Name: ensemble force spectroscopy by shear forces
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Bu araştırma çalışması, Ulusal Bilim Vakfı [CBET-1904921] ve Ulusal Sağlık Enstitüleri [NIH R01CA236350] tarafından H. M. tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm tamponlar ve kimyasal reaktifler Tablo Malzemeleri'nde listelenmiştir.
1. Kesme kuvveti mikroskobunun hazırlanması
NOT: Kesme kuvveti mikroskobu, bir reaksiyon ünitesi (homojenizatör) ve bir algılama ünitesi (floresan mikroskobu) olmak üzere iki bölümden oluşur. Göz merceğinin büyütülmesi 10x'tir ve objektif lensin (hava) büyütmesi 4x'tir.
<ol><li>Homojenizatörü ve mikroskobu...

<ol>
	<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+Optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins.">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li><li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+strong+is+a+covalent+bond.">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li><li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+supercoiled+DNA.">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li><li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge.">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026 (2016).</li><li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules.">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li><li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility:+Force-induced+collagen+destabilization.">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li><li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors.">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li><li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function.">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li><li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells:+go+with+the+flow.">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li><li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force.">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li><li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound.">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li><li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units.">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li><li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level.">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li><li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+mechanochemical+sensing.">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li></ol>

Bu makalede açıklanan protokol, bir grup biyomoleküler yapının kesme kuvveti ile açılmasının gerçek zamanlı olarak araştırılmasına izin verir. Burada sunulan sonuçlar, DNA i-motif yapılarının kesme kuvveti ile açılabileceğinin altını çizmektedir. Ligand'a bağlı i-motifin açılması ve kesme kuvveti ile harekete geçirilmiş tıklama reaksiyonları, bu topluluk kuvveti spektroskopisi yöntemi için kavram kanıtı uygulamalarıydı.
Şekil 1'de</...

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi1'de (SMFS), bireysel moleküler yapıların mekanik özellikleri, atomik kuvvet mikroskobu, optik cımbız ve manyetik cımbız 2,3,4 gibi sofistike aletlerle incelenmiştir. Kuvvet üreten/algılayan kurulumlardaki moleküllerin aynı yönlülük gereksinimi veya manyetik cımbızdaki küçük görüş alanı ve minyatür santrifüj kuvvet mikroskobu (MCF)5,6,7,8 ile sınırlı olarak, SMFS kullanılarak aynı anda yalnızca sınırlı sayıda molekül araştırılabilir. SMFS'nin düşük verimi, büyük bir molekül kümesinin katılımını gerektiren moleküler tanıma alanındaki geniş uygulamasını önler.
Kesme akışı, büyük bir molekül kümesine kuvvet uygulamak için potansiyel bir çözüm sağlar9. Bir kanalın içindeki sıvı akışında, kanal yüzeyine ne kadar yakın olursa, akış hızı10 o kadar yavaş olur. Böyle bir akış hızı gradyanı, sınır yüzeyine paralel kesme gerilimine neden olur. Bir molekül bu kesme akışına yerleştirildiğinde, molekül kendisini yeniden yönlendirir, böylece kesme kuvveti uzun eksen11'e uygulandığında, uzun ekseni akış yönüyle hizalanır. Bu yeniden yönlendirmenin bir sonucu olarak, aynı tipteki tüm moleküllerin (sapların boyutu ve uzunluğu) aynı kesme kuvvetini yaşarken aynı yönde hizalanması beklenir.
Bu çalışma, DNA i-motifi tarafından örneklendiği gibi, büyük bir moleküler yapı kümesine kesme kuvveti uygulamak için böyle bir kesme akışını kullanmak için bir protokolü tanımlamaktadır. Bu protokolde, homojenizatör ucundaki rotor ve stator arasında bir kesme akışı oluşturulur. Bu çalışma, katlanmış DNA i-motif yapısının 9724-97245 s-1 kesme oranlarıyla açılabileceğini buldu. Ayrıca, L2H2-4OTD ligand ile i-motif arasında 36 μM'lik bir ayrışma sabiti bulundu. Bu değer, jel kayma testi 12 ile ölçülen 31 μM iletutarlıdır. Ayrıca, mevcut teknik, bir tıklama reaksiyonunu katalize etmek için şelatlı bakırı (I) açığa çıkarabilen i-motifi açmak için kullanılır. Bu protokol böylece, makul bir sürede (30 dakikadan daha kısa) düşük maliyetli aletlerle büyük bir dizi i-motif yapısının ortaya çıkmasına izin verir. Kesme kuvveti tekniğinin kuvvet spektroskopisinin verimini büyük ölçüde arttırdığı göz önüne alındığında, bu tekniğe topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS) diyoruz. Bu protokol, bu kesme kuvvetine dayalı EFS'nin uygulanmasını kolaylaştırmak için deneysel kılavuzlar sağlamayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3K MWCO Amicon</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ufc900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0143-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calfluor 488 azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1369-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>ACRO270525000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersion tip</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT-DA07/2EC-B101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dye</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/5Cy5/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Janpan</td>
			<td>Nikon TE2000-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Switzerland</td>
			<td>PT 3100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>cs-295271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC26760.295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE169-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quencher</td>
			<td>IDT</td>
			<td>/3IAbRQSp/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>T2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRCE133-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensemble force spectroscopy by shear forces

