Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
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Este trabajo de investigación fue apoyado por la National Science Foundation [CBET-1904921] y los Institutos Nacionales de Salud [NIH R01CA236350] a H. M.

NOTA: Todos los tampones y los reactivos químicos utilizados en este protocolo se enumeran en la tabla Materiales.
1. Preparación del microscopio de fuerza de cizallamiento
NOTA: El microscopio de fuerza de cizallamiento contiene dos partes, una unidad de reacción (homogeneizador) y una unidad de detección (microscopio de fluorescencia). El aumento del ocular es 10x, y el aumento de la lente del objetivo (aire) es 4x.
<ol><li>...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

El protocolo descrito en este manuscrito permite la investigación en tiempo real del despliegue de un conjunto de estructuras biomoleculares por fuerza de corte. Los resultados presentados aquí subrayan que las estructuras del motivo i del ADN pueden desplegarse mediante fuerza de corte. El despliegue del i-motivo ligado al ligando y las reacciones de clic accionadas por fuerza de cizallamiento fueron aplicaciones de prueba de concepto para este método de espectroscopia de fuerza de conjunto.
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En la espectroscopia de fuerza de molécula única1 (SMFS), las propiedades mecánicas de estructuras moleculares individuales han sido estudiadas por instrumentos sofisticados como el microscopio de fuerza atómica, pinzas ópticas y pinzas magnéticas 2,3,4. Restringido por el mismo requisito de direccionalidad de las moléculas en las configuraciones generadoras / de detección de fuerza o el pequeño campo de visión en pinzas magnéticas y el microscopio de fuerza centrífuga en miniatura (MCF)5,6,7,8, solo se puede investigar simultáneamente un número limitado de moléculas utilizando SMFS. El bajo rendimiento de SMFS impide su amplia aplicación en el campo del reconocimiento molecular, que requiere la participación de un gran conjunto de moléculas.
El flujo de cizallamiento proporciona una solución potencial para aplicar fuerzas a un conjunto masivo de moléculas9. En un flujo de líquido dentro de un canal, cuanto más cerca de la superficie del canal, más lento será el caudal10. Tal gradiente de velocidad de flujo causa un esfuerzo cortante que es paralelo a la superficie límite. Cuando una molécula se coloca en este flujo de corte, la molécula se reorienta para que su eje largo se alinee con la dirección del flujo, ya que la fuerza de cizallamiento se aplica al eje largo11. Como resultado de esta reorientación, se espera que todas las moléculas del mismo tipo (tamaño y longitud de los mangos) se alineen en la misma dirección mientras experimentan la misma fuerza de corte.
Este trabajo describe un protocolo para usar dicho flujo de cizallamiento para ejercer fuerza de cizallamiento sobre un conjunto masivo de estructuras moleculares, como lo ejemplifica el motivo i del ADN. En este protocolo, se genera un flujo de corte entre el rotor y el estator en una punta homogeneizadora. El presente estudio encontró que la estructura plegada del i-motivo del ADN podría desplegarse mediante velocidades de cizallamiento de 9724-97245 s−1. Además, se encontró una constante de disociación de 36 μM entre el ligando L2H2-4OTD y el motivo i. Este valor es consistente con el de 31 μM medido por el ensayo de desplazamiento de gel12. Además, la técnica actual se utiliza para desplegar el i-motivo, que puede exponer el cobre quelado (I) para catalizar una reacción de clic. Por lo tanto, este protocolo permite desplegar un gran conjunto de estructuras i-motif con instrumentos de bajo costo en un tiempo razonable (menos de 30 min). Dado que la técnica de fuerza de cizallamiento aumenta drásticamente el rendimiento de la espectroscopia de fuerza, llamamos a esta técnica espectroscopía de fuerza de conjunto (EFS). Este protocolo tiene como objetivo proporcionar directrices experimentales para facilitar la aplicación de este EFS basado en la fuerza de corte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Las técnicas de molécula única basadas en principios de fluorescencia y mecanoquímicos proporcionan una sensibilidad superior en la detección biológica. Sin embargo, debido a la falta de capacidades de alto rendimiento, la aplicación de estas técnicas es limitada en biofísica. La espectroscopia de fuerza de conjunto (EFS) ha demostrado un alto rendimiento en la investigación de un conjunto masivo de estructuras moleculares mediante la conversión de estudios mecanoquímicos de moléculas individuales en los de conjuntos moleculares. En este protocolo, las estructuras secundarias de ADN (i-motivos) se desplegaron en el flujo de corte entre el rotor y el estator de una punta homogeneizadora a velocidades de cizallamiento de hasta 77796 / s. Se demostraron los efectos de las tasas de flujo y los tamaños moleculares sobre las fuerzas de cizallamiento experimentadas por el i-motivo. La técnica EFS también reveló la afinidad de unión entre los i-motivos de ADN y los ligandos. Además, hemos demostrado una reacción química de clic que puede ser accionada por fuerza de cizallamiento (es decir, química de clic mecánico). Estos resultados establecen la efectividad del uso de la fuerza de cizallamiento para controlar la conformación de estructuras moleculares.

