Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Эта исследовательская работа была поддержана Национальным научным фондом [CBET-1904921] и Национальными институтами здравоохранения [NIH R01CA236350] для H. M.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы и химические реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
1. Подготовка силового микроскопа сдвига
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп с силой сдвига состоит из двух частей: реакционного блока (гомог?...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

Протокол, описанный в этой рукописи, позволяет в режиме реального времени исследовать разворачивание ансамблевого набора биомолекулярных структур силой сдвига. Представленные здесь результаты подчеркивают, что структуры ДНК i-motif могут быть развернуты силой сдвига. Развертывание лиг...

В одномолекулярной силовой спектроскопии1 (SMFS) механические свойства отдельных молекулярных структур были изучены сложными инструментами, такими как атомно-силовой микроскоп, оптический пинцет и магнитный пинцет 2,3,4. Ограниченные одним и тем же требованием направленности молекул в силообразующих/детектирующих установках или малым полем зрения в магнитных пинцетах и миниатюрном центрифужном силовом микроскопе (MCF)5,6,7,8, только ограниченное количество молекул может быть исследовано одновременно с использованием SMFS. Низкая пропускная способность SMFS препятствует ее широкому применению в области молекулярного распознавания, что требует привлечения большого набора молекул.
Сдвиговой поток обеспечивает потенциальное решение для приложения сил к массивному набору молекул9. В потоке жидкости внутри канала, чем ближе к поверхности канала, тем медленнее скорость потока10. Такой градиент скорости потока вызывает напряжение сдвига, параллельное граничной поверхности. Когда молекула помещается в этот поток сдвига, молекула переориентируется так, что ее длинная ось выравнивается с направлением потока, поскольку сила сдвига прикладывается к длинной оси11. В результате этой переориентации ожидается, что все молекулы одного типа (размер и длина ручек) выровняются в одном направлении, испытывая при этом одинаковую силу сдвига.
Эта работа описывает протокол использования такого сдвигового потока для оказания силы сдвига на массивный набор молекулярных структур, примером чего является i-мотив ДНК. В этом протоколе между ротором и статором в наконечнике гомогенизатора генерируется сдвиговой поток. Настоящее исследование показало, что сложенная структура i-мотива ДНК может быть развернута со скоростью сдвига 9724-97245 s−1. Кроме того, между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом была обнаружена константа диссоциации 36 мкМ. Это значение согласуется с значением 31 мкМ, измеренным анализом сдвигагеля 12. Кроме того, современная техника используется для развертывания i-мотива, который может обнажить хелатную медь (I) для катализации реакции щелчка. Таким образом, этот протокол позволяет развернуть большой набор структур i-motif с недорогими инструментами за разумное время (менее 30 минут). Учитывая, что метод силы сдвига резко увеличивает пропускную способность силовой спектроскопии, мы называем эту технику ансамблевой силовой спектроскопией (EFS). Этот протокол направлен на предоставление экспериментальных руководящих принципов для облегчения применения этой EFS на основе сдвиговой силы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Одномолекулярные методы, основанные на флуоресцентных и механохимических принципах, обеспечивают превосходную чувствительность в биологическом зондировании. Однако из-за отсутствия высоких пропускных возможностей применение этих методов ограничено в биофизике. Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) продемонстрировала высокую пропускную способность при исследовании массивного набора молекулярных структур путем преобразования механохимических исследований отдельных молекул в исследования молекулярных ансамблей. В этом протоколе вторичные структуры ДНК (i-мотивы) разворачивались в сдвиговом потоке между ротором и статором наконечника гомогенизатора со скоростью сдвига до 77796/с. Было продемонстрировано влияние скорости потока и размеров молекул на силы сдвига, испытываемые i-мотивом. Методика EFS также выявила сродство связывания между i-мотивами ДНК и лигандами. Кроме того, мы продемонстрировали химическую реакцию щелчка, которая может быть приведена в действие силой сдвига (т. Е. Химия механо-щелчка). Эти результаты устанавливают эффективность использования силы сдвига для контроля конформации молекулярных структур.

На рисунке 1 показано механическое развертывание и зондирование в реальном времени ансамблевых молекул в EFS. На рисунке 1B интенсивность флуоресценции ДНК i-мотива увеличивалась со скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 с−1 до 97 245 с−1 в б...

Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) является надежным методом механического разворачивания и зондирования в реальном времени ансамблевого набора биомолекулярных структур в биофизических и биосенсорных полях.

