Name: intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

著者らは、この原稿の編集と改訂において重要な専門知識を提供してくれたピナ・コラルッソ博士に感謝したいと思います。

ここで説明するすべての手順は、ダルハウジー大学実験動物委員会(UCLA)の事前承認を得て実施されました。
1. 準備
<ol><li>肺イメージングシステム:窓を準備するには、真空チャンネルの汚染を避けながら、外輪の上部に真空グリースの薄い層を投与します。清潔な8 mmガラスのカバースリップを窓の上に置き、静かに押し下げてシールを作成します。</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection.">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).</li><li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics.">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li><li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice.">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).</li><li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats.">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).</li><li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung.">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li><li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window.">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).</li><li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts.">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li><li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation.">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li><li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis.">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li><li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung.">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li><li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury:+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse.">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li><li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level:+Insights+from+lung+intravital+microscopy.">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).</li><li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6%+Hydroxyethyl+starch+(HES+130/0.4)+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice.">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li><li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice.">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li><li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).</li><li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis.">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li><li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock:+Relationship+to+hemodynamics,+oxygen+transport,+and+survival.">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li><li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system.">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo:+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research.">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration.">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li><li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., H&#252;ttmann, G., K&#246;nig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice.">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li><li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+observations+of+15-&#181;m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopic observations of 15-&#181;m microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li><li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li></ol>

ここで紹介するプロトコルでは、いくつかの重要なステップに練習と注意が必要です。まず、挿管や手術を開始する前にイメージングウィンドウを準備することが重要です。最小限の量の真空グリースを使用して、イメージングウィンドウの外輪をコーティングし、カバーガラスを塗布し、蒸留水1滴で吸引をテストします。これを事前に準備しておくと、そうでなければセットアップ中に露...

