Name: intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System at JoVE.

Los autores desean agradecer al Dr. Pina Colarusso, quien proporcionó una experiencia significativa en la edición y revisión de este manuscrito.

Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron con la aprobación previa del Comité de Animales de Laboratorio de la Universidad de Dalhousie (UCLA).
1. Preparación
<ol><li>Sistema de imágenes pulmonares: Para preparar la ventana, administre una capa delgada de grasa al vacío en la parte superior del anillo exterior mientras evita la contaminación del canal de vacío. Coloque una cubierta de vidrio limpia de 8 mm en la ventana y presione suavemente hacia abajo p...

<ol>
	<li>Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+pulmonary+immune+response+in+inflammation+and+infection.">Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 620471 (2021).</li><li>Gaertner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+interpretation+of+intravital+microscopy+images+in+studies+of+lung+tissue+dynamics.">Toward a comprehensive interpretation of intravital microscopy images in studies of lung tissue dynamics.</a> Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 066009 (2015).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Looney, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature Methods. 8 (2), 91-96 (2011).</li><li>Bennewitz, M. F., Watkins, S. C., Sundda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+intravital+two-photon+excitation+microscopy+reveals+absence+of+pulmonary+vasoocclusion+in+unchallenged+sickle+cell+disease+mice.">Quantitative intravital two-photon excitation microscopy reveals absence of pulmonary vasoocclusion in unchallenged sickle cell disease mice.</a> IntraVital. 3 (2), 29748 (2014).</li><li>Blueschke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+microcirculatory+blood+flow+velocity+in+pulmonary+metastases+of+rats.">Automated measurement of microcirculatory blood flow velocity in pulmonary metastases of rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e51630 (2014).</li><li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung.">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (4), 474-481 (2013).</li><li>Rodriguez-Tirado, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+intravital+microscopy+in+the+lung+with+a+vacuum+stabilized+imaging+window.">Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54603 (2016).</li><li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts.">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and Immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li><li>Thanabalasuriar, A., Neupane, A. S., Wang, J., Krummel, M. F., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iNKT+cell+emigration+out+of+the+lung+vasculature+requires+neutrophils+and+monocyte-derived+dendritic+cells+in+inflammation.">iNKT cell emigration out of the lung vasculature requires neutrophils and monocyte-derived dendritic cells in inflammation.</a> Cell Reports. 16 (12), 3260-3272 (2016).</li><li>Neupane, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patrolling+alveolar+macrophages+conceal+bacteria+from+the+immune+system+to+maintain+homeostasis.">Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis.</a> Cell. 183 (1), 110-125 (2020).</li><li>Tschernig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualisation+of+microparticles+in+the+living+lung.">Direct visualisation of microparticles in the living lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (6), 883-886 (2013).</li><li>Mertens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+dynamics+in+acute+lung+injury:+Heterogeneous+distension+rather+than+cyclic+opening+and+collapse.">Alveolar dynamics in acute lung injury: Heterogeneous distension rather than cyclic opening and collapse.</a> Critical Care Medicine. 37 (9), 2604-2611 (2009).</li><li>Matuszak, J., Tabuchi, A., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventilation+and+perfusion+at+the+alveolar+level:+Insights+from+lung+intravital+microscopy.">Ventilation and perfusion at the alveolar level: Insights from lung intravital microscopy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 291 (2020).</li><li>Margraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6%+Hydroxyethyl+starch+(HES+130/0.4)+diminishes+glycocalyx+degradation+and+decreases+vascular+permeability+during+systemic+and+pulmonary+inflammation+in+mice.">6% Hydroxyethyl starch (HES 130/0.4) diminishes glycocalyx degradation and decreases vascular permeability during systemic and pulmonary inflammation in mice.</a> Critical Care. 22 (1), 1-12 (2018).</li><li>Roller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+in+vivo+observations+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1-mediated+leukocyte-endothelial+cell+interactions+in+the+pulmonary+microvasculature+in+abdominal+sepsis+in+mice.">Direct in vivo observations of P-selectin glycoprotein ligand-1-mediated leukocyte-endothelial cell interactions in the pulmonary microvasculature in abdominal sepsis in mice.</a> Inflammation Research. 62 (3), 275-282 (2012).</li><li>Marques, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+increases+endothelial+CXCL16-leukocyte+CXCR6+adhesion+in+vitro+and+in+vivo.+Potential+consequences+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease.">Cigarette smoke increases endothelial CXCL16-leukocyte CXCR6 adhesion in vitro and in vivo. Potential consequences in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1766 (2017).</li><li>Condon, M. R., Kim, J. E., Deitch, E. A., Machiedo, G. W., Spolarics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+an+erythrocyte+population+with+decreased+deformability+and+hemoglobin+content+following+sepsis.">Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (6), 2177-2184 (2003).</li><li>Trzeciak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+microcirculatory+perfusion+derangements+in+patients+with+severe+sepsis+and+septic+shock:+Relationship+to+hemodynamics,+oxygen+transport,+and+survival.">Early microcirculatory perfusion derangements in patients with severe sepsis and septic shock: Relationship to hemodynamics, oxygen transport, and survival.</a> Annals of Emergency Medicine. 49 (1), 88-98 (2007).</li><li>Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+intravital+imaging+of+leukocyte+migration+during+inflammation+in+the+respiratory+system.">Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system.</a> Acute and Critical Care. 34 (2), 101-107 (2019).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Orthgiess, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+exhibit+Lyz2+promoter+activity+in+vivo:+Implications+for+using+LysM-Cre+mice+in+myeloid+cell+research.">Neurons exhibit Lyz2 promoter activity in vivo: Implications for using LysM-Cre mice in myeloid cell research.</a> European Journal of Immunology. 46 (6), 1529-1532 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li><li>Butt, Y., Kurdowska, A., Allen, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+lung+injury:+A+clinical+and+molecular+review.">Acute lung injury: A clinical and molecular review.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 140 (4), 345-350 (2016).</li><li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury.">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).</li><li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration.">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li><li>Pieper, M., Schulz-Hildebrandt, H., Mall, M. A., H&#252;ttmann, G., K&#246;nig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+optical+coherence+tomography+imaging+to+assess+mucus-mobilizing+interventions+for+muco-obstructive+lung+disease+in+mice.">Intravital microscopic optical coherence tomography imaging to assess mucus-mobilizing interventions for muco-obstructive lung disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (3), 518-524 (2020).</li><li>Lamm, W. J. E., Bernard, S. L., Wiltz, W., Wagner, J., Glenny, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopic+observations+of+15-&#181;m+microspheres+lodging+in+the+pulmonary+microcirculation.">Intravital microscopic observations of 15-&#181;m microspheres lodging in the pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (6), 2242-2248 (2005).</li><li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+permanent+window+for+the+murine+lung+enables+high-resolution+imaging+of+cancer+metastasis.">A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis.</a> Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).</li><li>Amato, M. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+protective-ventilation+strategy+on+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome.">Effect of a protective-ventilation strategy on mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> New England Journal of Medicine. 338 (6), 347-354 (2009).</li><li>Looney, M. R., Bhattacharya, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+lung.">Live imaging of the lung.</a> Annual Review of Physiology. 76, 431-445 (2013).</li></ol>

