Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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इस शोध कार्य को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन [सीबीईटी-1904921] और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [एनआईएच आर 01 सीए 236350] द्वारा एचएम तक समर्थित किया गया था।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी बफर और रासायनिक अभिकर्मक तालिका सामग्री में सूचीबद्ध हैं।
1. कतरनी बल माइक्रोस्कोप की तैयारी
नोट: कतरनी बल माइक्रोस्कोप म?...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. 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इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल कतरनी बल द्वारा बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के प्रकटहोने की वास्तविक समय की जांच की अनुमति देता है। यहां प्रस्तुत परिणाम इस बात को रेखांकित करते हैं कि डीएनए...

एकल-अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी1 (एसएमएफएस) में, व्यक्तिगत आणविक संरचनाओं के यांत्रिक गुणों का अध्ययन परिष्कृत उपकरणों जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोप, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और चुंबकीय चिमटी 2,3,4 द्वारा किया गया है। बल पैदा करने/पता लगाने वाले सेटअपों या चुंबकीय चिमटी में छोटे क्षेत्र और लघु सेंट्रीफ्यूज बल माइक्रोस्कोप (एमसीएफ) 5,6,7,8 में अणुओं की समान दिशात्मकता आवश्यकता द्वारा प्रतिबंधित, एसएमएफएस का उपयोग करके एक साथ केवल सीमित संख्या में अणुओं की जांच की जा सकती है। एसएमएफएस का कम थ्रूपुट आणविक मान्यता क्षेत्र में इसके व्यापक अनुप्रयोग को रोकता है, जिसके लिए अणुओं के एक बड़े सेट की भागीदारी की आवश्यकता होती है।
कतरनी प्रवाह अणुओं के एक विशाल सेट पर बलों को लागू करने के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करताहै। एक चैनल के अंदर तरल प्रवाह में, चैनल की सतह के जितना करीब होता है, प्रवाह दर10 धीमी होती है। इस तरह के प्रवाह वेग ढाल कतरनी तनाव का कारण बनता है जो सीमा की सतह के समानांतर होता है। जब एक अणु को इस कतरनी प्रवाह में रखा जाता है, तो अणु खुद को फिर से तैयार करता है ताकि इसकी लंबी धुरी प्रवाह दिशा के साथ संरेखित हो, क्योंकि कतरनी बल लंबी धुरी11 पर लागू होता है। इस पुन: अभिविन्यास के परिणामस्वरूप, एक ही प्रकार के सभी अणुओं (हैंडल के आकार और लंबाई) को एक ही कतरनी बल का अनुभव करते समय एक ही दिशा में संरेखित करने की उम्मीद है।
यह काम आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट पर कतरनी बल लगाने के लिए इस तरह के कतरनी प्रवाह का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जैसा कि डीएनए आई-मोटिफ द्वारा उदाहरण दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में, एक होमोजेनाइज़र टिप में रोटर और स्टेटर के बीच एक कतरनी प्रवाह उत्पन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में पाया गया कि मुड़े हुए डीएनए आई-मोटिफ संरचना को 9724-97245 एस -1 की कतरनी दरों द्वारा प्रकट किया जा सकता है। इसके अलावा, एल 2 एच 2-4 ओटीडी लिगैंड और आई-मोटिफ के बीच 36 μM का पृथक्करण स्थिरांक पाया गया था। यह मान जेल शिफ्ट परख12 द्वारा मापा गया 31 μM के अनुरूप है। इसके अलावा, वर्तमान तकनीक का उपयोग आई-मोटिफ को प्रकट करने के लिए किया जाता है, जो एक क्लिक प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करने के लिए चेलेटेड कॉपर (आई) को उजागर कर सकता है। इस प्रकार यह प्रोटोकॉल उचित समय (30 मिनट से कम) में कम लागत वाले उपकरणों के साथ आई-मोटिफ संरचनाओं के एक बड़े सेट को प्रकट करने की अनुमति देता है। यह देखते हुए कि कतरनी बल तकनीक बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के थ्रूपुट को काफी बढ़ाती है, हम इस तकनीक को एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) कहते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य इस कतरनी बल-आधारित ईएफएस के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रयोगात्मक दिशानिर्देश प्रदान करना है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

प्रतिदीप्ति और मेकेनोकेमिकल सिद्धांतों पर आधारित एकल-अणु तकनीक जैविक संवेदन में बेहतर संवेदनशीलता प्रदान करती है। हालांकि, उच्च थ्रूपुट क्षमताओं की कमी के कारण, इन तकनीकों का अनुप्रयोग बायोफिज़िक्स में सीमित है। एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) ने अलग-अलग अणुओं के मेकेनोकेमिकल अध्ययनों को आणविक पहनावा में परिवर्तित करके आणविक संरचनाओं के एक विशाल सेट की जांच में उच्च थ्रूपुट का प्रदर्शन किया है। इस प्रोटोकॉल में, डीएनए द्वितीयक संरचनाओं (आई-रूपांकनों) को 77796 / सेकंड तक कतरनी दरों पर एक होमोजेनाइज़र टिप के रोटर और स्टेटर के बीच कतरनी प्रवाह में प्रकट किया गया था। आई-मोटिफ द्वारा अनुभव किए गए कतरनी बलों पर प्रवाह दर और आणविक आकार के प्रभाव ों का प्रदर्शन किया गया था। ईएफएस तकनीक ने डीएनए आई-रूपांकनों और लिगेंड के बीच बाध्यकारी संबंध का भी खुलासा किया। इसके अलावा, हमने एक क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया है जिसे कतरनी बल (यानी, मेकानो-क्लिक रसायन विज्ञान) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। ये परिणाम आणविक संरचनाओं की रचना को नियंत्रित करने के लिए कतरनी बल का उपयोग करने की प्रभावशीलता स्थापित करते हैं।

