Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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这项研究工作得到了美国国家科学基金会[CBET-1904921]和美国国立卫生研究院[NIH R01CA236350]的支持。

注意：本协议中使用的所有缓冲液和化学试剂都列在 表材料中。
1.剪切力显微镜的制备
注意：剪切力显微镜包含两部分，反应单元（均质器）和检测单元（荧光显微镜）。目镜的放大倍率为10倍，物镜（空气）的放大倍率为4倍。
<ol><li>将均质器和显微镜组装在安装台上。戴上护目镜并打开荧光显微镜，然后调整均质器以确保适...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

本手稿中描述的方案允许实时研究通过剪切力展开一组生物分子结构的集合。这里给出的结果强调了DNA i基序结构可以通过剪切力展开。配体结合的i基序的展开和剪切力驱动的点击反应是该集合力谱方法的概念验证应用。
图1 显示了仪器设置。均质机发生器尖端和反应室不得相互接触，这对于允许转子和定子之间的稳定剪切流而不会形成气泡至关重要。...

在单分子力谱1（SMFS）中，单个分子结构的机械性能已经通过原子力显微镜，光学镊子和磁性镊子2，3，4等精密仪器进行了研究。受力产生/检测装置中分子的相同方向性要求或磁镊和微型离心力显微镜（MCF）中的小视场的限制5，6，7，8，使用SMFS只能同时研究有限数量的分子。SMFS的低通量阻碍了其在分子识别领域的广泛应用，这需要大量分子的参与。
剪切流提供了一种潜在的解决方案，可以将力施加到大量分子上9。在通道内的液体流动中，越靠近通道表面，流速越慢10.这种流速梯度会导致平行于边界表面的剪切应力。当分子被放置在该剪切流中时，分子重新定向，使其长轴与流动方向对齐，因为剪切力施加到长轴11上。由于这种重新定向，所有相同类型（手柄的大小和长度）的分子预计将在经历相同剪切力的同时沿同一方向对齐。
这项工作描述了一种协议，使用这种剪切流对大量分子结构施加剪切力，如DNA i-motif所示。在该协议中，在均质器尖端的转子和定子之间产生剪切流。本研究发现，折叠的DNAi基序结构可以通过9724-97245 s−1的剪切速率展开。此外， 在L2H2-4OTD配体和i基序之间发现了36 μM的解离常数.该值与通过凝胶移位测定法12测量的31μM的值一致。此外，目前的技术用于展开i基序，其可以暴露螯合铜（I）以催化点击反应。因此，该协议允许人们在合理的时间（短于30分钟）内使用低成本仪器展开大量i-motif结构。鉴于剪切力技术大大提高了力谱的通量，我们将这种技术称为集成力谱（EFS）。该协议旨在提供实验指南，以促进这种基于剪切力的EFS的应用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

基于荧光和机械化学原理的单分子技术在生物传感中提供了卓越的灵敏度。然而，由于缺乏高通量能力，这些技术在生物物理学中的应用受到限制。集合力谱（EFS）通过将单个分子的机械化学研究转换为分子集合的机械化学研究，在研究大量分子结构方面表现出高通量。在该协议中，DNA二级结构（i-motifs）在均质机尖端的转子和定子之间的剪切流中以高达77796 / s的剪切速率展开。证明了流速和分子大小对i基序所经历的剪切力的影响。EFS技术还揭示了DNA i基序和配体之间的结合亲和力。此外，我们已经展示了一种可以通过剪切力驱动的点击化学反应（即机械点击化学）。这些结果确立了利用剪切力控制分子结构构象的有效性。

图 1 概述了 EFS 中集成分子的机械展开和实时传感。在图1B中，观察到i-motif DNA的荧光强度随着pH 5.5 MES缓冲液中9，724 s−1至97，245 s−1的剪切速率而增加。作为对照，当在pH 7.4 MES缓冲液中以63，209 s−1的速率剪切相同的i-motif DNA时，荧光强度没有增加。这是因为 i 基序在 pH 7.414 时不会折叠。在前面?...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

