Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela National Science Foundation [CBET-1904921] e pelos Institutos Nacionais de Saúde [NIH R01CA236350] para H. M.

NOTA: Todos os tampões e os reagentes químicos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação do microscópio de força de cisalhamento
NOTA: O microscópio de força de cisalhamento contém duas partes, uma unidade de reação (homogeneizador) e uma unidade de detecção (microscópio de fluorescência). A ampliação da ocular é de 10x, e a ampliação da lente objetiva (ar) é de 4x.
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<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

O protocolo descrito neste manuscrito permite a investigação em tempo real do desdobramento de um conjunto de estruturas biomoleculares por força de cisalhamento. Os resultados aqui apresentados ressaltam que as estruturas do i-motivo do DNA podem ser desdobradas pela força de cisalhamento. O desdobramento do i-motivo ligado ao ligante e as reações de clique acionadas por força de cisalhamento foram aplicações de prova de conceito para este método de espectroscopia de força de conjunto.
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Na espectroscopia de força de molécula única1 (SMFS), as propriedades mecânicas de estruturas moleculares individuais têm sido estudadas por instrumentos sofisticados como o microscópio de força atômica, pinças ópticas e pinças magnéticas 2,3,4. Restrito pelo mesmo requisito de direcionalidade das moléculas nas configurações de geração/detecção de força ou pelo pequeno campo de visão em pinças magnéticas e no microscópio de força de centrífuga em miniatura (MCF)5,6,7,8, apenas um número limitado de moléculas pode ser investigado simultaneamente usando SMFS. O baixo rendimento do SMFS impede sua ampla aplicação no campo do reconhecimento molecular, o que requer o envolvimento de um grande conjunto de moléculas.
O fluxo de cisalhamento fornece uma solução potencial para aplicar forças a um conjunto maciço de moléculas9. Em um fluxo de líquido dentro de um canal, quanto mais próximo da superfície do canal, mais lenta a taxa de fluxo10. Tal gradiente de velocidade de fluxo causa tensão de cisalhamento paralela à superfície limite. Quando uma molécula é colocada nesse fluxo de cisalhamento, a molécula se reorienta para que seu eixo longo se alinhe com a direção do fluxo, à medida que a força de cisalhamento é aplicada ao eixo longo11. Como resultado dessa reorientação, espera-se que todas as moléculas do mesmo tipo (tamanho e comprimento das alças) se alinhem na mesma direção enquanto experimentam a mesma força de cisalhamento.
Este trabalho descreve um protocolo para usar tal fluxo de cisalhamento para exercer força de cisalhamento em um conjunto maciço de estruturas moleculares, como exemplificado pelo i-motivo do DNA. Neste protocolo, um fluxo de cisalhamento é gerado entre o rotor e o estator em uma ponta do homogeneizador. O presente estudo descobriu que a estrutura dobrada do i-motivo do DNA poderia ser desdobrada por taxas de cisalhamento de 9724-97245 s−1. Além disso, uma constante de dissociação de 36 μM foi encontrada entre o ligante L2H2-4OTD e o motivo i. Este valor é consistente com o de 31 μM medido pelo ensaio de deslocamento de gel12. Além disso, a técnica atual é usada para desdobrar o i-motivo, que pode expor o cobre quelado (I) para catalisar uma reação de clique. Este protocolo permite, assim, desdobrar um grande conjunto de estruturas i-motif com instrumentos de baixo custo em um tempo razoável (menor que 30 min). Dado que a técnica de força de cisalhamento aumenta drasticamente o rendimento da espectroscopia de força, chamamos essa técnica de espectroscopia de força de conjunto (EFS). Este protocolo tem como objetivo fornecer diretrizes experimentais para facilitar a aplicação deste EFS baseado em força de cisalhamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Técnicas de molécula única baseadas em princípios de fluorescência e mecanoquímicos fornecem sensibilidade superior em sensoriamento biológico. No entanto, devido à falta de recursos de alto rendimento, a aplicação dessas técnicas é limitada em biofísica. A espectroscopia de força de conjunto (EFS) demonstrou alto rendimento na investigação de um conjunto maciço de estruturas moleculares, convertendo estudos mecanoquímicos de moléculas individuais em conjuntos moleculares. Neste protocolo, as estruturas secundárias do DNA (i-motivos) foram desdobradas no fluxo de cisalhamento entre o rotor e o estator de uma ponta do homogeneizador a taxas de cisalhamento de até 77796/s. Os efeitos das taxas de fluxo e tamanhos moleculares sobre as forças de cisalhamento experimentadas pelo motivo i foram demonstrados. A técnica EFS também revelou a afinidade de ligação entre i-motivos de DNA e ligantes. Além disso, demonstramos uma reação química de clique que pode ser acionada por força de cisalhamento (ou seja, química de clique mecano). Esses resultados estabelecem a eficácia do uso da força de cisalhamento para controlar a conformação de estruturas moleculares.