El protocolo presentado aquí requiere práctica y atención a algunos pasos críticos. Primero, es importante preparar la ventana de imágenes antes de iniciar la intubación y la cirugía. Use una cantidad mínima de grasa al vacío para recubrir el anillo exterior de la ventana de imágenes, aplique el vidrio de la cubierta y pruebe la succión con una gota de agua destilada. Preparar esto con anticipación evitará que el pulmón expuesto se seque durante la configuración, de lo contrario. Si bien es posible enjuaga...

La microscopía intravital (IVM) es una herramienta de imagen útil para visualizar y estudiar diversos procesos biofísicos in vivo. El pulmón es muy difícil de obtener imágenes in vivo debido a su ubicación cerrada, la naturaleza frágil de su tejido y los artefactos de movimiento inducidos por la respiración y los latidos del corazón 1,2. Se han desarrollado varias configuraciones de microscopía intravital (IVM) para obtener imágenes en tiempo real de las interacciones leucocitarios-endoteliales en la microcirculación pulmonar para superar estos desafíos. Tales enfoques se basan en exponer quirúrgicamente y estabilizar el pulmón para obtener imágenes.
Los animales generalmente se preparan para la IVM pulmonar mediante procedimientos quirúrgicos. En primer lugar, los animales son intubados y ventilados, lo que permite la escisión quirúrgica de una ventana torácica y las intervenciones posteriores para estabilizar el pulmón para la obtención de imágenes. Una técnica consiste en pegar el parénquima en una cubierta de vidrio3, un procedimiento que corre el riesgo de un trauma físico significativo en el tejido fotografiado. Más avanzada es la utilización de un sistema de vacío para estabilizar el pulmón bajo una ventana de vidrio4. Esta configuración facilita la adherencia suelta de la superficie pulmonar a la cubierta a través de un vacío reversible extendido sobre una gran área local y expande el pulmón al tiempo que limita el movimiento en las dimensiones x, y y z4. El vacío se aplica uniformemente a través de un canal que rodea el área de imagen de la configuración y tira del tejido hacia una región cónica poco profunda frente al cobertor de grado de imagen4. A través de esta ventana de visualización, la microcirculación pulmonar se puede estudiar utilizando varias modalidades de imágenes ópticas.
La IVM pulmonar permite la obtención de imágenes cuantitativas de una multitud de parámetros microcirculatorios. Estos incluyen mediciones como la velocidad y longitudde la pista de leucocitos 5, la velocidad del flujo de glóbulos rojos6 y la oxigenación7, las metástasis tumorales8, la distinción de las subpoblaciones de células inmunes 9,10,11, la visualización de micropartículas12, la dinámica alveolar 13,14, la permeabilidad vascular15 y la función capilar 16 . El enfoque aquí está en el reclutamiento de leucocitos y la función capilar. El inicio del reclutamiento de leucocitos en la microcirculación pulmonar implica interacciones transitorias de rodadura e interacciones adhesivas firmes entre leucocitos y células endoteliales, las cuales se incrementan en condiciones inflamatorias16,17. Típicamente, el laminado se cuantifica por el número de leucocitos que pasan por una línea de referencia definida por el operador, mientras que la adhesión se cuantifica por el número de leucocitos que están inmóviles en el endotelio16. La función capilar también puede verse afectada en estados inflamatorios, lo que a menudo resulta en una disminución de la perfusión. Esto se puede atribuir a varios factores, incluida una reducción de la deformabilidad de los glóbulos rojos18 y la expresión abigarrada de la NO sintasa inducible por las células endoteliales que resulta en una derivación patológica19. Por lo general, la longitud agregada de los capilares perfundidos por área se mide y se informa como densidad capilar funcional (FCD).
El estudio del reclutamiento de leucocitos en los pulmones en tiempo real requiere el etiquetado de objetivos biológicos con colorantes fluorescentes o anticuerpos marcados con fluorescentes20. Alternativamente, varias cepas de ratones transgénicos como los ratones de la proteína fluorescente M-green lisozima (LysM-GFP) se pueden utilizar para obtener imágenes de subconjuntos específicos de células inmunes como los neutrófilos21,22. Los leucocitos marcados con fluorescentes se pueden visualizar utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio, microscopía confocal o microscopía multifotónica. Estas técnicas logran el contraste mediante la utilización de longitudes de onda de excitación específicas y la detección de la fluorescencia emitida, al tiempo que bloquean la detección de la longitud de onda de excitación, destacando así el objeto etiquetado.
