Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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Ce travail de recherche a été soutenu par la National Science Foundation [CBET-1904921] et les National Institutes of Health [NIH R01CA236350] à H. M.

REMARQUE : Tous les tampons et les réactifs chimiques utilisés dans ce protocole sont énumérés dans le tableau des matériaux.
1. Préparation du microscope à force de cisaillement
REMARQUE: Le microscope à force de cisaillement contient deux parties, une unité de réaction (homogénéisateur) et une unité de détection (microscope à fluorescence). Le grossissement de l’oculaire est de 10x et le grossissement de la lentill...

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	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’étudier en temps réel le déroulement d’un ensemble de structures biomoléculaires par force de cisaillement. Les résultats présentés ici soulignent que les structures à motif d’ADN peuvent être dépliées par la force de cisaillement. Le déploiement du motif i lié au ligand et les réactions de clic actionnées par la force de cisaillement étaient des applications de preuve de concept pour cette méthode de spectroscopie de force d’ensemble.
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En spectroscopie de forcemonomoléculaire 1 (SMFS), les propriétés mécaniques de structures moléculaires individuelles ont été étudiées par des instruments sophistiqués tels que le microscope à force atomique, les pinces optiques et les pinces magnétiques 2,3,4. Limité par la même exigence de directionnalité des molécules dans les configurations de génération de force / détection ou le petit champ de vision dans les pinces magnétiques et le microscope de force de centrifugeuse miniature (MCF)5,6,7,8, seul un nombre limité de molécules peut être étudié simultanément en utilisant SMFS. Le faible débit de SMFS empêche sa large application dans le domaine de la reconnaissance moléculaire, qui nécessite l’implication d’un grand ensemble de molécules.
L’écoulement de cisaillement fournit une solution potentielle pour appliquer des forces à un ensemble massif de molécules9. Dans un écoulement de liquide à l’intérieur d’un canal, plus le débit est proche de la surface du canal, plus le débit10 est lent. Un tel gradient de vitesse d’écoulement provoque une contrainte de cisaillement parallèle à la surface limite. Lorsqu’une molécule est placée dans cet écoulement de cisaillement, la molécule se réoriente de sorte que son axe long s’aligne avec la direction de l’écoulement, car la force de cisaillement est appliquée à l’axe long11. Du fait de cette réorientation, toutes les molécules du même type (taille et longueur des poignées) devraient s’aligner dans la même direction tout en subissant la même force de cisaillement.
Ce travail décrit un protocole permettant d’utiliser un tel flux de cisaillement pour exercer une force de cisaillement sur un ensemble massif de structures moléculaires, comme en témoigne le motif i de l’ADN. Dans ce protocole, un flux de cisaillement est généré entre le rotor et le stator dans une pointe d’homogénéisateur. La présente étude a révélé que la structure du motif i de l’ADN plié pouvait être dépliée par des taux de cisaillement de 9724-97245 s−1. En outre, une constante de dissociation de 36 μM a été trouvée entre le ligand L2H2-4OTD et le i-motif. Cette valeur est cohérente avec celle de 31 μM mesurée par le test de décalage de gel12. De plus, la technique actuelle est utilisée pour déplier le i-motif, qui peut exposer le cuivre chélaté (I) pour catalyser une réaction de clic. Ce protocole permet ainsi de déplier un grand ensemble de structures i-motif avec des instruments à faible coût dans un temps raisonnable (moins de 30 min). Étant donné que la technique de la force de cisaillement augmente considérablement le débit de la spectroscopie de force, nous appelons cette technique spectroscopie de force d’ensemble (EFS). Ce protocole vise à fournir des lignes directrices expérimentales pour faciliter l’application de cet EFS basé sur la force de cisaillement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Les techniques monomoléculaires basées sur la fluorescence et les principes mécanochimiques offrent une sensibilité supérieure dans la détection biologique. Cependant, en raison du manque de capacités de haut débit, l’application de ces techniques est limitée en biophysique. La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) a démontré un débit élevé dans l’étude d’un ensemble massif de structures moléculaires en convertissant les études mécanochimiques de molécules individuelles en celles d’ensembles moléculaires. Dans ce protocole, les structures secondaires de l’ADN (i-motifs) ont été déployées dans le flux de cisaillement entre le rotor et le stator d’une pointe d’homogénéisateur à des vitesses de cisaillement allant jusqu’à 77796/s. Les effets des débits et des tailles moléculaires sur les forces de cisaillement subies par le motif i ont été démontrés. La technique EFS a également révélé l’affinité de liaison entre les motifs de l’ADN i et les ligands. De plus, nous avons démontré une réaction de chimie de clic qui peut être actionnée par la force de cisaillement (c’est-à-dire la chimie mécano-clic). Ces résultats établissent l’efficacité de l’utilisation de la force de cisaillement pour contrôler la conformation des structures moléculaires.