A Figura 1 descreve o desdobramento mecânico e a detecção em tempo real das moléculas do conjunto no EFS. Na Figura 1B, observou-se que a intensidade de fluorescência do DNA i-motif aumentou com a taxa de cisalhamento variando de 9.724 s−1 a 97.245 s−1 em um tampão MES de pH 5,5. Como controle, a intensidade da fluorescência não foi aumentada quando o mesmo DNA i-motif foi cortado a uma taxa de 63.209 s−1...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

A espectroscopia de força de conjunto (EFS) é uma técnica robusta para desdobramento mecânico e detecção em tempo real de um conjunto de estruturas biomoleculares em campos biofísicos e de biossensoriamento.

Espectroscopia de Força de Ensemble por Forças de Cisalhamento

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Este protocolo fornece uma técnica de alto rendimento para estudar a ligação intermolecular entre o DNA e os ligantes. Esta técnica demonstrou alto rendimento na investigação de um conjunto maciço de estruturas biomoleculares. Ele faz isso convertendo as propriedades químicas mecânicas de moléculas individuais em propriedades de conjuntos moleculares.Acho que é um experimento muito avançado, mas há poucos passos críticos. Por exemplo, o alinhamento do microscópio, homogeneizador e do tubo de reação. Essas três coisas devem estar perfeitamente alinhadas para rastrear com precisão a mudança na fluorescência.Comece montando o homogeneizador e o microscópio em uma mesa de montagem. Depois de usar os óculos, ligue o microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste o homogeneizador para se certificar de que o feixe de luz de excitação passe pelo centro da ponta de dispersão do homogeneizador. Em seguida, prepare uma câmara de reação de fundo plano com cinco centímetros de altura e 1,5 por 1,5 centímetros quadrados de seção transversal, garantindo que o material da câmara selecionado não fluoresce para reduzir o fundo.Depois, prenda a câmara de reação no estágio de amostra do microscópio de fluorescência e, em seguida, ajuste a câmara para segurar a ponta de dispersão do homogeneizador, garantindo que a ponta esteja ligeiramente acima da superfície inferior da câmara de reação. Em seguida, ajuste a posição vertical do homogeneizador e da câmara juntos para garantir que o foco do microscópio esteja na superfície da ponta de dispersão. Em seguida, ajuste a posição horizontal da ponta de dispersão para garantir que a área de detecção esteja definida entre o rotor e o stater.Ligue os canais fluorescentes, de acordo com o corante fluorescente usado no experimento. Antes do experimento de cisalhamento de alta velocidade, usava-se água deionizada para testar a cisalhamento com uma baixa velocidade de cisalhamento. Primeiro, prepare um DNA telomeric i-motif humano marcado com um corante e um quencher em suas duas extremidades, respectivamente, em água deionizada, conforme descrito no manuscrito.Em seguida, dilua o DNA para cinco micromolares em tampão MES de 30 milimolares a pH 5,5 ou pH 7,4. À solução de ADN, adicionar o ligante L2H24OTD" num intervalo de concentração de zero a 60 micromolares e misturar a solução suavemente durante 10 minutos para dobrar as estruturas i-motif sem luz. Verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação que é preenchida com água deionizada usando o microscópio fluorescente sem cisalhamento.Em seguida, defina os parâmetros da câmera CCD usando o software com tempo de exposição como 0,5 segundos, sensibilidade CCD de 1, 600 e tempo de gravação igual a 20 minutos. Usando uma pipeta longa, adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia e limpa e cubra a câmara de reação com uma caixa preta. Em seguida, inicie o homogeneizador para realizar a cisalhamento a uma taxa de cisalhamento selecionada variando de 9, 724 por segundo a 97, 245 por segundo por 20 minutos, com a câmera CCD ligada para gravar os dados.Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água deionizada. Prepare o DNA i-motif e a água deionizada. Em seguida, incubar 10 micromolares de DNA i-motif e 300 microlitros de tampão tris milimolar suplementado com 150 cloreto cúprico micromolar e 300 ácido ascórbico micromolar por 10 minutos para dobrar as estruturas i-motif.Em seguida, ultrafiltre a solução com um dispositivo de ultrafiltração a uma força centrífuga de 14, 300 vezes G.Reabasteça a solução para aproximadamente 500 microlitros com 30 tampões tris milimolares suplementados com 300 ácidos ascórbicos micromolares após cada filtração. Após a coleta da solução residual, faça um volume final de 300 microlitros adicionando 30 tris milimolares suplementados com 300 ácido ascórbico micromolar juntamente com 20 CalFluor 488 Azida micromolar, 20 HPG micromolares e 10 TBTA micromolar. Uma vez que os reagentes são adicionados, mova a solução para a sala escura.Em seguida, verifique e minimize a intensidade de fluorescência de fundo da câmara de reação preenchida com água deionizada usando o microscópio antes dos experimentos de cisalhamento. Em seguida, adicione a solução de DNA na câmara de reação vazia com uma pipeta longa e, em seguida, inicie o cisalhamento do homogeneizador a uma taxa de cisalhamento de 63, 209 por segundo por 20 minutos com a câmera CCD ligada. Após o experimento, remova a câmara e lave-a com água deionizada.Observou-se que a intensidade de fluorescência do DNA i-motif aumentou com a taxa de puro variando de 9, 724 por segundo a 97, 245 por segundo em um tampão MES de pH 5,5. No entanto, a intensidade da fluorescência não foi aumentada quando o mesmo DNA i-motif foi cortado a uma taxa de 63, 209 por segundo, pois não se dobra em pH 7,4 no tampão MES. A ligação do ligante às moléculas de i-motivo de DNA submetidas ao fluxo puro foi avaliada, o que mostrou que o incremento da intensidade de fluorescência tornou-se menos óbvio com o aumento da concentração de ligantes.A constante de dissociação foi determinada para a interação entre o ligante e o motivo i, sendo 34 micromoles. O i-motivo quelado de cobre foi desdobrado na taxa de cisalhamento de 63, 209 por segundo, e o de cobre liberado desencadeou a reação de clique fluorgênico, resultando em aumento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo. Em primeiro lugar, certifique-se de que a área de detecção esteja definida entre o rotor e o stater.Em segundo lugar, verifique e minimize o fundo de fluorescência. E, por último, certifique-se de filtrar a reação antes de executar a reação de clique. Este método abre uma porta de entrada para explorar a resistência mecânica, dobrar e desdobrar todos os tipos de polímeros.Podem ser outras estruturas de DNA, proteínas ou outros polímeros, e sua interação com outros tipos de moléculas. Como dito, várias outras macromoléculas poderiam ser estudadas usando essa abordagem.

Research

JoVE Journal

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