La investigación existente sobre la cuantificación del laminado de leucocitos, la adhesión y la densidad capilar funcional en el pulmón murino se ha basado principalmente en el análisis manual de video. Esto es posible gracias al software de código abierto como Fiji 6,23, el software propietario como CapImage12 o los sistemas de procesamiento de imágenes personalizados24. Por el contrario, varias plataformas de software propietario (por ejemplo, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph) permiten la medición automatizada de una amplia gama de otros parámetros fisiológicos, incluidos muchos de los mencionados anteriormente aquí 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15.
Se han realizado observaciones importantes con respecto a la patología de la lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) utilizando la IVM pulmonar. El SDRA se caracteriza por una serie de procesos fisiopatológicos en el pulmón, incluyendo edema pulmonar y daño alveolar causado por la disfunción del endotelio y la barrera epitelial25. Utilizando un modelo murino, se ha encontrado que la ALI inducida por sepsis se asocia con cambios perjudiciales significativos en el tráfico de células inmunes en el entorno pulmonar26. Se encontró que los neutrófilos reclutados en los capilares de ratones con ALI inducida por sepsis impiden la microcirculación, lo que aumenta la hipoxia en ALI26. Además, la IVM se ha utilizado para obtener información sobre el mecanismo subyacente de reparación después de la aparición del SDRA27. La MIV pulmonar también ha sido una herramienta valiosa para comprender los cambios fisiopatológicos en diversas enfermedades pulmonares obstructivas. Por ejemplo, la visualización del transporte de moco en enfermedades como la fibrosis quística (FQ) y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) ha facilitado el estudio de tratamientos novedosos y existentes para el aclaramiento mucoso28. También se ha analizado el tráfico de leucocitos en estas condiciones17.
Este protocolo amplía el enfoque descrito inicialmente por Lamm et al.29 para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales mediante microscopía de fluorescencia convencional. Los procedimientos descritos emplean un sistema de imágenes pulmonares in vivo , que incluye una base metálica de 16,5 cm x 12,7 cm, un micromanipulador y una ventana de imágenes al vacío (Figura 1). El sistema está montado en una plataforma impresa en 3D de 20 cm x 23,5 cm (Archivo suplementario 1) para proporcionar una fijación segura para el tubo del ventilador y la almohadilla térmica. Este método ofrece imágenes reproducibles y cuantificables de la microcirculación pulmonar murina in vivo. Los aspectos importantes de la preparación quirúrgica, así como la utilización adecuada de un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas al vacío se explican en detalle. Finalmente, se utiliza un modelo experimental de ALI para proporcionar imágenes representativas y análisis de la alteración del laminado de leucocitos, la adhesión leucocitaria y la perfusión capilar asociada con la inflamación. El uso de este protocolo debería facilitar otras investigaciones importantes sobre los cambios fisiopatológicos en la microcirculación pulmonar durante los estados de enfermedad aguda.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ADSON Dressing Forceps, Tip width 0.6 mm, teeth length 11.5 mm, 12 cm</td>
			<td>RWD Life Science Co.</td>
			<td>F12002-12</td>
			<td>Blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin-Fluorescein Isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9771-1G</td>
			<td>FITC-albumin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Swab Isopropyl Alcohol 70% v/v</td>
			<td>Canadian Custom Packaging Company</td>
			<td>80002455</td>
			<td>Alcohol wipe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVDC110 Advanced Digital Video Converter</td>
			<td>Canopus</td>
			<td>00631069602029</td>
			<td>Digital video converter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B/W - CCD - Camera</td>
			<td>Horn Imaging</td>
			<td>BC-71</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovie Deluxe High Temperature Cautery Kit</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18010-00</td>
			<td>Cauterizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>Charles River Laboratories International</td>
			<td>C57BL/6NCrl</td>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>806-WC</td>
