Name: intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 절차는 Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA)의 사전 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>폐 이미징 시스템 : 창을 준비하려면 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상단에 얇은 진공 그리스를 투여하십시오. 깨끗한 8mm 유리 커버슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다.</li>
	<li>광역 형광 현미경: 20x/0.40 장거리 대?...

<ol>
	<li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection.">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).</li><li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics.">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li><li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice.">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).</li><li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats.">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).</li><li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung.">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li><li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window.">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).</li><li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts.">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li><li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation.">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li><li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis.">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li><li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung.">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li><li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury:+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse.">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li><li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level:+Insights+from+lung+intravital+microscopy.">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).</li><li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6%+Hydroxyethyl+starch+(HES+130/0.4)+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice.">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li><li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice.">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li><li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).</li><li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis.">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li><li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock:+Relationship+to+hemodynamics,+oxygen+transport,+and+survival.">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li><li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system.">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo:+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research.">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration.">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li><li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., H&#252;ttmann, G., K&#246;nig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice.">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li><li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+observations+of+15-&#181;m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopic observations of 15-&#181;m microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li><li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따...

생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.
동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 넓은 국소 영역에 걸쳐 확산되는 가역적 진공을 통해 커버슬립에 대한 폐 표면의 느슨한 부착을 용이하게 하고, x, y 및 z 치수4에서의 이동을 제한하면서 폐를 확장시킨다. 진공은 셋업의 이미징 영역을 둘러싸는 채널을 통해 고르게 적용되고, 이미징 등급 커버슬립(4)을 향하는 얕은 원뿔형 영역으로 조직을 당긴다. 이 시청 창을 통해, 폐 미세 순환은 다양한 광학 이미징 양식을 사용하여 연구 될 수 있습니다.
폐 IVM은 다수의 미세순환 파라미터의 정량적 이미징을 가능하게 한다. 여기에는 백혈구 추적 속도 및 길이5, 적혈구 유속6 및 산소화7, 종양 전이8, 면역 세포 하위집단의 구별 9,10,11, 미세입자의 시각화 12, 폐포 역학13,14, 혈관 투과성15, 및 모세관 기능 16과 같은 측정이 포함됩니다. . 여기서 초점은 백혈구 모집 및 모세관 기능에 있습니다. 폐 미세순환에서 백혈구 모집의 개시는 백혈구와 내피 세포 사이의 일시적인 롤링 상호작용 및 확고한 접착 상호작용을 포함하며, 둘 다 염증 조건 하에서 증가된다16,17. 전형적으로, 압연은 오퍼레이터-정의된 기준선을 통과하는 백혈구의 수에 의해 정량화되는 반면, 부착은 내피(16) 상에서 움직이지 않는 백혈구의 수에 의해 정량화된다. 모세관 기능은 또한 염증 상태에서 영향을 받을 수 있으며, 종종 관류 감소를 초래합니다. 이는 적혈구 변형성(18)의 감소 및 병리학적 션트(19)를 초래하는 내피 세포에 의한 유도성 NO 신타제의 잡색발현을 포함하는 몇몇 인자에 기인할 수 있다. 전형적으로, 면적당 관류된 모세혈관의 응집체 길이는 측정되고 기능적 모세관 밀도(FCD)로서 보고된다.
폐에서 백혈구 모집을 실시간으로 연구하려면 형광 염료 또는 형광 표지 항체20으로 생물학적 표적을 표지해야합니다. 대안적으로, 리소자임 M-녹색 형광 단백질(LysM-GFP) 마우스와 같은 다양한 트랜스제닉 마우스 균주는 호중구21,22와 같은 특이적 면역 세포 서브세트를 이미지화하는데 이용될 수 있다. 형광 표지된 백혈구는 광역 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 여기 파장을 활용하고 방출된 형광을 검출하는 동시에 여기 파장의 검출을 차단함으로써 대조를 달성함으로써 라벨링된 물체를 강조한다.
뮤린 폐에서 백혈구 롤링, 접착 및 기능적 모세관 밀도의 정량화에 관한 기존 연구는 주로 수동 비디오 분석에 의존해 왔습니다. 이것은 피지(6,23)와 같은 오픈 소스 소프트웨어, CapImage12와 같은 독점 소프트웨어 또는 맞춤형 이미지 처리 시스템(24)을 통해 가능하게 된다. 반대로, 다양한 독점 소프트웨어 플랫폼(예를 들어, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph)은 이전에 언급한 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15를 포함하는 다양한 다른 생리학적 파라미터들의 자동화된 측정을 가능하게 한다.
