Name: intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

Gli autori desiderano ringraziare la dott.ssa Pina Colarusso, che ha fornito una significativa esperienza nella redazione e revisione di questo manoscritto.

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite previa approvazione da parte del Comitato per gli animali da laboratorio dell'Università di Dalhousie (UCLA).
1. Preparazione
<ol><li>Sistema di imaging polmonare: per preparare la finestra, somministrare un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto. Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 mm sulla finestra e premere delicatamente ve...

<ol>
	<li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection.">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).</li><li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics.">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li><li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice.">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).</li><li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats.">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).</li><li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung.">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li><li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window.">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).</li><li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts.">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li><li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation.">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li><li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis.">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li><li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung.">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li><li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury:+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse.">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li><li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level:+Insights+from+lung+intravital+microscopy.">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).</li><li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6%+Hydroxyethyl+starch+(HES+130/0.4)+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice.">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li><li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice.">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li><li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).</li><li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis.">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li><li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock:+Relationship+to+hemodynamics,+oxygen+transport,+and+survival.">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li><li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system.">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo:+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research.">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration.">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li><li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., H&#252;ttmann, G., K&#246;nig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice.">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li><li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+observations+of+15-&#181;m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopic observations of 15-&#181;m microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li><li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li></ol>

Il protocollo qui presentato richiede pratica e attenzione ad alcuni passaggi critici. In primo luogo, è importante preparare la finestra di imaging prima di iniziare l'intubazione e la chirurgia. Utilizzare una quantità minima di grasso sottovuoto per rivestire l'anello esterno della finestra di imaging, applicare il vetro di copertura e testare l'aspirazione con una goccia di acqua distillata. Prepararlo in anticipo impedirà al polmone esposto di asciugarsi durante l'installazione, altrimenti. Mentre è possibile la...