			<td>Cotton applicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CS-8R 8mm Round Glass Coverslip</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0701</td>
			<td>Glass coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
			<td>ITM Instruments Inc.</td>
			<td>DG2551L0NAM02L0IM&#38;V</td>
			<td>Digital Pressure Gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dr Mom Slimline Stainless LED Otoscope</td>
			<td>Dr. Mom Otoscopes</td>
			<td>1001</td>
			<td>Otoscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alchohol 95% Vol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>P016EA95</td>
			<td>95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Martensitic Stainless Steel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1590110</td>
			<td>Labeling tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gast DOA-P704-AA High-Capacity Vacuum Pump</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>ZA-07061-40</td>
			<td>Vacuum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostats</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Hemostatic forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>DC976VF</td>
			<td>Vacuum grease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td>Isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIDOcaine HCl Injection 1% 50 mg/5 mL</td>
			<td>Teligent Canada</td>
			<td>0121AD01</td>
			<td>Lidocaine HCl 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lung SurgiBoard</td>
			<td>Luxidea, Inc.</td>
			<td>IMCH-0001</td>
			<td>Designed for intravital microscopy of the lung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Teva Canada</td>
			<td>00485802</td>
			<td>Mineral oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Endotracheal Intubation Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>ETI-MSE</td>
			<td>Intubation stand, anesthesia mask, 20 G endotracheal cannula, fibre optic cable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MST49 Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10 450 022</td>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N Plan L 20x/0.40 Long Working Distance Microscope Objective</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>566035</td>
			<td>20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>AMD-Ritmed</td>
			<td>A2101-CH</td>
			<td>Gauze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare Eye Lube Plus</td>
			<td>Aventix</td>
			<td>5914322</td>
			<td>Tear gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D Printer</td>
			<td>Prusa Research</td>
			<td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen, Compressed</td>
			<td>Linde Canada Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Oxygen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305106</td>
			<td>30 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 5340-2L 5340 Filtering Flasks, 2000 mL</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>5340-2L</td>
			<td>Vacuum flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6 G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td>Rhodamine 6G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3&#34;</td>
			<td>Primed</td>
			<td>PM5-630709</td>
			<td>Cloth tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical Grade Tubing .040 in. ID x .085 in. OD</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>602-205</td>
			<td>1.0 mm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite Low-Flow Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SS-01, SS-04-module</td>
			<td>Small rodent ventilator, Low-flow anesthesia system, Heating pad, Rectal temperature probe, Pulse oximeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps, 12.5cm long, Curved, 1 x 2 Teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501216</td>
			<td>Toothed forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore Medical Tape, 1527-1, 1 in x 10 yd (2.5 cm x 9.1 m)</td>
			<td>3M</td>
			<td>7000002795</td>
			<td>Medical tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing,Clear,3/8 in Inside Dia.</td>
			<td>Grainger Canada</td>
			<td>USSZUSA-HT3314</td>
			<td>1.0 cm I.D. polyethylene tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 6720-5002 50 mm In-Line Filters, PTFE, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Cole-Parmer Canada Company</td>
			<td>6720-5002</td>
			<td>Inline 0.2&#181;m filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital widefield fluorescence microscopy of pulmonary microcirculation in experimental acute lung injury using a vacuum-stabilized imaging system