La figure 1 décrit le déploiement mécanique et la détection en temps réel des molécules d’ensemble dans EFS. Dans la figure 1B, on a observé que l’intensité de fluorescence de l’ADN i-motif augmentait avec le taux de cisaillement allant de 9 724 s−1 à 97 245 s−1 dans un tampon de pH 5,5 MES. En tant que témoin, l’intensité de fluorescence n’a pas augmenté lorsque le même ADN i-motif a été cisai...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

La spectroscopie de force d’ensemble (EFS) est une technique robuste pour le déploiement mécanique et la détection en temps réel d’un ensemble de structures biomoléculaires dans les domaines biophysiques et biosensoriels.

Spectroscopie de force d’ensemble par forces de cisaillement

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Ce protocole fournit une technique à haut débit pour étudier la liaison intermoléculaire entre l’ADN et les ligands. Cette technique a démontré un débit élevé dans l’étude d’un ensemble massif de structures biomoléculaires. Il le fait en convertissant les propriétés chimiques mécaniques des molécules individuelles en celles des ensembles moléculaires.Je pense que c’est une expérience très avancée, mais il y a peu d’étapes critiques. Par exemple, l’alignement du microscope, de l’homogénéisateur et du tube de réaction. Ces trois éléments doivent être parfaitement alignés afin de suivre avec précision le changement de fluorescence.Commencez par assembler l’homogénéisateur et le microscope sur une table de montage. Après avoir porté des lunettes, allumez le microscope à fluorescence, puis ajustez l’homogénéisateur pour vous assurer que le faisceau lumineux d’excitation passe par le centre de l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur. Ensuite, préparez une chambre de réaction à fond plat de cinq centimètres de hauteur et de 1,5 centimètre carré sur 1,5 centimètre carré de section, en veillant à ce que le matériau de chambre choisi ne devienne pas fluorescent pour réduire le bruit de fond.Ensuite, serrez la chambre de réaction sur l’étage d’échantillonnage du microscope à fluorescence, puis ajustez la chambre pour maintenir l’extrémité dispersante de l’homogénéisateur, en veillant à ce que la pointe soit légèrement au-dessus de la surface inférieure de la chambre de réaction. Ensuite, ajustez la position verticale de l’homogénéisateur et de la chambre ensemble pour vous assurer que le microscope est focalisé sur la surface de la pointe de dispersion. Ajustez ensuite la position horizontale de l’extrémité dispersante pour vous assurer que la zone de détection est définie entre le rotor et le statère.Allumez les canaux fluorescents, selon le colorant fluorescent utilisé dans l’expérience. Avant l’expérience de cisaillement à grande vitesse, on utilisait de l’eau désionisée pour tester le cisaillement à faible vitesse de cisaillement. Tout d’abord, préparez un ADN télomérique humain à motif i marqué avec un colorant et un quencher à ses deux extrémités respectivement dans de l’eau désionisée comme décrit dans le manuscrit.Ensuite, diluez l’ADN à cinq micromolaires dans un tampon MES de 30 millimolaires à pH 5,5 ou pH 7,4. À la solution d’ADN, ajouter le ligand L2H24OTD"dans une plage de concentration de zéro à 60 micromolaires et mélanger doucement la solution pendant 10 minutes pour replier les structures i-motif sans lumière. Vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau désionisée à l’aide du microscope fluorescent sans cisaillement.Réglez ensuite les paramètres de la caméra CCD à l’aide du logiciel avec un temps d’exposition de 0,5 seconde, une sensibilité CCD de 1 600 et une durée d’enregistrement égale à 20 minutes. À l’aide d’une longue pipette, ajoutez la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide et propre et couvrez la chambre de réaction d’une boîte noire. Démarrez ensuite l’homogénéisateur pour effectuer un cisaillement à une fréquence de cisaillement sélectionnée allant de 9 724 par seconde à 97, 245 par seconde pendant 20 minutes, avec la caméra CCD allumée pour enregistrer les données.Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la à l’eau désionisée. Préparez l’ADN i-motif et l’eau désionisée. Ensuite, incuber 10 micromolaires d’ADN i-motif et 300 microlitres de tampon tris millimolaire 30 millimolaires complétés par 150 micromolaires de chlorure cuivrique et 300 micromolaires d’acide ascorbique pendant 10 minutes pour plier les structures i-motif.Ensuite, ultra filtrez la solution avec un dispositif d’ultrafiltration à une force centrifuge de 14 300 fois G.Reconstituer la solution à environ 500 microlitres avec 30 tampons tris millimolaires complétés par 300 micromolaires d’acide ascorbique après chaque filtration. Après avoir recueilli la solution résiduelle, faire un volume final de 300 microlitres en ajoutant 30 tris millimolaires complétés par 300 micromolaires d’acide ascorbique avec 20 micromolaires CalFluor 488 azotures, 20 micromolaires HPG et 10 micromolaires TBTA. Une fois les réactifs ajoutés, déplacez la solution dans la chambre noire.Ensuite, vérifiez et minimisez l’intensité de fluorescence de fond de la chambre de réaction remplie d’eau désionisée à l’aide du microscope avant les expériences de cisaillement. Ensuite, ajoutez la solution d’ADN dans la chambre de réaction vide avec une longue pipette, puis démarrez le cisaillement de l’homogénéisateur à une fréquence de cisaillement de 63, 209 par seconde pendant 20 minutes avec la caméra CCD allumée. Après l’expérience, retirez la chambre et lavez-la à l’eau désionisée.L’intensité de fluorescence de l’ADN i-motif a été observée pour augmenter avec le taux allant de 9, 724 par seconde à 97, 245 par seconde dans un tampon de pH 5,5 MES. Cependant, l’intensité de fluorescence n’a pas augmenté lorsque le même ADN i-motif a été cisaillé à un taux de 63, 209 par seconde, car il ne se replie pas à pH 7,4 dans le tampon MES. La liaison du ligand aux molécules d’ADN i-motif soumises au flux pur a été évaluée, ce qui a montré que l’augmentation de l’intensité de fluorescence devenait moins évidente avec l’augmentation de la concentration du ligand.La constante de dissociation a été déterminée pour l’interaction entre le ligand et le motif i et s’est avérée être de 34 micromoles. Le motif i chélaté en cuivre a été déplié à la vitesse de cisaillement de 63, 209 par seconde, et celui en cuivre libéré a déclenché la réaction de clic fluorgénique, ce qui a entraîné une augmentation de l’intensité de fluorescence au fil du temps. Tout d’abord, assurez-vous que la zone de détection est définie entre le rotor et le stater.Deuxièmement, vérifiez et minimisez le fond de fluorescence. Et enfin, assurez-vous de filtrer la réaction avant d’effectuer une réaction de clic. Cette méthode ouvre une porte pour explorer la résistance mécanique, le pliage et le dépliage de toutes sortes de polymères.Il pourrait s’agir d’autres structures d’ADN, de protéines ou d’autres polymères, et de leur interaction avec d’autres types de molécules. Comme nous l’avons dit, plusieurs autres macromolécules pourraient être étudiées en utilisant cette approche.

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