La microscopia intravitale (IVM) è un utile strumento di imaging per visualizzare e studiare vari processi biofisici in vivo. Il polmone è molto difficile da fotografare in vivo a causa della sua posizione chiusa, della natura fragile del suo tessuto e degli artefatti di movimento indotti dalla respirazione e dal battito cardiaco 1,2. Sono state sviluppate varie configurazioni di microscopia intravitale (IVM) per l'imaging in tempo reale delle interazioni leucocita-endoteliali nella microcircolazione polmonare per superare queste sfide. Tali approcci si basano sull'esposizione chirurgica e sulla stabilizzazione del polmone per l'imaging.
Gli animali sono in genere preparati per l'IVM polmonare mediante procedure chirurgiche. In primo luogo, gli animali vengono intubati e ventilati, il che consente l'escissione chirurgica di una finestra toracica e successivi interventi per stabilizzare il polmone per l'imaging. Una tecnica prevede l'incollaggio del parenchima su un coverslip3 di vetro, una procedura che rischia un trauma fisico significativo al tessuto ripreso. Più avanzato è l'utilizzo di un sistema di vuoto per stabilizzare il polmone sotto una finestra di vetro4. Questa configurazione facilita l'aderenza sciolta della superficie polmonare al coverslip tramite un vuoto reversibile distribuito su una vasta area locale ed espande il polmone limitando comunque il movimento nelle dimensioni x, y e z4. Il vuoto viene applicato uniformemente attraverso un canale che circonda l'area di imaging della configurazione e tira il tessuto in una regione conica poco profonda di fronte al coverslip4 di grado di imaging. Attraverso questa finestra di visualizzazione, la microcircolazione polmonare può essere studiata utilizzando varie modalità di imaging ottico.
Lung IVM consente l'imaging quantitativo di una moltitudine di parametri microcircolatori. Questi includono misurazioni come la velocità e la lunghezza della traccia leucocitaria5, la velocità del flusso dei globuli rossi6 e l'ossigenazione7, le metastasi tumorali8, la distinzione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie 9,10,11, la visualizzazione delle microparticelle12, la dinamica alveolare 13,14, la permeabilità vascolare15 e la funzione capillare 16 . L'attenzione qui è sul reclutamento dei leucociti e sulla funzione capillare. L'inizio del reclutamento dei leucociti nella microcircolazione polmonare comporta interazioni transitorie di rotolamento e interazioni adesive solide tra leucociti e cellule endoteliali, entrambe aumentate in condizioni infiammatorie16,17. Tipicamente, il rotolamento è quantificato dal numero di leucociti che passano una linea di riferimento definita dall'operatore, mentre l'adesione è quantificata dal numero di leucociti che sono immobili sull'endotelio16. La funzione capillare può anche essere influenzata negli stati infiammatori, spesso con conseguente diminuzione della perfusione. Ciò può essere attribuito a diversi fattori, tra cui una riduzione della deformabilità dei globuli rossi18 e l'espressione variegata di NO sintasi inducibile da parte delle cellule endoteliali con conseguente smistamento patologico19. Tipicamente, la lunghezza aggregata dei capillari perfusi per area viene misurata e riportata come densità capillare funzionale (FCD).
Studiare il reclutamento dei leucociti nei polmoni in tempo reale richiede l'etichettatura di bersagli biologici con coloranti fluorescenti o anticorpi marcati fluorescenti20. In alternativa, vari ceppi di topo transgenico come i topi lysozyme M-green fluorescent protein (LysM-GFP) possono essere utilizzati per visualizzare specifici sottoinsiemi di cellule immunitarie come i neutrofili21,22. I leucociti marcati fluorescenti possono quindi essere visualizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo, la microscopia confocale o la microscopia multifotonica. Queste tecniche raggiungono il contrasto utilizzando specifiche lunghezze d'onda di eccitazione e rilevando la fluorescenza emessa, bloccando contemporaneamente il rilevamento della lunghezza d'onda di eccitazione, evidenziando così l'oggetto etichettato.
La ricerca esistente riguardante la quantificazione del rotolamento dei leucociti, l'adesione e la densità capillare funzionale nel polmone murino si è basata principalmente sull'analisi video manuale. Ciò è reso possibile da software open source come Fiji 6,23, software proprietario come CapImage12 o sistemi di elaborazione delle immagini personalizzati24. Al contrario, varie piattaforme software proprietarie (ad esempio, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) consentono la misurazione automatizzata di una vasta gamma di altri parametri fisiologici, tra cui molti di quelli precedentemente menzionati qui 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Importanti osservazioni sono state fatte per quanto riguarda la patologia della lesione polmonare acuta (ALI) e della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) utilizzando IVM polmonare. L'ARDS è caratterizzata da una serie di processi fisiopatologici nel polmone, tra cui edema polmonare e danno alveolare causato da disfunzione dell'endotelio e della barriera epiteliale25. Utilizzando un modello murino, è stato scoperto che l'ALI indotta dalla sepsi è associata a significativi cambiamenti dannosi nel traffico di cellule immunitarie nell'ambiente polmonare26. I neutrofili reclutati nei capillari dei topi con ALI indotta da sepsi sono stati trovati per impedire la microcircolazione, aumentando così l'ipossia in ALI26. Inoltre, IVM è stato utilizzato per ottenere informazioni sul meccanismo di riparazione sottostante dopo l'inizio di ARDS27. Lung IVM è stato anche uno strumento prezioso per comprendere i cambiamenti fisiopatologici in varie malattie polmonari ostruttive. Ad esempio, la visualizzazione del trasporto di muco in malattie come la fibrosi cistica (FC) e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ha facilitato lo studio di trattamenti nuovi ed esistenti per la clearance mucosa28. Il traffico di leucociti in queste condizioni è stato analizzato anche17.