Las imágenes intravitales de las interacciones leucocitarios-endoteliales ofrecen información valiosa sobre la enfermedad inmunomediada en animales vivos. El estudio de la lesión pulmonar aguda (ALI) / síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y otras patologías respiratorias in vivo es difícil debido a la accesibilidad limitada y los artefactos de movimiento inherentes de los pulmones. No obstante, se han desarrollado varios enfoques para superar estos desafíos. Este protocolo describe un método para la microscopía de fluorescencia intravital para estudiar las interacciones leucocitarios-endoteliales en tiempo real en la microcirculación pulmonar en un modelo experimental de ALI. Se utiliza un sistema de imágenes pulmonares in vivo y una plataforma de microscopía intravital impresa en 3D para asegurar el ratón anestesiado y estabilizar el pulmón al tiempo que minimiza la lesión pulmonar confusa. Después de la preparación, la microscopía de fluorescencia de campo ancho se utiliza para estudiar la adhesión de leucocitos, el laminado de leucocitos y la función capilar. Si bien el protocolo presentado aquí se centra en la obtención de imágenes en un modelo agudo de enfermedad pulmonar inflamatoria, también puede adaptarse para estudiar otros procesos patológicos y fisiológicos en el pulmón.

Para ilustrar los resultados alcanzables a través de este protocolo, la lesión pulmonar aguda (ALI) se indujo 6 h antes de la obtención de imágenes utilizando un modelo de instilación de lipopolisacáridos bacterianos intranasales (LPS). Brevemente, los ratones (n = 3) fueron anestesiados con isoflurano, y pequeñas gotas de LPS de Pseudomonas aeruginosa en solución salina estéril (10 mg/ml) se pipetearon en el naris izquierdo a una dosis de 5 mg/kg. Esto se comparó con ratones ingenuos (n = 3; sin admin...

