Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Diese Forschungsarbeiten wurden von der National Science Foundation [CBET-1904921] und den National Institutes of Health [NIH R01CA236350] bis H. M.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Puffer und chemischen Reagenzien sind in der Tabelle Materialien aufgeführt.
1. Vorbereitung des Scherkraftmikroskops
HINWEIS: Das Scherkraftmikroskop besteht aus zwei Teilen, einer Reaktionseinheit (Homogenisator) und einer Detektionseinheit (Fluoreszenzmikroskop). Die Vergrößerung des Okulars beträgt 10x und die Vergrößerung der Objektivlinse (Luft) ist 4x.
<ol><li>Montieren Si...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll ermöglicht die Echtzeituntersuchung der Entfaltung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen durch Scherkraft. Die hier vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, dass DNA-i-Motivstrukturen durch Scherkraft entfaltet werden können. Die Entfaltung des ligandengebundenen i-Motivs und die Scherkraft-betätigten Klickreaktionen waren Proof-of-Concept-Anwendungen für diese Ensemble-Kraftspektroskopie-Methode.
Abbildung 1</st...

In der Einzelmolekül-Kraftspektroskopie1 (SMFS) wurden die mechanischen Eigenschaften einzelner Molekülstrukturen mit hochentwickelten Instrumenten wie dem Rasterkraftmikroskop, einer optischen Pinzette und einer Magnetpinzette 2,3,4 untersucht. Eingeschränkt durch die gleiche Richtungsanforderung der Moleküle in den krafterzeugenden/detektierenden Aufbauten oder das kleine Sichtfeld in Magnetpinzetten und dem Miniatur-Zentrifugenkraftmikroskop (MCF)5,6,7,8, kann nur eine begrenzte Anzahl von Molekülen gleichzeitig mit SMFS untersucht werden. Der geringe Durchsatz von SMFS verhindert seine breite Anwendung im Bereich der molekularen Erkennung, was die Beteiligung einer großen Anzahl von Molekülen erfordert.
Die Scherströmung bietet eine mögliche Lösung, um Kräfte auf eine massive Gruppe von Molekülen auszuüben9. In einer Flüssigkeitsströmung innerhalb eines Kanals gilt: Je näher an der Kanaloberfläche, desto langsamer ist die Durchflussrate10. Ein solcher Strömungsgeschwindigkeitsgradient verursacht eine Schubspannung, die parallel zur Grenzfläche verläuft. Wenn ein Molekül in diese Scherströmung gebracht wird, orientiert sich das Molekül so, dass seine Längsachse mit der Strömungsrichtung übereinstimmt, da die Querkraft auf die lange Achse11 aufgebracht wird. Als Ergebnis dieser Neuorientierung wird erwartet, dass sich alle Moleküle des gleichen Typs (Größe und Länge der Griffe) in die gleiche Richtung ausrichten, während sie die gleiche Scherkraft erfahren.
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, um eine solche Scherströmung zu verwenden, um Scherkraft auf einen massiven Satz molekularer Strukturen auszuüben, wie das DNA-i-Motiv veranschaulicht. Bei diesem Protokoll wird eine Scherströmung zwischen Rotor und Stator in einer Homogenisatorspitze erzeugt. Die vorliegende Studie ergab, dass die gefaltete DNA-i-Motivstruktur durch Scherraten von 9724-97245 s−1 entfaltet werden konnte. Außerdem wurde eine Dissoziationskonstante von 36 μM zwischen dem L2H2-4OTD-Liganden und dem i-Motiv gefunden. Dieser Wert stimmt mit dem Wert von 31 μM überein, gemessen mit dem Gelverschiebungsassay12. Weiterhin wird die aktuelle Technik verwendet, um das i-Motiv zu entfalten, das das chelatierte Kupfer (I) freilegen kann, um eine Klickreaktion zu katalysieren. Dieses Protokoll ermöglicht es somit, einen großen Satz von i-Motiv-Strukturen mit kostengünstigen Instrumenten in angemessener Zeit (kürzer als 30 min) zu entfalten. Da die Querkrafttechnik den Durchsatz der Kraftspektroskopie drastisch erhöht, nennen wir diese Technik Ensemblekraftspektroskopie (EFS). Dieses Protokoll zielt darauf ab, experimentelle Richtlinien bereitzustellen, um die Anwendung dieses auf Scherkraft basierenden EFS zu erleichtern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Einzelmolekültechniken, die auf Fluoreszenz und mechanochemischen Prinzipien basieren, bieten eine überlegene Empfindlichkeit in der biologischen Sensorik. Aufgrund des Mangels an Hochdurchsatzkapazitäten ist die Anwendung dieser Techniken in der Biophysik jedoch begrenzt. Die Ensemble-Kraft-Spektroskopie (EFS) hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung eines massiven Satzes molekularer Strukturen gezeigt, indem mechanochemische Untersuchungen einzelner Moleküle in solche von molekularen Ensembles umgewandelt wurden. In diesem Protokoll wurden die DNA-Sekundärstrukturen (i-Motive) im Scherstrom zwischen Rotor und Stator einer Homogenisatorspitze mit Scherraten bis zu 77796/s entfaltet. Die Auswirkungen von Durchflussraten und Molekülgrößen auf die Scherkräfte des i-Motivs wurden nachgewiesen. Die EFS-Technik zeigte auch die Bindungsaffinität zwischen DNA-i-Motiven und Liganden. Darüber hinaus haben wir eine Klickchemiereaktion demonstriert, die durch Scherkraft (d.h. Mechano-Klick-Chemie) ausgelöst werden kann. Diese Ergebnisse belegen die Wirksamkeit der Verwendung von Scherkraft zur Kontrolle der Konformation molekularer Strukturen.