Questo protocollo espande l'approccio inizialmente descritto da Lamm et al.29 per studiare le interazioni leucocita-endoteliali utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale. Le procedure descritte impiegano un sistema di imaging polmonare in vivo , che include una base metallica di 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipolatore e una finestra di imaging a vuoto (Figura 1). Il sistema è montato in una piattaforma stampata 3D di 20 cm x 23,5 cm (file supplementare 1) per fornire un fissaggio sicuro per il tubo del ventilatore e la piastra riscaldante. Questo metodo offre immagini riproducibili e quantificabili della microcircolazione polmonare murina in vivo. Aspetti importanti della preparazione chirurgica e il corretto utilizzo di un sistema di imaging polmonare stabilizzato sotto vuoto sono spiegati in dettaglio. Infine, un modello sperimentale di ALI viene utilizzato per fornire immagini e analisi rappresentative del rotolamento alterato dei leucociti, dell'adesione dei leucociti e della perfusione capillare associata all'infiammazione. L'uso di questo protocollo dovrebbe facilitare ulteriori importanti indagini sui cambiamenti fisiopatologici nella microcircolazione polmonare durante gli stati di malattia acuta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm</td>
			<td>RWD Life Science Co.</td>
			<td>F12002-12</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9771-1G</td>
			<td>FITC-albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v</td>
			<td>Canadian Custom Packaging Company</td>
			<td>80002455</td>
			<td>Alcohol wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>00631069602029</td>
			<td>Digital video converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B/W - CCD - Camera</td>
			<td>Horn Imaging</td>
			<td>BC-71</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories International</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Cotton applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS-8R 8mm Round Glass Coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0701</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>ITM Instruments Inc.</td>
			<td>DG2551L0NAM02L0IM&#38;V</td>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope</td>
			<td>Dr. Mom Otoscopes</td>
			<td>1001</td>
			<td>Otoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1590110</td>
			<td>Labeling tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>ZA-07061-40</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Hemostatic forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC976VF</td>
			<td>Vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL</td>
			<td>Teligent Canada</td>
			<td>0121AD01</td>
			<td>Lidocaine HCl 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung SurgiBoard</td>
			<td>Luxidea, Inc.</td>
			<td>IMCH-0001</td>
			<td>Designed for intravital microscopy of the lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Teva Canada</td>
			<td>00485802</td>
			<td>Mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Endotracheal Intubation Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>ETI-MSE</td>
			<td>Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MST49 Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 022</td>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>566035</td>
			<td>20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>AMD-Ritmed</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>Gauze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare Eye Lube Plus</td>
			<td>Aventix</td>
			<td>5914322</td>
			<td>Tear gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Compressed</td>
			<td>Linde Canada Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305106</td>
			<td>30 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td>Vacuum flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3&#34;</td>
			<td>Primed</td>
			<td>PM5-630709</td>
			<td>Cloth tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>602-205</td>
			<td>1.0 mm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01, SS-04-module</td>
			<td>Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501216</td>
			<td>Toothed forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td>
			<td>3M</td>
			<td>7000002795</td>
			<td>Medical tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.</td>
			<td>Grainger Canada</td>
			<td>USSZUSA-HT3314</td>
			<td>1.0 cm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>6720-5002</td>
			<td>Inline 0.2&#181;m filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system