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Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

Este protocolo describe en detalle, la preparación quirúrgica y el uso de un sistema estabilizado al vacío para obtener imágenes de la adhesión de leucocitos pulmonares y la perfusión capilar in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que permite imágenes intravitales estables de alta resolución del pulmón reflejado intacto con un trauma físico mínimo. Para comenzar, prepare la ventana de imágenes administrando una capa delgada de grasa al vacío en la parte superior del anillo exterior mientras evita la contaminación del canal de vacío.Coloque un resbalón de cubierta de vidrio limpio de 8 milímetros en la ventana y presione suavemente hacia abajo para crear un sello. Conecte la ventana de imágenes a una bomba de vacío equipada con un manómetro digital y capaz de proporcionar de 50 a 60 milímetros de succión constante de mercurio. Pase una longitud de cable de fibra óptica a través de una cánula endotraqueal de calibre 20 y sumerja la punta en lidocaína HCL.Después de la anestesia, inserte un otoscopio modificado, de modo que los incisivos superiores encajen dentro del espacio en el espéculo. Ajuste el endoscopio y la posición de la lengua hasta que la epiglotis y las cuerdas vocales sean claramente visibles. Inserte el cable de fibra óptica a través del espacio en el espéculo y use pequeños movimientos circulares para pasar el cable entre las cuerdas vocales, luego use el cable de fibra óptica como guía, deslice suavemente la cánula en la tráquea para intubar el mouse.Después de comenzar la ventilación con isoflurano al 1,5%, confirme la profundidad de la anestesia mediante la prueba del reflejo del pedal. Asegure la cánula al hocico con cinta médica. Use cinta adhesiva para asegurar la pata delantera derecha a la almohadilla térmica en la posición de las nueve en punto y extienda la pata trasera izquierda caudalmente y asegúrela en la posición de las seis en punto.Usando una cinta de tela, estire ligeramente la pata delantera izquierda hasta la posición de las 12 en punto y asegure el otro extremo de la cinta hasta la parte superior de la plataforma de microscopía intravital, luego aplique una sonda de temperatura rectal y un oxímetro de pulso de pata para monitorear los signos vitales durante todo el experimento. Para preparar al ratón para la cirugía, esterilice el tórax y el abdomen con una toallita con alcohol al 70% y aplique una capa ligera de aceite mineral para humedecer el cabello en el lado izquierdo del ratón. Haga una pequeña incisión cerca de la parte inferior de la caja torácica para exponer la capa muscular subyacente, luego extienda la incisión inicial y use la disección contundente para exponer la caja torácica.Usando fórceps hemostáticos, agarre el tejido epitelial y adiposo diseccionado y colóquelo fuera del área quirúrgica. Para etiquetar fluorescentemente los leucocitos y el flujo sanguíneo, administre un bolo de 2,5 mililitros por kilogramo de rodamina 6G y FITC-albúmina a través de la vena de la cola. Usando pinzas dentadas, agarre la costilla inmediatamente inferior a la posición de la base del pulmón en la inspiración final.Retraiga ligeramente los fórceps para alejar la costilla del pulmón y luego corte la costilla para inducir un neumotórax. Extienda la incisión lateralmente en ambas direcciones, teniendo cuidado de no tocar el pulmón. Agarre la siguiente costilla más alta con fórceps romos y retraiga ligeramente para permitir que el pulmón se caiga lejos de la pared torácica.Si el pulmón no se desprende, presione la pared torácica ligeramente contra el pulmón para hacer que el pulmón se adhiera a la pleura subyacente y, por lo tanto, se caiga más fácilmente. Continúe la incisión original eventualmente hasta el esternón y cranealmente hasta que el ápice del pulmón esté expuesto. Use aplicadores de algodón y gasas para atenuar cualquier sangrado que surja.Levante la caja torácica para exponer los vasos sanguíneos intercostales en el aspecto dorsal de la cavidad torácica, teniendo cuidado de no dañar el pulmón, cauterice el vaso intercostal más inferior cerca de la columna vertebral y luego corte la costilla contigua. Moverse cranealmente, y eventualmente, usar un patrón repetido de cauterización y corte para extirpar