijken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Hoogst vastbesloten Intravitale Striped-verlichting Microscopie van Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualiseren van extracellulaire Traps Macrophage met behulp van de Confocal Microscopie

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Intraperitoneaal Glucose tolerantie Test, meting van de longfunctie, en fixatie van de longen om te bestuderen van de gevolgen van obesitas en verminderde stofwisseling op pulmonaire resultaten

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Imaging-cel interactie in tracheale Mucosa tijdens Influenza virusinfectie met behulp van twee-foton Intravital microscopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...