Ансамблевая силовая спектроскопия по силам сдвига

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Этот протокол обеспечивает высокую пропускную способность для изучения межмолекулярного связывания между ДНК и лигандами. Этот метод продемонстрировал высокую пропускную способность при исследовании массивного набора биомолекулярных структур. Он делает это путем преобразования механических химических свойств отдельных молекул в свойства молекулярных ансамблей.Я думаю, что это очень шаг вперед, но есть несколько критических шагов. Например, выравнивание микроскопа, гомогенизатора и реакционной трубки. Эти три вещи должны быть идеально выровнены, чтобы точно отслеживать изменение флуоресценции.Начните с сборки гомогенизатора и микроскопа на монтажном столе. После ношения очков включите флуоресцентный микроскоп, а затем отрегулируйте гомогенизатор, чтобы убедиться, что луч света возбуждения проходит через центр диспергирующего наконечника гомогенизатора. Затем подготовьте реакционную камеру с плоским дном, которая составляет пять сантиметров в высоту и 1,5 на 1,5 квадратных сантиметра в поперечном сечении, следя за тем, чтобы выбранный материал камеры не флуоресцировал для уменьшения фона.После этого зажмите реакционную камеру на стадии образца флуоресцентного микроскопа, а затем отрегулируйте камеру, чтобы удерживать диспергирующий наконечник гомогенизатора, гарантируя, что наконечник находится немного выше нижней поверхности реакционной камеры. Затем отрегулируйте вертикальное положение гомогенизатора и камеры вместе, чтобы фокус микроскопа находился на поверхности диспергирующего наконечника. Затем отрегулируйте горизонтальное положение диспергирующего наконечника, чтобы убедиться, что область обнаружения установлена между ротором и статером.Включите флуоресцентные каналы, в соответствии с флуоресцентным красителем, используемым в эксперименте. Перед экспериментом по высокоскоростной стрижке использовал деионизированную воду для проверки сдвига с низкой скоростью сдвига. Во-первых, подготовьте человеческую теломерную i-мотивную ДНК, помеченную красителем и гасителем на двух концах соответственно в деионизированной воде, как описано в рукописи.Далее разводят ДНК до пяти микромоляров в 30-миллимолярном MES-буфере при рН 5,5 или рН 7,4. К раствору ДНК добавляют лиганд L2H24OTD" в диапазоне концентраций от нуля до 60 микромоляров и аккуратно перемешивают раствор в течение 10 минут, чтобы сложить структуры i-мотива без света. Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой, с помощью флуоресцентного микроскопа без сдвига.Затем установите параметры ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения со временем экспозиции 0,5 секунды, чувствительностью ПЗС 1 600 и временем записи, равным 20 минутам. Используя длинную пипетку, добавьте раствор ДНК в пустую и чистую реакционную камеру и накройте реакционную камеру черным ящиком. Затем запустите гомогенизатор для выполнения сдвига с выбранной скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 в секунду до 97 245 в секунду в течение 20 минут, с включенной ПЗС-камерой для записи данных.После эксперимента снимите камеру и промыть ее деионизированной водой. Подготовьте ДНК i-мотива и деионизированную воду. Затем инкубируют 10 микромолярной i-мотивной ДНК и 300 микролитров 30-миллимолярного трис-буфера, дополненного 150 микромоляльным хлоридом меди и 300 микромолярной аскорбиновой кислотой в течение 10 минут, чтобы сложить структуры i-мотива.Далее ультрафильтруют раствор с помощью ультрафильтрационного устройства с центробежной силой 14,300 раз больше G. Пополняйте раствор примерно до 500 микролитров с 30 миллимолярными трисовыми буферами, дополненными 300 микромолярной аскорбиновой кислотой после каждой фильтрации. После сбора остаточного раствора сделайте окончательный объем в 300 микролитров, добавив 30 миллимолярных трис, дополненных 300 микромолярной аскорбиновой кислотой вместе с 20 микромолярами CalFluor 488 Azide, 20 микромолярными HPG и 10 микромолярными TBTA. После того, как реагенты добавлены, переместите раствор в темное помещение.Затем проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой, с помощью микроскопа перед экспериментами по сдвигу. Далее добавляют раствор ДНК в пустую реакционную камеру с длинной пипеткой, а затем запускают сдвиг гомогенизатора со скоростью сдвига 63,209 в секунду в течение 20 минут с включенной ПЗС-камерой. После эксперимента снимите камеру и промыть ее деионизированной водой.Наблюдалось, что интенсивность флуоресценции ДНК i-мотива увеличивается со скоростью от 9 724 в секунду до 97 245 в секунду в буфере рН 5,5 MES. Однако интенсивность флуоресценции не увеличивалась при сдвиге той же i-мотивной ДНК со скоростью 63,209 в секунду, так как она не складывается при рН 7,4 в буфере MES. Было оценено связывание лиганда с молекулами i-мотива ДНК, подвергшимися чистому потоку, которое показало, что увеличение интенсивности флуоресценции стало менее очевидным с увеличением концентрации лиганда.Константа диссоциации была определена для взаимодействия между лигандом и i-мотивом и оказалась 34 микромолями. Хелатный i-мотив меди был развернут со скоростью сдвига 63, 209 в секунду, а выпущенный медный вызвал флюоргенную реакцию щелчка, что привело к увеличению интенсивности флуоресценции с течением времени. Во-первых, убедитесь, что область обнаружения установлена между ротором и статером.Во-вторых, проверьте и минимизируйте фон флуоресценции. И, наконец, убедитесь, что вы фильтруете реакцию, прежде чем выполнять реакцию щелчка. Этот метод открывает ворота для изучения механической прочности, складывания и разворачивания всех видов полимеров.Это могут быть другие структуры ДНК, белки или другие полимеры и их взаимодействие с другими видами молекул. Как уже было сказано, несколько других макромолекул могут быть изучены с использованием этого подхода.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

Бактериальные Иммобилизация для обработки изображений методом атомно-силовой микроскопии

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Производство концентрированных, на основе липидов Oxygen микропузырька эмульсий с высокой скоростью сдвига гомогенизации и последовательной концентрации

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Измерение максимальной Изометрические усилие, создаваемое проницаемыми скелетных мышечных волокон

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Атомно-силовая микроскопия изображений и силовая спектроскопия поддерживаемых липидного бислоя

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A Protocol for Using FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer FRET-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

Протокол по использованию Ферстер Resonance Energy Transfer (FRET) -Force биосенсоров для измерения механических сил по всему комплексу ядерного ЛИНКА

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

3D-печать микронесущих с гидрогелем in vitro методом чередования вязко-инерционной струйной обработки

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...