चित्रा 1 ईएफएस में एन्सेंबल अणुओं के यांत्रिक प्रकटीकरण और वास्तविक समय संवेदन को रेखांकित करता है। चित्रा 1 बी में, पीएच 5.5 एमईएस बफर में आई-मोटिफ डीएनए की प्रतिदीप्ति तीव्...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईएफएस) बायोफिज़िकल और बायोसेंसिंग क्षेत्रों में बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के एक समूह के यांत्रिक प्रकटीकरण और वास्तविक समय संवेदन के लिए एक मजबूत तकनीक है।

कतरनी बलों द्वारा एन्सेंबल फोर्स स्पेक्ट्रोस्कोपी

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

यह प्रोटोकॉल डीएनए और लिगेंड के बीच इंटरमॉलिक्युलर बाइंडिंग का अध्ययन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट तकनीक प्रदान करता है। इस तकनीक ने बायोमोलेक्यूलर संरचनाओं के विशाल सेट की जांच में उच्च थ्रूपुट का प्रदर्शन किया है। यह व्यक्तिगत अणुओं के यांत्रिक रासायनिक गुणों को आणविक पहनावा में परिवर्तित करके ऐसा करता है।मुझे लगता है कि यह एक बहुत ही आगे का प्रयोग है लेकिन कुछ गंभीर कदम हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोस्कोप, होमोजेनाइज़र और प्रतिक्रिया ट्यूब का संरेखण। प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को सही ढंग से ट्रैक करने के लिए इन तीन चीजों को पूरी तरह से संरेखित किया जाना चाहिए।एक माउंटिंग टेबल पर होमोजेनाइज़र और माइक्रोस्कोप को इकट्ठा करके शुरू करें। काले चश्मे पहनने के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप चालू करें और फिर यह सुनिश्चित करने के लिए होमोजेनाइज़र को समायोजित करें कि उत्तेजना प्रकाश किरण होमोजेनाइज़र के फैलाव सिरे के केंद्र से गुजरती है। फिर एक सपाट तल वाला प्रतिक्रिया कक्ष तैयार करें जो ऊंचाई में पांच सेंटीमीटर और क्रॉस सेक्शन में 1.5 बाय 1.5 वर्ग सेंटीमीटर है, यह सुनिश्चित करते हुए कि चयनित कक्ष सामग्री पृष्ठभूमि को कम करने के लिए फ्लोरेस नहीं करती है।बाद में, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नमूना चरण पर प्रतिक्रिया कक्ष को दबाएं और फिर होमोजेनाइज़र के फैलाव सिरे को पकड़ने के लिए कक्ष को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि टिप प्रतिक्रिया कक्ष की निचली सतह से थोड़ा ऊपर है। इसके बाद, होमोजेनाइज़र और कक्ष की ऊर्ध्वाधर स्थिति को एक साथ समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि माइक्रोस्कोप का ध्यान फैलाने वाली नोक की सतह पर है। फिर यह सुनिश्चित करने के लिए कि रोटर और स्टेटर के बीच पता लगाने का क्षेत्र सेट है, फैलाव टिप की क्षैतिज स्थिति को समायोजित करें।प्रयोग में उपयोग किए गए फ्लोरोसेंट डाई के अनुसार फ्लोरोसेंट चैनलों पर स्विच करें। उच्च गति कतरन प्रयोग से पहले, कम कतरनी गति के साथ कतरन का परीक्षण करने के लिए विआयनीकृत पानी का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, पांडुलिपि में वर्णित विआयनीकृत पानी में क्रमशः एक डाई और एक बुझाने वाले के साथ लेबल किए गए मानव टेलोमेरिक आई-मोटिफ डीएनए तैयार करें।इसके बाद, पीएच 5.5 या पीएच 7.4 पर 30 मिलीमोलर एमईएस बफर में डीएनए को पांच माइक्रोमोलर में पतला करें। डीएनए समाधान में, शून्य से 60 माइक्रोमोलर की एकाग्रता सीमा में लिगैंड एल 2 एच 24 ओटीडी जोड़ें और प्रकाश के बिना आई-मोटिफ संरचनाओं को मोड़ने के लिए 10 मिनट के लिए घोल को धीरे से मिलाएं। प्रतिक्रिया कक्ष की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करें और कम करें जो कतरनी के बिना फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विआयनीकृत पानी से भरा होता है।