L'imaging intravitale delle interazioni leucocita-endoteliali offre preziose informazioni sulla malattia immuno-mediata negli animali vivi. Lo studio della lesione polmonare acuta (ALI) / sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS) e di altre patologie respiratorie in vivo è difficile a causa della limitata accessibilità e degli artefatti di movimento intrinseci dei polmoni. Tuttavia, sono stati sviluppati vari approcci per superare queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per la microscopia a fluorescenza intravitale per studiare in tempo reale le interazioni leucocita-endoteliale nella microcircolazione polmonare in un modello sperimentale di ALI. Un sistema di imaging polmonare in vivo e una piattaforma di microscopia intravitale stampata in 3D vengono utilizzati per proteggere il topo anestetizzato e stabilizzare il polmone riducendo al minimo le lesioni polmonari confondenti. Dopo la preparazione, la microscopia a fluorescenza a campo largo viene utilizzata per studiare l'adesione dei leucociti, il rotolamento dei leucociti e la funzione capillare. Mentre il protocollo qui presentato si concentra sull'imaging in un modello acuto di malattia polmonare infiammatoria, può anche essere adattato per studiare altri processi patologici e fisiologici nel polmone.

Per illustrare i risultati ottenibili attraverso questo protocollo, la lesione polmonare acuta (ALI) è stata indotta 6 ore prima dell'imaging utilizzando un modello di instillazione batterica intranasale di lipopolisaccaride (LPS). In breve, i topi (n = 3) sono stati anestetizzati con isoflurano e piccole goccioline di LPS da Pseudomonas aeruginosa in soluzione salina sterile (10 mg / mL) sono state pipettate nel naris sinistro alla dose di 5 mg / kg. Questo è stato confrontato con topi naïve (n = 3; nessuna ...

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Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

La microscopia a fluorescenza intravitale può essere utilizzata per studiare le interazioni leucocita-endoteliali e la perfusione capillare in tempo reale. Questo protocollo descrive i metodi per visualizzare e quantificare questi parametri nel microcircolo polmonare utilizzando un sistema di imaging polmonare stabilizzato nel vuoto.

Microscopia a fluorescenza intravitale a campo largo della microcircolazione polmonare polmonare polmonare acuta sperimentale utilizzando un sistema di imaging stabilizzato sotto vuoto

