Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Science Foundation [CBET-1904921] e dal National Institutes of Health [NIH R01CA236350] a H. M.

NOTA: Tutti i tamponi e i reagenti chimici utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella Materiali.
1. Preparazione del microscopio a forza di taglio
NOTA: Il microscopio a forza di taglio contiene due parti, un'unità di reazione (omogeneizzatore) e un'unità di rilevamento (microscopio a fluorescenza). L'ingrandimento dell'oculare è 10x e l'ingrandimento della lente dell'obiettivo (aria) è 4x.
<ol><li>Assemblare ...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

Il protocollo descritto in questo manoscritto consente di studiare in tempo reale lo sviluppo di un insieme di strutture biomolecolari mediante forza di taglio. I risultati qui presentati sottolineano che le strutture del DNA i-motif possono essere spiegate dalla forza di taglio. Lo sviluppo del motivo i-legato al ligando e le reazioni a scatto azionate dalla forza di taglio sono state applicazioni proof-of-concept per questo metodo di spettroscopia a forza d'insieme.
La F...

Nella spettroscopia di forza a singola molecola1 (SMFS), le proprietà meccaniche delle singole strutture molecolari sono state studiate da strumenti sofisticati come il microscopio a forza atomica, le pinzette ottiche e le pinzette magnetiche 2,3,4. Limitato dallo stesso requisito di direzionalità delle molecole nelle configurazioni di generazione/rilevamento della forza o dal piccolo campo visivo nelle pinzette magnetiche e nel microscopio a forza centrifuga miniaturizzato (MCF)5,6,7,8, solo un numero limitato di molecole può essere studiato simultaneamente utilizzando SMFS. Il basso rendimento di SMFS impedisce la sua ampia applicazione nel campo del riconoscimento molecolare, che richiede il coinvolgimento di un ampio insieme di molecole.
Il flusso di taglio fornisce una potenziale soluzione per applicare forze a un massiccio insieme di molecole9. In un flusso di liquido all'interno di un canale, più vicino alla superficie del canale, più lenta è la portata10. Tale gradiente di velocità del flusso causa sollecitazioni di taglio parallele alla superficie limite. Quando una molecola viene posizionata in questo flusso di taglio, la molecola si riorienta in modo che il suo asse lungo si allinei con la direzione del flusso, poiché la forza di taglio viene applicata all'asse lungo11. Come risultato di questo riorientamento, ci si aspetta che tutte le molecole dello stesso tipo (dimensioni e lunghezza delle maniglie) si allineino nella stessa direzione mentre sperimentano la stessa forza di taglio.
Questo lavoro descrive un protocollo per utilizzare un tale flusso di taglio per esercitare una forza di taglio su un massiccio insieme di strutture molecolari, come esemplificato dal motivo del DNA. In questo protocollo, viene generato un flusso di taglio tra il rotore e lo statore in una punta omogeneizzatore. Il presente studio ha scoperto che la struttura ripiegata del DNA i-motif potrebbe essere spiegata da velocità di taglio di 9724-97245 s-1. Inoltre, è stata trovata una costante di dissociazione di 36 μM tra il ligando L2H2-4OTD e il motivo i. Questo valore è coerente con quello di 31 μM misurato dal saggio di spostamento del gel12. Inoltre, la tecnica corrente viene utilizzata per dispiegare il motivo i, che può esporre il rame chelato (I) per catalizzare una reazione di clic. Questo protocollo consente quindi di dispiegare un ampio set di strutture i-motif con strumenti a basso costo in un tempo ragionevole (inferiore a 30 min). Dato che la tecnica della forza di taglio aumenta drasticamente il throughput della spettroscopia di forza, chiamiamo questa tecnica spettroscopia di forza d'insieme (EFS). Questo protocollo mira a fornire linee guida sperimentali per facilitare l'applicazione di questo EFS basato sulla forza di taglio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Le tecniche a singola molecola basate sulla fluorescenza e sui principi meccanochimici forniscono una sensibilità superiore nel rilevamento biologico. Tuttavia, a causa della mancanza di elevate capacità di produttività, l'applicazione di queste tecniche è limitata in biofisica. La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture molecolari convertendo gli studi meccanochimici delle singole molecole in quelli degli insiemi molecolari. In questo protocollo, le strutture secondarie del DNA (i-motivi) sono state spiegate nel flusso di taglio tra il rotore e lo statore di una punta omogeneizzatore a velocità di taglio fino a 77796/s. Sono stati dimostrati gli effetti delle portate e delle dimensioni molecolari sulle forze di taglio sperimentate dall'i-motif. La tecnica EFS ha anche rivelato l'affinità di legame tra i motivi del DNA e i ligandi. Inoltre, abbiamo dimostrato una reazione chimica del clic che può essere azionata dalla forza di taglio (cioè la chimica meccano-clic). Questi risultati stabiliscono l'efficacia dell'uso della forza di taglio per controllare la conformazione delle strutture molecolari.