La Figura 1 describe el despliegue mecánico y la detección en tiempo real de moléculas de conjunto en EFS. En la Figura 1B, se observó que la intensidad de fluorescencia del ADN i-motif aumentaba con una velocidad de cizallamiento que oscilaba entre 9.724 s−1 y 97.245 s−1 en un tampón MES de pH 5,5. Como control, la intensidad de fluorescencia no aumentó cuando el mismo ADN i-motif se cortó a una velocidad de 63...

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Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

La espectroscopia de fuerza de conjunto (EFS) es una técnica robusta para el despliegue mecánico y la detección en tiempo real de un conjunto de estructuras biomoleculares en campos biofísicos y biosensibles.

Espectroscopía de fuerza de conjunto por fuerzas de cizallamiento

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Este protocolo proporciona una técnica de alto rendimiento para estudiar la unión intermolecular entre el ADN y los ligandos. Esta técnica ha demostrado un alto rendimiento en la investigación de un conjunto masivo de estructuras biomoleculares. Lo hace convirtiendo las propiedades químicas mecánicas de moléculas individuales en las de conjuntos moleculares.Creo que es un experimento muy avanzado, pero hay pocos pasos críticos. Por ejemplo, la alineación del microscopio, el homogeneizador y el tubo de reacción. Estas tres cosas deben estar perfectamente alineadas para rastrear con precisión el cambio en la fluorescencia.Comience ensamblando el homogeneizador y el microscopio en una mesa de montaje. Después de usar gafas, encienda el microscopio de fluorescencia y luego ajuste el homogeneizador para asegurarse de que el haz de luz de excitación pase a través del centro de la punta dispersa del homogeneizador. Luego prepare una cámara de reacción de fondo plano que tenga cinco centímetros de altura y 1.5 por 1.5 centímetros cuadrados de sección transversal, asegurándose de que el material de la cámara seleccionado no emita fluorescencia para reducir el fondo.Después, sujete la cámara de reacción en la etapa de muestra del microscopio de fluorescencia y luego ajuste la cámara para sostener la punta dispersante del homogeneizador, asegurándose de que la punta esté ligeramente por encima de la superficie inferior de la cámara de reacción. A continuación, ajuste la posición vertical del homogeneizador y la cámara juntos para asegurarse de que el foco del microscopio esté en la superficie de la punta de dispersión. A continuación, ajuste la posición horizontal de la punta de dispersión para asegurarse de que el área de detección se establece entre el rotor y el estador.Encienda los canales fluorescentes, de acuerdo con el tinte fluorescente utilizado en el experimento. Antes del experimento de cizallamiento de alta velocidad, se utilizó agua desionizada para probar el cizallamiento con una velocidad de cizallamiento baja. Primero, prepare un ADN telomérico humano con un e-motivo marcado con un tinte y un quencher en sus dos extremos, respectivamente, en agua desionizada como se describe en el manuscrito.A continuación, diluya el ADN en cinco micromolares en tampón MES de 30 milimolares a pH 5.5 o pH 7.4. A la solución de ADN, agregue el ligando L2H24OTD" en un rango de concentración de cero a 60 micromolares y mezcle la solución suavemente durante 10 minutos para doblar las estructuras del motivo i sin luz. Verifique y minimice la intensidad de fluorescencia de fondo de la cámara de reacción que se llena con agua desionizada utilizando el microscopio fluorescente sin cizallamiento.Luego configure los