una porción de aproximadamente uno por dos centímetros de la caja torácica. Para prepararse para la obtención de imágenes, transfiera la plataforma de microscopía intravital a la etapa del microscopio y coloque la ventana de imágenes directamente sobre el pulmón expuesto.Use el micromanipulador para bajar cuidadosamente la ventana de imágenes hasta que se adhiera y estabilice la superficie pulmonar. Para visualizar la microcirculación pulmonar, utilice un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un objetivo 20x y conjuntos de filtros ESTÁNDAR FITC y Rhodamine. Utilice una cámara CCD en blanco y negro para grabar los vídeos con un contraste óptimo.Usando el conjunto de filtros FITC, identifique un lugar pulmonar basado en el patrón convergente del flujo sanguíneo y grabe un video de 30 segundos con el lugar enfocado, luego repita la grabación en el mismo campo de visión usando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar leucocitos. Para localizar una arteria pulmonar, use el conjunto de filtros FITC para identificar un vaso con un patrón divergente de flujo sanguíneo y grabe un video de 30 segundos. Repita la grabación en el mismo campo de visión utilizando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar los leucocitos.Para localizar las regiones capilares de interés, utilice el conjunto de filtros FITC para identificar un área de alvéolos y capilares no intersectados por vasos más grandes y grabe un video de 30 segundos. Repita la grabación en el mismo campo de visión utilizando el conjunto de filtros de rodamina para visualizar los leucocitos. Este video muestra imágenes FITC del flujo sanguíneo dentro de un lugar pulmonar como lo indica la flecha verde.Las imágenes de rodamina permiten la visualización de leucocitos en el mismo lugar con dos leucocitos adherentes indicados por las flechas rojas. Estos métodos también se aplicaron para visualizar los mismos fenómenos y las arterias pulmonares y las regiones capilares de interés. Para demostrar la cuantificación de los parámetros microcirculatorios, los ratones fueron tratados con LPS intranasal para inducir inflamación pulmonar.El tráfico de leucocitos en lugares pulmonares se muestra aquí con áreas delineadas que representan las regiones endoteliales analizadas en ratones ingenuos y tratados con LPS. La adhesión y el laminado de leucocitos aumentaron en ratones tratados con LPS. El tráfico de leucocitos en las arterias pulmonares se muestra aquí con áreas delineadas que representan las regiones endoteliales analizadas en ratones ingenuos y tratados con LPS.La adhesión leucocitaria fue mayor en ratones tratados con LPS. Esta figura muestra la adhesión de leucocitos dentro de los capilares pulmonares en ratones ingenuos y tratados con LPS. Se demostró que la adhesión leucocitaria era mayor en ratones tratados con LPS versus naïve.Esta figura muestra la perfusión de capilares pulmonares en ratones ingenuos y tratados con LPS. Se demostró que la densidad capilar funcional era menor en ratones tratados con LPS versus naïve. Hay muchos aspectos desafiantes de este protocolo.Optimizar el posicionamiento del ratón en la plataforma es un paso simple que puede hacer que los pasos quirúrgicos y de imágenes sean mucho más reproducibles. Este procedimiento es adaptable a una amplia gama de parámetros de estudio y enfoques de microscopía. Por lo tanto, debe facilitar una mayor investigación de la microcirculación pulmonar tanto en estados sanos como enfermos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Investigación

Inmunología e Infección

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

La visualización de las respuestas inducidas por toxinas bacterianas mediante microscopía de fluorescencia de células en vivo

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Pseudomonas aeruginosa inducida por la lesión pulmonar Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal, medición de función pulmonar y la fijación del pulmón para estudiar el impacto de la obesidad y metabolismo deteriorado de resultados pulmonares

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

Proyección de imagen de interacción de células en Mucosa traqueal durante la infección del Virus de la Influenza usando microscopia Intravital de dos fotones

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...