インバイタル顕微鏡(IVM)は、生体内のさまざまな生物物理学的プロセスを視覚化および研究するための有用なイメージングツールです。肺は、その囲まれた位置、その組織の脆弱な性質、および呼吸および心拍によって誘発される運動アーチファクトのために、インビボで画像化することは非常に困難である1,2。これらの課題を克服するために、肺微小循環における白血球-内皮相互作用のリアルタイムイメージングのために、さまざまな生体内顕微鏡(IVM)セットアップが開発されています。このようなアプローチは、画像化のために肺を外科的に露出させ、安定化させることに基づいている。
動物は、典型的には、外科的処置によって肺IVMのために調製される。まず、動物を挿管して換気し、胸部窓の外科的切除とその後の介入を可能にして、画像化のために肺を安定させる。1つの技法は、実質をガラスカバースリップ3に接着することを含み、これは、画像化された組織に重大な物理的外傷のリスクを冒す手順である。より高度なのは、ガラス窓4の下で肺を安定させるための真空システムの利用である。このセットアップは、広い局所領域に広がる可逆的真空を介して肺表面のカバースリップへの緩やかな接着を容易にし、x、y、およびz寸法4での動きを制限しながら肺を膨張させる。真空は、セットアップの撮像領域を囲むチャネルを介して均等に適用され、組織を撮像グレードのカバースリップ4に面した浅い円錐形領域に引き込む。この覗き窓を通して、肺微小循環は、様々な光学画像化モダリティを用いて研究することができる。
肺IVMは、多数の微小循環パラメータの定量的イメージングを可能にします。これらには、白血球トラック速度および長さ5、赤血球流速6および酸素化7、腫瘍転移8、免疫細胞亜集団9、10、11の区別、微粒子12の可視化、肺胞動態13、14、血管透過性15、および毛細血管機能16などの測定が含まれる。.ここでの焦点は、白血球の動員と毛細血管機能にあります。肺微小循環における白血球動員の開始は、白血球と内皮細胞との間の一過性の転がり相互作用および強固な接着相互作用を伴い、どちらも炎症条件下で増加する16,17。典型的には、圧延は、オペレータ定義の基準線を通過する白血球の数によって定量化され、一方、接着は、内皮16上で不動である白血球の数によって定量化される。毛細血管機能はまた、炎症状態において影響を受ける可能性があり、しばしば灌流の減少をもたらす。これは、赤血球変形能の低下18および病理学的シャント19をもたらす内皮細胞による誘導性NO合成酵素の多彩な発現を含むいくつかの要因に起因し得る。典型的には、面積当たりの灌流毛細血管の凝集体長が測定され、機能的毛細血管密度(FCD)として報告される。
肺における白血球動員をリアルタイムで研究するには、蛍光色素または蛍光標識抗体20で生物学的標的を標識する必要がある。あるいは、リゾチームM−green蛍光タンパク質(LysM−GFP)マウスなどの様々なトランスジェニックマウス系統を利用して、好中球21、22などの特異的免疫細胞サブセットを画像化することができる。蛍光標識された白血球は、次いで、広視野蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、または多光子顕微鏡を用いて可視化することができる。これらの技術は、特定の励起波長を利用し、放出された蛍光を検出すると同時に、励起波長の検出を遮断することによってコントラストを達成し、標識された物体を強調する。
マウス肺における白血球の転がり、接着、および機能的毛細血管密度の定量化に関する既存の研究は、主に手動ビデオ分析に依存してきた。これは、Fiji 6,23などのオープンソースソフトウェア、CapImage12などの独自のソフトウェア、またはカスタムメイドの画像処理システム24によって可能になります。逆に、様々なプロプライエタリなソフトウェアプラットフォーム(例えば、NIS Element、Imaris、Volocity、MetaMorph)は、ここで以前に言及したものの多くを含む、広範囲の他の生理学的パラメータの自動測定を可能にする5、6、7、8、9、10、11、12、13、15。
肺IVMを用いた急性肺損傷(ALI)および急性呼吸窮迫症候群(ARDS)の病理に関して重要な観察がなされている。ARDSは、肺水腫および肺胞障害を含む肺における多数の病態生理学的プロセスによって特徴付けられる、内皮および上皮障壁25の機能不全によって引き起こされる。マウスモデルを用いて、敗血症誘発性ALIが肺環境における免疫細胞輸送における有意な有害な変化と関連していることが見出された26。敗血症誘発性ALIを有するマウスの毛細血管に動員された好中球は、微小循環を妨害し、それによってALI26における低酸素症を増加させることが見出された。さらに、IVMは、ARDS27の発症後の修復の根底にあるメカニズムについての洞察を得るために使用されている。肺IVMはまた、様々な閉塞性肺疾患における病態生理学的変化を理解する上で貴重なツールとなっている。例えば、嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)などの疾患における粘液輸送の可視化は、粘液クリアランスに対する新規および既存の治療法の研究を促進している28。これらの条件下での白血球の密売も分析されている17.
このプロトコールは、Lammら29 によって最初に記載されたアプローチを拡張し、従来の蛍光顕微鏡を用いて白血球-内皮相互作用を研究する。説明されている手順は、16.5 cm x 12.7 cmの金属ベース、マイクロマニピュレータ、および真空イメージングウィンドウを含む in vivo 肺イメージングシステムを採用しています(図1)。このシステムは、20 cm x 23.5 cm の3Dプリントプラットフォーム(補足ファイル1)に取り付けられ、換気チューブと加熱パッドにしっかりと取り付けることができます。この方法は、 インビボでのマウス肺微小循環の再現性および定量化可能なイメージングを提供する。外科的準備の重要な側面、ならびに真空安定化肺画像化システムの適切な利用について詳細に説明される。最後に、ALIの実験モデルを用いて、炎症に関連する変化した白血球転がり、白血球接着、および毛細血管灌流の代表的な画像化および分析を提供する。このプロトコールの使用は、急性疾患状態における肺微小循環の病態生理学的変化に関するさらなる重要な調査を容易にするはずである。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm</td>
			<td>RWD Life Science Co.</td>
			<td>F12002-12</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9771-1G</td>
			<td>FITC-albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v</td>
			<td>Canadian Custom Packaging Company</td>
			<td>80002455</td>
			<td>Alcohol wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>00631069602029</td>
			<td>Digital video converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B/W - CCD - Camera</td>
			<td>Horn Imaging</td>
			<td>BC-71</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories International</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Cotton applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS-8R 8mm Round Glass Coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0701</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>ITM Instruments Inc.</td>
			<td>DG2551L0NAM02L0IM&#38;V</td>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope</td>
			<td>Dr. Mom Otoscopes</td>
			<td>1001</td>
			<td>Otoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1590110</td>
			<td>Labeling tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>ZA-07061-40</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Hemostatic forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC976VF</td>
			<td>Vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL</td>
			<td>Teligent Canada</td>
			<td>0121AD01</td>
			<td>Lidocaine HCl 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung SurgiBoard</td>
			<td>Luxidea, Inc.</td>
			<td>IMCH-0001</td>
			<td>Designed for intravital microscopy of the lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Teva Canada</td>
			<td>00485802</td>
			<td>Mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Endotracheal Intubation Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>ETI-MSE</td>
			<td>Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MST49 Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 022</td>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>566035</td>
			<td>20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>AMD-Ritmed</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>Gauze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare Eye Lube Plus</td>
			<td>Aventix</td>
			<td>5914322</td>
			<td>Tear gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Compressed</td>
			<td>Linde Canada Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305106</td>
			<td>30 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td>Vacuum flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3&#34;</td>
			<td>Primed</td>
			<td>PM5-630709</td>
			<td>Cloth tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>602-205</td>
			<td>1.0 mm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01, SS-04-module</td>
			<td>Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501216</td>
			<td>Toothed forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td>
			<td>3M</td>
			<td>7000002795</td>
			<td>Medical tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.</td>
			<td>Grainger Canada</td>
			<td>USSZUSA-HT3314</td>
			<td>1.0 cm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>6720-5002</td>
			<td>Inline 0.2&#181;m filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system