parámetros de la cámara CCD utilizando el software con un tiempo de exposición de 0,5 segundos, sensibilidad CCD de 1, 600 y un tiempo de grabación igual a 20 minutos. Con una pipeta larga, agregue la solución de ADN a la cámara de reacción vacía y limpia y cubra la cámara de reacción con una caja negra. Luego inicie el homogeneizador para realizar el cizallamiento a una velocidad de cizallamiento seleccionada que oscila entre 9, 724 por segundo y 97, 245 por segundo durante 20 minutos, con la cámara CCD encendida para grabar los datos.Después del experimento, retire la cámara y lávela con agua desionizada. Preparar ADN i-motif y agua desionizada. Luego, incubar 10 micromolares de ADN i-motif y 300 microlitros de 30 milimolar tris buffer suplementado con 150 cloruro cúprico micromolar y 300 ácido ascórbico micromolar durante 10 minutos para doblar las estructuras i-motivo.A continuación, ultra filtre la solución con un dispositivo de ultrafiltración a una fuerza centrífuga de 14, 300 veces G.Reponga la solución a aproximadamente 500 microlitros con 30 tampones tris milimolares suplementados con 300 ácido ascórbico micromolar después de cada filtración. Después de recoger la solución residual, hacer un volumen final de 300 microlitros añadiendo 30 tris milimolares suplementados con 300 micromolares de ácido ascórbico junto con 20 micromolares CalFluor 488 Azide, 20 micromolares HPG y 10 micromolares TBTA. Una vez que se agreguen los reactivos, mueva la solución al cuarto oscuro.Luego verifique y minimice la intensidad de fluorescencia de fondo de la cámara de reacción llena de agua desionizada usando el microscopio antes de los experimentos de cizallamiento. A continuación, agregue la solución de ADN en la cámara de reacción vacía con una pipeta larga y luego inicie el cizallamiento del homogeneizador a una velocidad de cizallamiento de 63, 209 por segundo durante 20 minutos con la cámara CCD encendida. Después del experimento, retire la cámara y lávela con agua desionizada.Se observó que la intensidad de fluorescencia del ADN i-motif aumentaba con una velocidad pura que oscilaba entre 9, 724 por segundo y 97, 245 por segundo en un tampón MES de pH 5.5. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia no aumentó cuando el mismo ADN del motivo i se cortó a una velocidad de 63, 209 por segundo, ya que no se pliega a pH 7.4 en el tampón MES. Se evaluó la unión del ligando a las moléculas de ADN i-motivo sometidas al flujo puro, lo que mostró que el incremento de la intensidad de fluorescencia se hizo menos obvio con el aumento de la concentración del ligando.La constante de disociación se determinó para la interacción entre el ligando y el i-motivo y se encontró que eran 34 micromoles. El motivo i-quelatado de cobre se desplegó a una velocidad de cizallamiento de 63, 209 por segundo, y el de cobre liberado desencadenó la reacción de clic fluorgénico, lo que resultó en una mayor intensidad de fluorescencia con el tiempo. En primer lugar, asegúrese de que el área de detección esté establecida entre el rotor y el estador.En segundo lugar, verifique y minimice el fondo de fluorescencia. Y, por último, asegúrese de filtrar la reacción antes de realizar la reacción de clic. Este método abre una puerta para explorar la resistencia mecánica, plegando y desplegando todo tipo de polímeros.Podrían ser otras estructuras de ADN, proteínas u otros polímeros, y su interacción con otros tipos de moléculas. Como se dijo, varias otras macromoléculas podrían estudiarse utilizando este enfoque.

Research

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