集合力谱（EFS）是一种强大的技术，用于在生物物理和生物传感领域对一组集成的生物分子结构进行机械展开和实时传感。

剪切力的集合力谱

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

该协议提供了一种高通量技术来研究DNA和配体之间的分子间结合。该技术在大量生物分子结构的研究中已显示出高通量。它通过将单个分子的机械化学性质转换为分子集合的机械化学性质来实现。我认为这是一个非常向前迈出的实验，但几乎没有关键的步骤。例如，显微镜、均质器和反应管的对准。这三件事应该完美对齐，以便准确跟踪荧光的变化。首先将均质器和显微镜组装在安装台上。戴上护目镜后，打开荧光显微镜，然后调整均质器，确保激发光束穿过均质器分散尖端的中心。然后准备一个高5厘米，横截面为1.5×1.5平方厘米的平底反应室，确保所选的室材料不会发出荧光以减少背景。然后，将反应室夹在荧光显微镜的样品台上，然后调整室以保持均质器的分散尖端，确保尖端略高于反应室的底面。接下来，一起调整均质器和腔室的垂直位置，以确保显微镜的焦点在分散尖端的表面上。然后调整分散头的水平位置，确保在转子和定子之间设置检测区域。打开荧光通道，根据实验中使用的荧光染料。在高速剪切实验之前，使用去离子水测试低剪切速度的剪切。首先，如手稿中所述，在去离子水中分别在其两端用染料和淬灭剂标记的人端粒i-motif DNA。接下来，在pH 5.5或pH 7.4的30毫摩尔MES缓冲液中将DNA稀释至5微摩尔。向DNA溶液中，加入0至60微摩尔浓度范围内的配体L2H24OTD“，轻轻混合溶液10分钟，以在没有光的情况下折叠i-motif结构。使用荧光显微镜检查并最小化充满去离子水的反应室的背景荧光强度，而无需剪切。然后使用软件设置CCD相机的参数，曝光时间为0.5秒，CCD感光度为1， 600，记录时间等于20分钟。使用长移液管将DNA溶液加入空且干净的反应室中，并用黑匣子盖住反应室。然后启动均质机，以选定的剪切速率从每秒9， 724到每秒97， 245进行剪切，持续20分钟，打开CCD相机记录数据。实验结束后，取出腔室并用去离子水洗涤。准备i-motif DNA和去离子水。然后，孵育 10 微摩尔 i-motif DNA 和 300 μL 30 毫摩尔 tris 缓冲液，补充有 150 微摩尔氯化铜和 300 微摩尔抗坏血酸 10 分钟以折叠 i-motif 结构。接下来用超滤装置以14，300倍G的离心力超滤溶液.每次过滤后用补充有300微摩尔抗坏血酸的30毫摩尔tris缓冲液将溶液补充至约500微升。收集残留溶液后，通过加入补充有 300 微摩尔抗坏血酸的 30 毫摩尔 tris 以及 20 微摩尔 CalFluor 488 叠氮化物、20 微摩尔 HPG 和 10 微摩尔 TBTA 制成 300 微升的最终体积。添加试剂后，将溶液移至暗室。然后在剪切实验之前使用显微镜检查并最小化充满去离子水的反应室的背景荧光强度。接下来，用长移液管将DNA溶液加入空的反应室中，然后在CCD相机打开的情况下，以每秒63，209的剪切速率启动均质机剪切20分钟。实验结束后，取出腔室并用去离子水洗涤。在pH 5.5 MES缓冲液中，观察到i-motif DNA的荧光强度随着每秒9， 724到每秒97， 245的绝对速率而增加。然而，当以每秒63， 209的速率剪切相同的i-motif DNA时，荧光强度没有增加，因为它在MES缓冲液中的pH 7.4下不会折叠。评估了在纯流动下与DNA i-motif分子的配体结合，结果表明荧光强度的增加随着配体浓度的增加而变得不那么明显。确定配体和i基序之间相互作用的解离常数，发现为34微摩尔。铜一螯合i基序以每秒63， 209的剪切速率展开，释放的铜基序触发荧光点击反应，导致荧光强度随时间增加。首先，确保检测区域设置在转子和定子之间。其次，检查并尽量减少荧光背景。最后，确保在执行点击反应之前过滤反应。这种方法为探索机械强度、折叠和展开各种聚合物打开了大门。它可能是其他DNA结构，蛋白质或其他聚合物，以及它们与其他类型的分子的相互作用。如前所述，可以使用这种方法研究其他几种大分子。

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