폐 IVM을 이용한 급성 폐 손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 병리학에 관한 중요한 관찰이 이루어졌습니다. ARDS는 내피 및 상피 장벽(25)의 기능장애로 인한 폐부종 및 폐포 손상을 포함하는 폐의 병리생리학적 과정의 숙주를 특징으로 한다. 뮤린 모델을 사용하여, 패혈증-유도된 ALI가 폐 환경에서의 면역 세포 밀매의 유의한 해로운 변화와 연관된다는 것이 밝혀졌다(26). 패혈증 유발 ALI를 가진 마우스의 모세혈관으로 모집된 호중구는 미세순환을 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 이로써 ALI26에서 저산소증이 증가하였다. 또한, IVM은 ARDS27의 발병 후 수리의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 폐 IVM은 또한 다양한 폐쇄성 폐 질환의 병리생리학적 변화를 이해하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 (CF) 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 같은 질병에서 점액 수송의 시각화는 점액 클리어런스28에 대한 신규 및 기존 치료법의 연구를 촉진시켰다. 이러한 조건하에서의 백혈구 밀매는또한 17 뿐만 아니라 분석되었다.
이 프로토콜은 Lamm et al.29 에 의해 초기에 기술된 접근법을 확장하여 기존의 형광 현미경을 사용하여 백혈구-내피 상호작용을 연구한다. 설명된 절차는 16.5 cm x 12.7 cm 금속 베이스, 미세 조작기 및 진공 이미징 윈도우를 포함하는 생체내 폐 영상 시스템을 채용한다(도 1). 이 시스템은 20cm x 23.5cm 3D 인쇄 플랫폼(보충 파일 1)에 장착되어 인공 호흡기 튜브 및 난방 패드에 안전하게 부착할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내에서 뮤린 폐 미세 순환의 재현 가능하고 정량화 가능한 이미징을 제공합니다. 수술 준비의 중요한 측면뿐만 아니라 진공 안정화 폐 영상 시스템의 적절한 활용이 자세히 설명된다. 마지막으로, ALI의 실험 모델은 염증과 관련된 변경된 백혈구 롤링, 백혈구 부착 및 모세관 관류의 대표적인 이미징 및 분석을 제공하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜의 사용은 급성 질환 상태 동안 폐 미세 순환의 병리 생리학적 변화에 대한 더 중요한 조사를 촉진해야한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm</td>
			<td>RWD Life Science Co.</td>
			<td>F12002-12</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9771-1G</td>
			<td>FITC-albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v</td>
			<td>Canadian Custom Packaging Company</td>
			<td>80002455</td>
			<td>Alcohol wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>00631069602029</td>
			<td>Digital video converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B/W - CCD - Camera</td>
			<td>Horn Imaging</td>
			<td>BC-71</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories International</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Cotton applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS-8R 8mm Round Glass Coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0701</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>ITM Instruments Inc.</td>
			<td>DG2551L0NAM02L0IM&#38;V</td>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope</td>
			<td>Dr. Mom Otoscopes</td>
			<td>1001</td>
			<td>Otoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1590110</td>
			<td>Labeling tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>ZA-07061-40</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Hemostatic forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC976VF</td>
			<td>Vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL</td>
			<td>Teligent Canada</td>
			<td>0121AD01</td>
			<td>Lidocaine HCl 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung SurgiBoard</td>
			<td>Luxidea, Inc.</td>
			<td>IMCH-0001</td>
			<td>Designed for intravital microscopy of the lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Teva Canada</td>
			<td>00485802</td>
			<td>Mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Endotracheal Intubation Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>ETI-MSE</td>
			<td>Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MST49 Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 022</td>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>566035</td>
			<td>20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>AMD-Ritmed</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>Gauze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare Eye Lube Plus</td>
			<td>Aventix</td>
			<td>5914322</td>
			<td>Tear gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Compressed</td>
			<td>Linde Canada Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305106</td>
			<td>30 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td>Vacuum flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3&#34;</td>
			<td>Primed</td>
			<td>PM5-630709</td>
			<td>Cloth tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>602-205</td>
			<td>1.0 mm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01, SS-04-module</td>
			<td>Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501216</td>
			<td>Toothed forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td>
			<td>3M</td>
			<td>7000002795</td>
			<td>Medical tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.</td>
			<td>Grainger Canada</td>
			<td>USSZUSA-HT3314</td>
			<td>1.0 cm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>6720-5002</td>
			<td>Inline 0.2&#181;m filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system

백혈구 - 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.