Floresan ve mekanokimyasal prensiplere dayanan tek moleküllü teknikler biyolojik algılamada üstün duyarlılık sağlar. Bununla birlikte, yüksek verim yeteneklerinin eksikliği nedeniyle, bu tekniklerin uygulanması biyofizikte sınırlıdır. Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), bireysel moleküllerin mekanokimyasal çalışmalarını moleküler toplulukların çalışmalarına dönüştürerek büyük bir moleküler yapı kümesinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bu protokolde, DNA ikincil yapıları (i-motifler), bir homojenizatör ucunun rotoru ile statoru arasındaki kesme akışında 77796 / s'ye kadar kesme hızlarında açılmıştır. Akış hızlarının ve moleküler boyutların i-motifin yaşadığı kesme kuvvetleri üzerindeki etkileri gösterilmiştir. EFS tekniği ayrıca DNA i-motifleri ve ligandlar arasındaki bağlanma afinitesini de ortaya çıkardı. Ayrıca, kesme kuvveti (yani, mekano-tıklama kimyası) ile harekete geçirilebilen bir tıklama kimyası reaksiyonu gösterdik. Bu sonuçlar, moleküler yapıların konformasyonunu kontrol etmek için kesme kuvveti kullanmanın etkinliğini ortaya koymaktadır.

Şekil 1, EFS'deki topluluk moleküllerinin mekanik açılımını ve gerçek zamanlı algılanmasını özetlemektedir. Şekil 1B'de, i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda 9.724 s-1 ila 97.245 s-1 arasında değişen kesme hızı ile arttığı gözlenmiştir. Bir kontrol olarak, aynı i-motif DNA'sı pH 7.4 MES tamponunda 63.209 s-1 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmadı...

Watch this Scientific Journal Video about Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces at JoVE.com