白血球-内皮相互作用の生体内イメージングは、生きた動物における免疫媒介性疾患に関する貴重な洞察を提供する。急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および他の呼吸器病変の インビボでの 研究は、肺のアクセスが限られており、固有の運動アーチファクトのために困難である。しかし、これらの課題を克服するために、様々なアプローチが開発されてきた。このプロトコールは、ALIの実験モデルにおいて肺微小循環におけるリアルタイムの白血球 - 内皮相互作用を研究するための生体内蛍光顕微鏡法の方法を記載している。 in vivo 肺イメージングシステムと3Dプリントされた生体内顕微鏡プラットフォームを使用して、麻酔をかけられたマウスを固定し、肺の交絡損傷を最小限に抑えながら肺を安定させます。調製後、広視野蛍光顕微鏡を用いて、白血球接着、白血球圧延、毛細血管機能を研究する。ここで提示されるプロトコルは、炎症性肺疾患の急性モデルにおける画像化に焦点を当てているが、肺における他の病理学的および生理学的プロセスを研究するためにも適合され得る。

このプロトコールを通じて達成可能な結果を例示するために、急性肺損傷(ALI)は、鼻腔内細菌性リポ多糖(LPS)点眼のモデルを用いた画像化の6時間前に誘導された。簡単に言えば、マウス(n = 3)をイソフルランで麻酔し、滅菌生理食塩水(10mg / mL)中の 緑膿菌 からのLPSの小さな液滴を5mg / kgの用量で左ナリスにピペットで移した。これをナイーブマウスと比較した(n=3;鼻腔内投与なし)。
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Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

生体内蛍光顕微鏡は、白血球 - 内皮相互作用および毛細血管灌流をリアルタイムで研究するために利用することができる。このプロトコルは、真空安定化肺画像化システムを使用して肺微小循環におけるこれらのパラメータを画像化および定量化する方法を記載する。