फिर 0.5 सेकंड के रूप में एक्सपोज़र समय, 1, 600 की सीसीडी संवेदनशीलता और 20 मिनट के बराबर रिकॉर्डिंग समय के साथ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सीसीडी कैमरे के मापदंडों को सेट करें। एक लंबे पिपेट का उपयोग करके, डीएनए समाधान को खाली और साफ प्रतिक्रिया कक्ष में जोड़ें और प्रतिक्रिया कक्ष को एक ब्लैक बॉक्स से कवर करें। फिर 20 मिनट के लिए 9, 724 प्रति सेकंड से 97, 245 प्रति सेकंड तक की चयनित कतरनी दर पर कतरन करने के लिए होमोजेनाइज़र शुरू करें, जिसमें डेटा रिकॉर्ड करने के लिए सीसीडी कैमरा चालू हो।प्रयोग के बाद, कक्ष को हटा दें और इसे विआयनीकृत पानी से धो लें। आई-मोटिफ डीएनए और विआयनीकृत पानी तैयार करें। फिर, आई-मोटिफ संरचनाओं को मोड़ने के लिए 10 मिनट के लिए 10 माइक्रोमोलर आई-मोटिफ डीएनए और 30 मिलीमोलर ट्राइस बफर के 300 माइक्रोलीटर को 150 माइक्रोमोलर क्यूपरिक क्लोराइड और 300 माइक्रोमोलर एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक करें।14,300 गुना जी के केन्द्रापसारक बल पर अल्ट्रा फिल्ट्रेशन डिवाइस के साथ घोल को फिर से भरें, प्रत्येक निस्पंदन के बाद 300 माइक्रोमोलर एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक 30मिलनर ट्राइस बफर के साथ लगभग 500 माइक्रोलीटर में घोल को भरें। अवशिष्ट समाधान एकत्र करने के बाद, 20 माइक्रोमोलर कैलफ्लोर 488 एज़ाइड, 20 माइक्रोमोलर एचपीजी और 10 माइक्रोमोलर टीबीटीए के साथ 300 माइक्रोमोलर एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पूरक 30 मिलीमोलर ट्राइस जोड़कर 300 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा बनाएं। एक बार अभिकर्मकों को जोड़ने के बाद, समाधान को अंधेरे कमरे में ले जाएं।फिर कतरन प्रयोगों से पहले माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विआयनीकृत पानी से भरे प्रतिक्रिया कक्ष की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की जांच करें और कम करें। इसके बाद, डीएनए समाधान को एक लंबे पिपेट के साथ खाली प्रतिक्रिया कक्ष में जोड़ें, और फिर सीसीडी कैमरा चालू करने के साथ 20 मिनट के लिए 63, 209 प्रति सेकंड की कतरनी दर से होमोजेनाइज़र कतरन शुरू करें। प्रयोग के बाद, कक्ष को हटा दें और इसे विआयनीकृत पानी से धो लें।पीएच 5.5 एमईएस बफर में आई-मोटिफ डीएनए की प्रतिदीप्ति तीव्रता 9, 724 प्रति सेकंड से 97, 245 प्रति सेकंड तक की सरासर दर के साथ बढ़ी हुई देखी गई। हालांकि, प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि नहीं हुई थी जब एक ही आई-मोटिफ डीएनए को 63, 209 प्रति सेकंड की दर से काटा गया था, क्योंकि यह एमईएस बफर में पीएच 7.4 पर फोल्ड नहीं होता है। सरासर प्रवाह के अधीन डीएनए आई-मोटिफ अणुओं के लिगैंड बाइंडिंग का मूल्यांकन किया गया था, जिससे पता चला कि लिगैंड एकाग्रता में वृद्धि के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की वृद्धि कम स्पष्ट हो गई।लिगैंड और आई-मोटिफ के बीच बातचीत के लिए पृथक्करण स्थिरांक निर्धारित किया गया था और 34 माइक्रोमोल्स पाए गए थे। कॉपर वन चेलेटेड आई-मोटिफ को 63, 209 प्रति सेकंड कतरनी दर पर प्रकट किया गया था, और जारी किए गए तांबे ने फ्लोरोजेनिक क्लिक प्रतिक्रिया को ट्रिगर किया, जिसके परिणामस्वरूप समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि हुई। सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि रोटर और स्टेटर के बीच पहचान क्षेत्र सेट किया गया है।दूसरा, प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि की जांच और न्यूनतम करें। और अंत में, सुनिश्चित करें कि आप क्लिक प्रतिक्रिया करने से पहले प्रतिक्रिया को फ़िल्टर करते हैं। यह विधि यांत्रिक शक्ति का पता लगाने, तह करने और सभी प्रकार के पॉलिमर को उजागर करने के लिए एक प्रवेश द्वार खोलती है।यह अन्य डीएनए संरचनाएं, प्रोटीन, या अन्य पॉलिमर, और अन्य प्रकार के अणुओं के साथ उनकी बातचीत हो सकती है। जैसा कि कहा गया है, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके कई अन्य मैक्रोमोलेक्यूल्स का अध्ययन किया जा सकता है।

Research

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