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Bu protokol, DNA ve ligandlar arasındaki moleküller arası bağlanmayı incelemek için yüksek verimli bir teknik sağlar. Bu teknik, büyük biyomoleküler yapı setinin araştırılmasında yüksek verim göstermiştir. Bunu, bireysel moleküllerin mekanik kimyasal özelliklerini moleküler toplulukların özelliklerine dönüştürerek yapar.Bunun çok ileri bir adım olduğunu düşünüyorum, ancak kritik olarak birkaç adım var. Örneğin, mikroskop, homojenizatör ve reaksiyon tüpünün hizalanması. Floresandaki değişimi doğru bir şekilde izlemek için bu üç şey mükemmel bir şekilde hizalanmalıdır.Homojenizatörü ve mikroskobu bir montaj tablasına monte ederek başlayın. Gözlük taktıktan sonra, floresan mikroskobu açın ve ardından uyarma ışık demetinin homojenizatörün dağılma ucunun merkezinden geçtiğinden emin olmak için homojenizatörü ayarlayın. Ardından, beş santimetre yüksekliğinde ve enine kesitte 1,5 x 1,5 santimetrekare olan düz tabanlı bir reaksiyon odası hazırlayın ve seçilen oda malzemesinin arka planı azaltmak için floresan yapmamasını sağlayın.Daha sonra, reaksiyon odasını floresan mikroskobun numune aşamasında kelepçeleyin ve ardından hazneyi homojenizatörün dispersiyon ucunu tutacak şekilde ayarlayarak ucun reaksiyon odasının alt yüzeyinin biraz üzerinde olmasını sağlayın. Daha sonra, mikroskopun odağının dispersiyon ucunun yüzeyinde olduğundan emin olmak için homojenizatörün ve haznenin dikey konumunu birlikte ayarlayın. Ardından, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olmak için dağılım ucunun yatay konumunu ayarlayın.Deneyde kullanılan floresan boyaya göre floresan kanallarını açın. Yüksek hızlı kesme deneyinden önce, kesmeyi düşük kesme hızıyla test etmek için deiyonize su kullanıldı. İlk olarak, el yazmasında açıklandığı gibi deiyonize suda sırasıyla iki ucunda bir boya ve bir söndürücü ile etiketlenmiş bir insan telomerik i-motif DNA'sı hazırlayın.Daha sonra, DNA'yı pH 5.5 veya pH 7.4'te 30 milimolar MES tamponunda beş mikromolara seyreltin. DNA çözeltisine, sıfır ila 60 mikromolar konsantrasyon aralığında ligand L2H24OTD" ekleyin ve i-motif yapılarını ışıksız katlamak için çözeltiyi 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın. Floresan mikroskobu kullanarak deiyonize suyla doldurulan reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kesmeden kontrol edin ve en aza indirin.Ardından, yazılımı kullanarak CCD kameranın parametrelerini pozlama süresi 0,5 saniye, CCD hassasiyeti 1.600 ve kayıt süresi 20 dakikaya eşit olacak şekilde ayarlayın. Uzun bir pipet kullanarak, DNA çözeltisini boş ve temiz reaksiyon odasına ekleyin ve reaksiyon odasını kara bir kutu ile örtün. Ardından, verileri kaydetmek için CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 9.724 ila 97.245 arasında değişen seçilmiş bir kesme hızında kesme gerçekleştirmek için homojenizatörü çalıştırın.Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın. İ-motif DNA ve deiyonize su hazırlayın. Daha sonra, i-motif yapılarını katlamak için 10 dakika boyunca 10 mikromolar i-motif DNA'sını ve 150 mikromolar cupric klorür ve 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 300 mikrolitre 30 milimolar tris tamponunu inkübe edin.Daha sonra çözeltiyi 14.300 kat santrifüj kuvvetinde bir ultra filtreleme cihazı ile ultra filtreleyin G.Her filtrasyondan sonra 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris tamponu ile çözeltiyi yaklaşık 500 mikrolitreye doldurun. Artık çözeltiyi topladıktan sonra, 20 mikromolar CalFluor 488 Azide, 20 mikromolar HPG ve 10 mikromolar TBTA ile birlikte 300 mikromolar askorbik asit ile desteklenmiş 30 milimolar tris ekleyerek 300 mikrolitrelik son bir hacim oluşturun. Reaktifler eklendikten sonra, çözeltiyi karanlık odaya taşıyın.Ardından, kesme deneylerinden önce mikroskop kullanarak deiyonize suyla dolu reaksiyon odasının arka plan floresan yoğunluğunu kontrol edin ve en aza indirin. Daha sonra, DNA çözeltisini uzun bir pipetle boş reaksiyon odasına ekleyin ve ardından homojenizatörün CCD kamera açıkken 20 dakika boyunca saniyede 63.209 kesme hızında kesilmesini başlatın. Deneyden sonra, odayı çıkarın ve deiyonize suyla yıkayın.i-motif DNA'nın floresan yoğunluğunun, pH 5.5 MES tamponunda saniyede 9.724 ila saniyede 97.245 arasında değişen saf bir hızla arttığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, aynı i-motif DNA'sı saniyede 63.209 oranında kesildiğinde floresan yoğunluğu artmamıştır, çünkü MES tamponunda pH 7.4'te katlanmaz. Saf akışa maruz kalan DNA i-motif moleküllerine ligand bağlanması değerlendirildi, bu da floresan yoğunluğunun artışının artan ligand konsantrasyonu ile daha az belirgin hale geldiğini gösterdi.Ligand ve i-motif arasındaki etkileşim için ayrışma sabiti belirlendi ve 34 mikromol olduğu bulundu. Bakır olan şelatlı i-motif, saniyede 63.209 kesme hızında açıldı ve serbest bırakılan bakır, florjenik tıklama reaksiyonunu tetikledi ve zamanla floresan yoğunluğunun artmasına neden oldu. İlk olarak, algılama alanının rotor ve stater arasında ayarlandığından emin olun.İkincisi, floresan arka planını kontrol edin ve en aza indirin. Son olarak, tıklama reaksiyonu gerçekleştirmeden önce reaksiyonu filtrelediğinizden emin olun. Bu yöntem, mekanik mukavemeti keşfetmek, her türlü polimeri katlamak ve açmak için bir ağ geçidi açar.Diğer DNA yapıları, proteinler veya diğer polimerler ve bunların diğer molekül türleriyle etkileşimleri olabilir. Söylendiği gibi, bu yaklaşım kullanılarak birkaç başka makromolekül incelenebilir.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Biyomühendislik