La Figura 1 illustra lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale delle molecole dell'insieme in EFS. Nella Figura 1B, è stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con la velocità di taglio che varia da 9.724 s-1 a 97.245 s-1 in un tampone MES a pH 5,5. Come controllo, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di ...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

La spettroscopia di forza d'insieme (EFS) è una tecnica robusta per lo sviluppo meccanico e il rilevamento in tempo reale di un insieme di strutture biomolecolari in campi biofisici e biosensibili.

Spettroscopia Ensemble Force mediante Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Questo protocollo fornisce una tecnica ad alto rendimento per studiare il legame intermolecolare tra DNA e ligandi. Questa tecnica ha dimostrato un elevato rendimento nello studio di un massiccio insieme di strutture biomolecolari. Lo fa convertendo le proprietà chimiche meccaniche delle singole molecole in quelle degli insiemi molecolari.Penso che sia un esperimento molto avanti, ma ci sono pochi passi critici. Ad esempio, l'allineamento del microscopio, dell'omogeneizzatore e del tubo di reazione. Queste tre cose dovrebbero essere perfettamente allineate per tracciare con precisione il cambiamento di fluorescenza.Inizia assemblando l'omogeneizzatore e il microscopio su un tavolo di montaggio. Dopo aver indossato gli occhiali, accendere il microscopio a fluorescenza e quindi regolare l'omogeneizzatore per assicurarsi che il fascio di luce di eccitazione passi attraverso il centro della punta disperdente dell'omogeneizzatore. Quindi preparare una camera di reazione a fondo piatto di cinque centimetri di altezza e 1,5 per 1,5 centimetri quadrati di sezione trasversale, assicurandosi che il materiale della camera selezionato non fluoresca per ridurre lo sfondo.Successivamente, bloccare la camera di reazione sullo stadio del campione del microscopio a fluorescenza e quindi regolare la camera per contenere la punta disperdente dell'omogeneizzatore, assicurandosi che la punta sia leggermente al di sopra della superficie inferiore della camera di reazione. Quindi, regolare la posizione verticale dell'omogeneizzatore e della camera insieme per garantire che la messa a fuoco del microscopio sia sulla superficie della punta di dispersione. Quindi regolare la posizione orizzontale della punta di dispersione per assicurarsi che l'area di rilevamento sia impostata tra il rotore e lo stater.Accendere i canali fluorescenti, secondo il colorante fluorescente utilizzato nell'esperimento. Prima dell'esperimento di taglio ad alta velocità, utilizzare acqua deionizzata per testare la cesoiatura con una bassa velocità di taglio. In primo luogo, preparare un DNA telomerico umano i-motif etichettato con un colorante e un quencher alle sue due estremità rispettivamente in acqua deionizzata come descritto nel manoscritto.Quindi, diluire il DNA a cinque micromolari in tampone MES da 30 millimolari a pH 5,5 o pH 7,4. Alla soluzione di DNA, aggiungere il ligando L2H24OTD"in un intervallo di concentrazione da zero a 60 micromolari e mescolare delicatamente la soluzione per 10 minuti per piegare le strutture i-motif senza luce. Controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione che viene riempita con acqua deionizzata utilizzando il microscopio fluorescente senza cesoiatura.Quindi impostare i parametri della telecamera CCD utilizzando il software con tempo di esposizione pari a 0,5 secondi, sensibilità CCD di 1.600 e tempo di registrazione pari a 20 minuti. Utilizzando una pipetta lunga, aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota e pulita e coprire la camera di reazione con una scatola nera. Quindi avviare l'omogeneizzatore per eseguire il taglio a una velocità di taglio selezionata che va da 9.724 al secondo a 97, 245 al secondo per 20 minuti, con la telecamera CCD accesa per registrare i dati.Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua deionizzata. Preparare il DNA i-motif e l'acqua deionizzata. Quindi, incubare 10 micromolari i-motif DNA e 300 microlitri di 30 millimolari tris tampone integrato con 150 micromolari cloruro rameico e 300 micromolari acido ascorbico per 10 minuti per piegare le strutture i-motif.Successivamente ultrafiltrare la soluzione con un dispositivo di ultrafiltrazione ad una forza centrifuga di 14, 300 volte G.Reintegrare la soluzione a circa 500 microlitri con 30 tamponi tris millimolari integrati con acido ascorbico micromolare 300 dopo ogni filtrazione. Dopo aver raccolto la soluzione residua, fare un volume finale di 300 microlitri aggiungendo 30 tris millimolari integrati con acido ascorbico 300 micromolare insieme a 20 micromolari CalFluor 488 Azide, 20 micromolari HPG e 10 micromolari TBTA. Una volta aggiunti i reagenti, spostare la soluzione nella camera oscura.Quindi controllare e ridurre al minimo l'intensità della fluorescenza di fondo della camera di reazione riempita con acqua deionizzata usando il microscopio prima degli esperimenti di taglio. Quindi, aggiungere la soluzione di DNA nella camera di reazione vuota con una pipetta lunga, quindi avviare la cesoiatura dell'omogeneizzatore a una velocità di taglio di 63, 209 al secondo per 20 minuti con la telecamera CCD accesa. Dopo l'esperimento, rimuovere la camera e lavarla con acqua deionizzata.È stato osservato che l'intensità di fluorescenza del DNA i-motif aumenta con una velocità che va da 9.724 al secondo a 97.245 al secondo in un tampone MES a pH 5,5. Tuttavia, l'intensità della fluorescenza non è aumentata quando lo stesso DNA i-motif è stato tagliato ad una velocità di 63.209 al secondo, poiché non si piega a pH 7,4 nel tampone MES. È stato valutato il legame del ligando alle molecole di DNA i-motif sottoposte al flusso puro, il che ha dimostrato che l'incremento dell'intensità della fluorescenza è diventato meno evidente con l'aumentare della concentrazione del ligando.La costante di dissociazione è stata determinata per l'interazione tra il ligando e l'i-motif ed è risultata essere 34 micromoli. Il motivo i-motif chelato in rame è stato spiegato alla velocità di taglio di 63.209 al secondo e quello di rame rilasciato ha innescato la reazione di clic fluorgenico, con conseguente aumento dell'intensità della fluorescenza nel tempo. In primo luogo, assicurarsi che l'area di rilevamento sia impostata tra il rotore e lo stater.In secondo luogo, controllare e ridurre al minimo lo sfondo di fluorescenza. Infine, assicurati di filtrare la reazione prima di eseguire la reazione al clic. Questo metodo apre una porta per esplorare la resistenza meccanica, piegando e dispiegando tutti i tipi di polimeri.Potrebbe trattarsi di altre strutture del DNA, proteine o altri polimeri e della loro interazione con altri tipi di molecole. Come detto, diverse altre macromolecole potrebbero essere studiate usando questo approccio.

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