真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

このプロトコールは、インビボでの肺白血球接着および毛細血管灌流を画像化するための外科的調製および真空安定化系の使用を詳細に記載している。この技術の主な利点は、最小限の物理的外傷で無傷のミラーリング肺の安定した高解像度の生体内画像化を可能にすることである。まず、真空チャネルの汚染を避けながら、真空グリースの薄い層を外輪の上部に投与してイメージングウィンドウを準備します。清潔な8mmのガラスカバースリップを窓に置き、静かに押し下げてシールを作成します。イメージングウィンドウを、デジタル圧力計を取り付け、50〜60ミリメートルの水銀常吸引を提供できる真空ポンプに接続します。20ゲージの気管内カニューレに長さの光ファイバーケーブルを通し、先端をリドカインHCLに浸します。麻酔後、上部切歯が鏡面鏡の隙間に収まるように、修正された耳鏡を挿入します。喉頭蓋と声帯がはっきりと見えるまでスコープと舌の位置を調整します。スペキュラムの隙間に光ファイバケーブルを挿入し、小さな円形の動きを使用して声帯間のケーブルを通し、次に光ファイバケーブルをガイドとして使用して、カニューレを気管に静かにスライドさせてマウスを挿管します。1.5%イソフルランで換気を開始後、ペダル反射の検査で麻酔の深さを確認してください。カニューレを医療用テープで鼻に固定します。ラベリングテープを使用して、右前足を9時位置の加熱パッドに固定し、左後足を尾方向に伸ばして6時位置に固定します。布テープを使用して、左前足を12時の位置まで軽く伸ばし、テープのもう一方の端をバイタル内顕微鏡プラットフォームの上部に固定し、直腸温度プローブと足パルスオキシメーターを適用して、実験を通してバイタルサインを監視します。マウスを手術の準備をするには、胸郭と腹部を70%のアルコールワイプで滅菌し、ミネラルオイルの軽いコートを塗布してマウスの左側の髪を湿らせます。胸郭の底部付近に小さな切開を行って下層の筋肉層を露出させ、最初の切開部を延長し、鈍い解剖を使用して胸郭を露出させます。止血鉗子を用いて、解剖した上皮組織と脂肪組織をつかみ、手術領域の外側に置きます。白血球および血流を蛍光標識するために、ローダミン6GおよびFITCアルブミンのボーラスあたり2.5ミリリットルを尾静脈を介して投与する。歯付き鉗子を使用して、吸気終了時に肺の基部の位置にすぐ下の肋骨をつかむ。鉗子をわずかに引っ込めて肋骨を肺から引き離し、肋骨を切って気胸を誘発します。切開部を両方向に横方向に伸ばし、肺に触れないように注意してください。次に高い肋骨を鈍い鉗子でつかみ、肺が胸壁から落ちるようにわずかに引っ込めます。肺が外れない場合は、胸壁を肺に軽く押し当てて、肺を根底にある胸膜に付着させ、より簡単に脱落させます。最終的に胸骨まで、そして肺の頂点が露出するまで頭蓋に元の切開を続ける。綿のアプリケーターとガーゼを使用して、発生する出血を弱めます。胸郭を上げて胸腔の背側側面に肋間血管を露出させ、肺を傷つけないように注意し、脊柱の近くの最も下側の肋間血管を焼灼し、隣接する肋骨を切断する。頭蓋を動かし、最終的には、焼灼と切断の繰り返しパターンを使用して、胸郭の約1×2センチメートルの部分を切除する。イメージングの準備をするには、生体内顕微鏡プラットフォームを顕微鏡ステージに移し、イメージングウィンドウを露出した肺の真上に配置します。マイクロマニピュレータを使用して、イメージングウィンドウが肺表面に付着して安定するまで慎重に下げます。肺微小循環を視覚化するには、20倍の対物レンズと標準のFITCおよびローダミンフィルターセットを備えた広視野蛍光顕微鏡を使用します。白黒CCDカメラを使用して、最適なコントラストでビデオを録画します。FITCフィルターセットを使用して、血流の収束パターンに基づいて肺会場を特定し、会場に焦点を合わせた状態で30秒のビデオを録画した後、ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返して白血球を視覚化します。肺動脈を見つけるには、FITCフィルターセットを使用して、血流の発散パターンを持つ血管を識別し、30秒のビデオを録画します。ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返し、白血球を視覚化します。関心のある毛細血管領域を見つけるには、FITCフィルターセットを使用して、肺胞と毛細血管の領域を識別し、より大きな血管と交差していない毛細血管を識別し、30秒のビデオを録画します。ローダミンフィルターセットを使用して同じ視野で記録を繰り返し、白血球を視覚化します。このビデオは、緑色の矢印で示されているように、肺会場内の血流のFITCイメージングを描いています。ローダミンイメージングは、赤い矢印で示された2つの付着性白血球を用いて、同じ会場内の白血球の可視化を可能にする。これらの方法は、関心のある肺動脈および毛細血管領域と同様の現象を視覚化するためにも適用された。微小循環パラメータの定量化を実証するために、マウスを鼻腔内LPSで処置し、肺炎症を誘導した。肺施設における白血球の密輸は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける分析された内皮領域を表す概説された領域とともにここに示されている。白血球接着および転がりは、LPS処理マウスにおいて増加した。肺動脈における白血球のトラフィッキングは、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける分析された内皮領域を表す概説された領域と共にここに示されている。白血球接着はLPS処理マウスにおいて高かった。この図は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける肺毛細血管内の白血球接着を示す。白血球接着は、LPS処置マウスにおいてナイーブと比較してより高いことが示された。この図は、ナイーブおよびLPS処置マウスにおける肺毛細血管の灌流を示す。機能的毛細血管密度は、LPS処置マウスにおいてナイーブと比較して低いことが示された。このプロトコルには多くの挑戦的な側面があります。プラットフォーム上でのマウスの位置を最適化することは、外科的およびイメージングステップをはるかに再現性の高いものにすることができる簡単なステップです。この手順は、幅広い研究パラメータおよび顕微鏡アプローチに適応可能である。したがって、それは健康な状態と罹患状態の両方における肺微小循環のさらなる研究を促進するべきである。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

緑膿菌誘発肺傷害モデル

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...