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione chirurgica e l'uso di un sistema stabilizzato sotto vuoto per visualizzare l'adesione dei leucociti polmonari e la perfusione capillare in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'imaging intravitale stabile ad alta risoluzione del polmone specchio intatto con traumi fisici minimi. Per iniziare, preparare la finestra di imaging somministrando un sottile strato di grasso sottovuoto nella parte superiore dell'anello esterno evitando la contaminazione del canale del vuoto.Posizionare un coperchio di vetro pulito da 8 millimetri sulla finestra e premere delicatamente verso il basso per creare una guarnizione. Collegare la finestra di imaging a una pompa per vuoto dotata di un manometro digitale e in grado di fornire da 50 a 60 millimetri di aspirazione costante al mercurio. Passare una lunghezza di cavo in fibra ottica attraverso una cannula endotracheale calibro 20 e immergere la punta in lidocaina HCL.Dopo l'anestesia, inserire un otoscopio modificato, in modo tale che gli incisivi superiori si inseriscano nello spazio nello speculum. Regolare l'ambito e la posizione della lingua fino a quando l'epiglottide e le corde vocali sono chiaramente visibili. Inserire il cavo in fibra ottica attraverso lo spazio nello speculum e utilizzare piccoli movimenti circolari per far passare il cavo tra le corde vocali, quindi utilizzando il cavo in fibra ottica come guida, far scorrere delicatamente la cannula nella trachea per intubare il mouse.Dopo aver iniziato la ventilazione con isoflurano all'1,5%, confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso del pedale. Fissare la cannula al muso con nastro adesivo. Utilizzare il nastro adesivo per fissare la zampa anteriore destra alla piastra riscaldante a ore nove ed estendere caudalmente la zampa posteriore sinistra e fissarla alla posizione delle sei.Usando un nastro di stoffa, allungare leggermente la zampa anteriore sinistra fino alla posizione a ore 12 e fissare l'altra estremità del nastro alla parte superiore della piattaforma di microscopia intravitale, quindi applicare una sonda di temperatura rettale e un pulsossimetro a zampa per monitorare i segni vitali durante l'esperimento. Per preparare il topo all'intervento chirurgico, sterilizzare il torace e l'addome con una salvietta alcolica al 70% e applicare una leggera mano di olio minerale per smorzare i capelli sul lato sinistro del mouse. Fare una piccola incisione vicino al fondo della gabbia toracica per esporre lo strato muscolare sottostante, quindi estendere l'incisione iniziale e utilizzare la dissezione smussata per esporre la gabbia toracica.Usando una pinza emostatica, afferrare il tessuto epiteliale e adiposo sezionato e posizionarlo libero dall'area chirurgica. Per etichettare fluorescentemente i leucociti e il flusso sanguigno, somministrare un bolo di 2,5 millilitri per chilogrammo di Rhodamine 6G e FITC-albumina attraverso la vena della coda. Usando una pinza dentata, afferrare la costola immediatamente inferiore alla posizione della base del polmone all'estremità dell'ispirazione.Ritrarre leggermente la pinza per allontanare la costola dal polmone e quindi tagliare la costola per indurre uno pneumotorace. Estendere l'incisione lateralmente in entrambe le direzioni, facendo attenzione a non toccare il polmone. Afferrare la costola più alta successiva con una pinza smussata e ritrarsi leggermente per consentire al polmone di allontanarsi dalla parete toracica.Se il polmone non si stacca, premere leggermente la parete toracica contro il polmone per far sì che il polmone aderisca alla pleura sottostante e quindi cada più facilmente. Continuare l'incisione originale alla fine fino allo sterno e cranicamente fino a quando l'apice del polmone è esposto. Utilizzare applicatori di cotone e garze per attenuare qualsiasi sanguinamento che si presenta.Sollevare la gabbia toracica per esporre i vasi sanguigni intercostali sull'aspetto dorsale della cavità toracica, facendo attenzione a non danneggiare il polmone, cauterizzare il vaso intercostale più inferiore vicino alla colonna vertebrale, quindi tagliare la costola adiacente. Muovendosi cranicamente, e alla fine, utilizzare un modello ripetuto di cauterizzazione e taglio per asportare una porzione di circa uno per due centimetri della gabbia toracica. Per prepararsi all'imaging, trasferire la piattaforma di microscopia intravitale allo stadio del microscopio e posizionare la finestra di imaging direttamente sopra il polmone esposto.Utilizzare il micropolatore per abbassare attentamente la finestra di imaging fino a quando non aderisce e stabilizza la superficie polmonare. Per visualizzare la microcircolazione polmonare, utilizzare un microscopio a fluorescenza ad ampio campo dotato di un obiettivo 20x e set di filtri FITC e Rhodamine standard. Utilizzare una telecamera CCD in bianco e nero per registrare i video con un contrasto ottimale.Utilizzando il set di filtri FITC, identificare una sede polmonare in base al modello convergente del flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi con la sede a fuoco, quindi ripetere la registrazione nello stesso campo visivo utilizzando il filtro Rhodamine impostato per visualizzare i leucociti. Per individuare un'arteria polmonare, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un vaso con un modello divergente di flusso sanguigno e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti.Per localizzare le regioni capillari di interesse, utilizzare il set di filtri FITC per identificare un'area di alveoli e capillari non intersecati da vasi più grandi e registrare un video di 30 secondi. Ripeti la registrazione nello stesso campo visivo usando il set di filtri Rhodamine per visualizzare i leucociti. Questo video mostra l'imaging FITC del flusso sanguigno all'interno di una sede polmonare come indicato dalla freccia verde.L'imaging della rodamina consente la visualizzazione dei leucociti nella stessa sede con due leucociti aderenti indicati dalle frecce rosse. Questi metodi sono stati applicati anche per visualizzare gli stessi fenomeni e le arterie polmonari e le regioni capillari di interesse. Per dimostrare la quantificazione dei parametri microcircolatori, i topi sono stati trattati con LPS intranasale per indurre l'infiammazione polmonare.Il traffico di leucociti nelle sedi polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione e il rotolamento dei leucociti sono aumentati nei topi trattati con LPS. Il traffico leucocitario nelle arterie polmonari è mostrato qui con aree delineate che rappresentano le regioni endoteliali analizzate in topi naïve e trattati con LPS.L'adesione dei leucociti era più alta nei topi trattati con LPS. Questa figura mostra l'adesione dei leucociti all'interno dei capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. L'adesione dei leucociti ha dimostrato di essere più alta nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui.Questa figura mostra la perfusione di capillari polmonari in topi naïve e trattati con LPS. La densità capillare funzionale ha dimostrato di essere inferiore nei topi trattati con LPS rispetto agli ingenui. Ci sono molti aspetti impegnativi di questo protocollo.Ottimizzare il posizionamento del mouse sulla piattaforma è un semplice passo che può rendere le fasi chirurgiche e di imaging molto più riproducibili. Questa procedura è adattabile a una vasta gamma di parametri di studio e approcci microscopici. Pertanto, dovrebbe facilitare ulteriori ricerche sulla microcircolazione polmonare sia in stati sani che malati.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term intravitale Multiphoton Microscopia Imaging di cellule immunitarie in sani e malati di fegato Uso Mice CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...