이 프로토콜을 통해 달성가능한 결과를 예시하기 위해, 급성 폐 손상 (ALI)은 비강 내 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) 점적의 모델을 사용하여 이미징하기 전에 6 h 동안 유도되었다. 간단히 말해서, 마우스 (n = 3)는 이소플루란으로 마취되었고, 멸균 식염수 (10 mg / mL)의 슈도모나스 aeruginosa 의 LPS의 작은 물방울을 5 mg / kg의 용량으로 왼쪽 나리스에 피펫팅했습니다. 이를 순진한 마우스와 비...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

이 프로토콜은 생체내에서 폐 백혈구 부착 및 모세관 관류를 이미지화하기 위해, 외과적 준비 및 진공 안정화 시스템의 사용을 상세히 기술한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 최소한의 물리적 외상으로 손상되지 않은 미러링 폐의 안정적인 고해상도 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 시작하려면, 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상부에 얇은 층의 진공 그리스를 투여하여 이미징 윈도우를 준비하십시오.깨끗한 8mm 유리 커버 슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다. 이미징 창을 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 연결하고 50~60mm의 수은 정수 흡입을 제공할 수 있습니다. 길이 광섬유 케이블을 20 게이지 기관내 캐뉼라를 통과시키고 팁을 리도카인 HCL에 잠기십시오.마취 후, 상부 절치가 검경의 틈새 내에 맞도록 수정 된 이토스코프를 삽입하십시오. epiglottis와 성대가 명확하게 보일 때까지 범위와 혀 위치를 조정하십시오. 검경의 틈새를 통해 광섬유 케이블을 삽입하고 작은 원형 움직임을 사용하여 성대 사이의 케이블을 통과 한 다음 광섬유 케이블을 가이드로 사용하여 캐뉼라를 기관으로 부드럽게 밀어 마우스를 삽관시킵니다.1.5 % 이소플루란으로 환기를 시작한 후 페달 반사 검사를 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 캐뉼라를 의료용 테이프로 주둥이에 고정하십시오. 라벨링 테이프를 사용하여 오른쪽 앞발을 아홉 시 방향의 가열 패드에 고정하고 왼쪽 뒷발을 가성으로 뻗어 여섯 시 위치에 고정하십시오.천 테이프를 사용하여 왼쪽 앞발을 12시 위치로 가볍게 펴고 테이프의 다른 쪽 끝을 생체 내 현미경 검사 플랫폼 상단에 고정시킨 다음 직장 온도 프로브와 발 맥박 산소 포화도 측정기를 적용하여 실험 전반에 걸쳐 활력 징후를 모니터링합니다. 수술을 위해 마우스를 준비하려면 70 % 알코올로 흉부와 복부를 살균하고 미네랄 오일의 라이트 코트를 적용하여 마우스 왼쪽의 머리카락을 적셔야합니다. 흉곽 케이지의 바닥 근처에 작은 절개를 만들어 기본 근육층을 노출 시킨 다음 초기 절개를 연장하고 무딘 해부를 사용하여 흉곽을 노출시킵니다.지혈 포셉을 사용하여 해부 된 상피 및 지방 조직을 파악하고 수술 부위를 깨끗하게하십시오. 백혈구와 혈류를 형광 표지하려면 꼬리 정맥을 통해 로다민 6G 및 FITC 알부민의 킬로그램 당 2.5 밀리리터의 볼루스를 투여하십시오. 이빨이 달린 집게를 사용하여 갈비뼈를 최종 영감에서 폐 기저부의 위치보다 즉시 열등하게 잡으십시오.포셉을 약간 후퇴시켜 갈비뼈를 폐에서 떼어낸 다음 갈비뼈를 잘라 기흉을 유발합니다. 절개를 양쪽 방향으로 옆으로 뻗어 폐에 닿지 않도록주의하십시오. 무딘 포셉으로 다음으로 높은 갈비뼈를 잡고 폐가 흉벽에서 떨어지도록 약간 후퇴하십시오.폐가 분리되지 않으면 흉벽을 폐에 가볍게 눌러 폐가 하부 흉막에 달라 붙게하여 더 쉽게 떨어집니다. 결국 흉골까지 원래의 절개를 계속하고 폐의 정점이 노출 될 때까지 두개골로 계속하십시오. 면화 도포기와 거즈를 사용하여 발생하는 출혈을 감쇠시킵니다.흉곽을 들어 흉강의 등쪽 측면에 늑간 혈관을 노출시키고, 폐를 손상시키지 않도록주의하고, 척추 기둥 근처에서 가장 열등한 늑간 혈관을 소작 한 다음 인접한 갈비뼈를 자릅니다. 