Abbildung 1 zeigt die mechanische Entfaltung und Echtzeiterfassung von Ensemblemolekülen in EFS. In Abbildung 1B wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit einer Scherrate von 9.724 s−1 bis 97.245 s−1 in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Als Kontrolle wurde die Fluoreszenzintensität nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63.209 s−1 in einem pH-Puffer vo...

Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Die Ensemblekraftspektroskopie (EFS) ist eine robuste Technik zur mechanischen Entfaltung und Echtzeiterfassung eines Ensemblesatzes biomolekularer Strukturen in biophysikalischen und biosensorischen Bereichen.

Ensemble Force Spektroskopie durch Scherkräfte

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Dieses Protokoll bietet eine Hochdurchsatztechnik, um die intermolekulare Bindung zwischen DNA und Liganden zu untersuchen. Diese Technik hat einen hohen Durchsatz bei der Untersuchung massiver biomolekularer Strukturen gezeigt. Dazu wandelt es die mechanisch-chemischen Eigenschaften einzelner Moleküle in die von Molekülensembles um.Ich denke, es ist ein sehr fortschrittliches Experiment, aber es gibt nur wenige kritische Schritte. Zum Beispiel die Ausrichtung von Mikroskop, Homogenisator und Reaktionsröhrchen. Diese drei Dinge sollten perfekt aufeinander abgestimmt sein, um die Änderung der Fluoreszenz genau zu verfolgen.Beginnen Sie mit der Montage des Homogenisators und des Mikroskops auf einem Montagetisch. Schalten Sie nach dem Tragen der Schutzbrille das Fluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie dann den Homogenisator ein, um sicherzustellen, dass der Anregungslichtstrahl durch die Mitte der Dispergierspitze des Homogenisators geht. Bereiten Sie dann eine Reaktionskammer mit flachem Boden vor, die fünf Zentimeter hoch und 1,5 mal 1,5 Quadratzentimeter im Querschnitt ist, um sicherzustellen, dass das ausgewählte Kammermaterial nicht fluoresziert, um den Hintergrund zu reduzieren.Danach klemmen Sie die Reaktionskammer auf den Probentisch des Fluoreszenzmikroskops und stellen dann die Kammer so ein, dass sie die Dispergierspitze des Homogenisators hält, wobei sichergestellt wird, dass sich die Spitze etwas über der unteren Oberfläche der Reaktionskammer befindet. Als nächstes passen Sie die vertikale Position des Homogenisators und der Kammer zusammen an, um sicherzustellen, dass der Fokus des Mikroskops auf der Oberfläche der Dispergierspitze liegt. Passen Sie dann die horizontale Position der Dispergierspitze an, um sicherzustellen, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.Schalten Sie die fluoreszierenden Kanäle entsprechend dem im Experiment verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ein. Vor dem Hochgeschwindigkeitsscherexperiment wurde deionisiertes Wasser verwendet, um die Scherung mit einer niedrigen Schergeschwindigkeit zu testen. Bereiten Sie zunächst eine menschliche Telomer-i-Motiv-DNA vor, die an ihren beiden Enden jeweils mit einem Farbstoff und einem Quencher markiert ist, in entionisiertem Wasser, wie im Manuskript beschrieben.Als nächstes verdünnen Sie die DNA auf fünf Mikromolare in 30 Millimolar MES-Puffer bei pH 5,5 oder pH 7,4. Der DNA-Lösung wird der Ligand L2H24OTD" in einem Konzentrationsbereich von null bis 60 Mikromolar zugegeben und die Lösung 10 Minuten lang vorsichtig gemischt, um die i-Motivstrukturen ohne Licht zu falten. Überprüfen und minimieren Sie die Hintergrundfluoreszenzintensität der Reaktionskammer, die mit entionisiertem Wasser gefüllt ist, mit dem Fluoreszenzmikroskop ohne Scherung.Stellen Sie dann die Parameter der CCD-Kamera mit der Software mit einer Belichtungszeit von 0,5 Sekunden, einer CCD-Empfindlichkeit von 1.600 und einer Aufnahmezeit von 20 Minuten ein. Geben Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere und saubere Reaktionskammer und bedecken Sie die Reaktionskammer mit einem Blackbox. Starten Sie dann den Homogenisator, um die Scherung mit einer ausgewählten Scherrate von 9, 724 pro Sekunde bis 97, 245 pro Sekunde für 20 Minuten durchzuführen, wobei die CCD-Kamera eingeschaltet ist, um die Daten aufzuzeichnen.Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser. Bereiten Sie i-Motiv-DNA und entionisiertes Wasser vor. Dann inkubieren Sie 10 mikromolare i-Motiv-DNA und 300 Mikroliter 30 Millimolar-Tris-Puffer, ergänzt mit 150 Mikromol-Kupferchlorid und 300 Mikromolar-Ascorbinsäure für 10 Minuten, um die i-Motivstrukturen zu falten.Als nächstes ultrafiltrieren Sie die Lösung mit einer Ultrafiltrationsvorrichtung bei einer Zentrifugalkraft von 14, 300 mal G.Auffüllen Sie die Lösung auf etwa 500 Mikroliter mit 30 Millimolar Tris-Puffern, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure nach jeder Filtration. Nach dem Sammeln der Restlösung wird ein Endvolumen von 300 Mikrolitern durch Zugabe von 30 Millimolar Tris, ergänzt mit 300 Mikromolar Ascorbinsäure, zusammen mit 20 Mikromolar CalFluor 488 Azid, 20 Mikromolar HPG und 10 Mikromolar TBTA, hergestellt. Sobald die Reagenzien hinzugefügt wurden, bewegen Sie die Lösung in den dunklen Raum.Überprüfen und minimieren Sie dann die Hintergrundfluoreszenzintensität der mit entionisiertem Wasser gefüllten Reaktionskammer mit dem Mikroskop vor den Scherexperimenten. Als nächstes fügen Sie die DNA-Lösung mit einer langen Pipette in die leere Reaktionskammer hinzu und starten dann die Homogenisatorscherung mit einer Scherrate von 63, 209 pro Sekunde für 20 Minuten bei eingeschalteter CCD-Kamera. Entfernen Sie nach dem Experiment die Kammer und waschen Sie sie mit entionisiertem Wasser.Es wurde beobachtet, dass die Fluoreszenzintensität der i-Motiv-DNA mit der schieren Rate von 9.724 pro Sekunde bis 97.245 pro Sekunde in einem pH-Puffer von 5,5 MES zunahm. Die Fluoreszenzintensität wurde jedoch nicht erhöht, wenn die gleiche i-Motiv-DNA mit einer Rate von 63, 209 pro Sekunde geschert wurde, da sie sich bei pH 7,4 im MES-Puffer nicht faltet. Die Ligandenbindung an die DNA-i-Motivmoleküle, die dem reinen Fluss ausgesetzt waren, wurde ausgewertet, was zeigte, dass die Erhöhung der Fluoreszenzintensität mit zunehmender Ligandenkonzentration weniger offensichtlich wurde.Die Dissoziationskonstante wurde für die Wechselwirkung zwischen dem Liganden und dem i-Motiv bestimmt und betrug 34 Mikromol. Das Kupfer-Chelat-i-Motiv wurde mit der Scherrate von 63, 209 pro Sekunde entfaltet, und das freigesetzte Kupfer löste die fluorgene Klickreaktion aus, was im Laufe der Zeit zu einer erhöhten Fluoreszenzintensität führte. Stellen Sie zunächst sicher, dass der Erfassungsbereich zwischen Rotor und Stater eingestellt ist.Zweitens, überprüfen und minimieren Sie den Fluoreszenzhintergrund. Stellen Sie schließlich sicher, dass Sie die Reaktion filtern, bevor Sie eine Klickreaktion durchführen. Diese Methode öffnet ein Tor zur Erforschung der mechanischen Festigkeit, zum Falten und Entfalten aller Arten von Polymeren.Es könnten andere DNA-Strukturen, Proteine oder andere Polymere und ihre Wechselwirkung mit anderen Arten von Molekülen sein. Wie gesagt, mehrere andere Makromoleküle könnten mit diesem Ansatz untersucht werden.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Forschung

Biotechnik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...