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Atomik Kuvvet Mikroskopi Görüntüleme Bakteriyel İmmobilizasyon

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important applications in the quest for the development of novel therapeutics. Assays using static conditions fail to capture the dependence of adhesion on shear, limiting their correlation with in vivo environment. Parallel plate flow chambers that quantify adhesion under physiological fluid flow need multiple experiments for the generation of a shear adhesion map. In addition, they do not represent the in vivo scale and morphology and require large volumes (~ml) of reagents for experiments. In this study, we demonstrate the generation of shear adhesion map from a single experiment using a microvascular network based microfluidic device, SynVivo-SMN. This device recreates the complex in vivo vasculature including geometric scale, morphological elements, flow features and cellular interactions in an in vitro format, thereby providing a biologically realistic environment for basic and applied research in cellular behavior, drug delivery, and drug discovery. The assay was demonstrated by studying the interaction of the 2 &#181;m biotin-coated particles with avidin-coated surfaces of the microchip. The entire range of shear observed in the microvasculature is obtained in a single assay enabling adhesion vs. shear map for the particles under physiological conditions.

Flow chambers used in adhesion experiments typically consist of linear flow paths and require multiple experiments at different flow rates to generate a shear adhesion map. SynVivo-SMN enables the generation of shear adhesion map using a single experiment utilizing microliter volumes resulting in significant savings in time and consumables.

SynVivo Sentetik Mikrovasküler Ağları kullanma Kesme Yapışma Haritası Üretimi

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Yüksek homojenizasyon ve Seri Konsantrasyon konsantre, Lipid-tabanlı Oksijen Mikro Emülsiyonlar imalatı

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Permeabilize İskelet Kası Fibers tarafından oluşturulan Maksimum İzometrik Kuvvet Ölçümü

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

Alternatif Viskoz-Atalet Kuvveti Jetting ile In Vitro Hydrogel Mikrokaçörlerinin 3D Baskısı

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...