두개골로 움직이고, 결국 반복되는 소작 및 절단 패턴을 사용하여 흉곽의 약 한 두 센티미터 부분을 소비합니다. 이미징을 준비하려면 생체 내 현미경 플랫폼을 현미경 단계로 옮기고 이미징 창을 노출 된 폐 바로 위에 놓습니다.마이크로 조작기를 사용하여 이미징 창이 폐 표면에 부착되고 안정화될 때까지 조심스럽게 낮춥니다. 폐 미세 순환을 시각화하려면 20x 대물 및 표준 FITC 및 로다민 필터 세트가 장착 된 넓은 필드 형광 현미경을 사용하십시오. 흑백 CCD 카메라를 사용하여 최적의 대비로 비디오를 녹화하십시오.FITC 필터 세트를 사용하여 혈류의 수렴 패턴을 기반으로 폐 장소를 식별하고 장소에 초점을 맞춘 30 초 비디오를 녹화 한 다음 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야각에서 녹화를 반복하십시오. 폐 동맥을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 다양한 혈류 패턴이 있는 혈관을 식별하고 30초 분량의 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오.관심 있는 모세관 영역을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 더 큰 혈관에 의해 교차되지 않는 폐포 및 모세혈관의 영역을 식별하고 30초 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오. 이 비디오는 녹색 화살표로 표시된 대로 폐 부위 내의 혈류에 대한 FITC 이미징을 묘사합니다.로다민 이미징은 빨간색 화살표로 표시된 두 개의 부착성 백혈구가있는 동일한 장소에서 백혈구를 시각화 할 수 있습니다. 이들 방법은 또한 동일한 현상과 폐동맥 및 모세혈관 관심 영역을 시각화하기 위해 적용되었다. 미세순환 파라미터의 정량화를 입증하기 위해, 마우스를 폐 염증을 유도하기 위해 비강내 LPS로 처리하였다.폐 장소에서의 백혈구 밀매는 순진하고 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 윤곽이 그려진 영역과 함께 여기에 표시된다. 백혈구 부착 및 압연은 LPS 처리된 마우스에서 증가하였다. 폐동맥에서의 백혈구 밀매는 순진한 및 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 개략적인 영역과 함께 여기에 도시되어 있다.백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 더 높았다. 이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관 내 백혈구 부착을 보여줍니다. 백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 순진한 마우스에 비해 더 높은 것으로 나타났다.이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관의 관류를 보여줍니다. 기능적 모세관 밀도는 LPS 처리된 마우스에서 나이브 대비 더 낮은 것으로 나타났다. 이 프로토콜에는 많은 도전적인 측면이 있습니다.플랫폼에서 마우스의 위치를 최적화하는 것은 수술 및 이미징 단계를 훨씬 더 재현 할 수있는 간단한 단계입니다. 이 절차는 광범위한 연구 매개 변수 및 현미경 접근법에 적용 할 수 있습니다. 따라서 건강한 상태와 병든 상태 모두에서 폐 미세 순환에 대한 추가 연구를 촉진해야합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

연구

면역학 및 감염병학

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

녹농균 유발 폐 손상 모델

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

복 포도 당 내성 검사, 폐 기능 측정 및 폐의 고정 비만 및 장애인된 대사 폐 결과에 미치는 영향 연구

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...