Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Forskningen blev støttet af Miniatura-bevillingen (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

1. Modifikation af transmissionselektronmikroskop
<ol><li>Transformér transmissionselektronmikroskopet ved at forbinde den optiske fiber (se Materialetabel) til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillad et par centimeter mellemrum mellem objektivlinsen og kondensatorlinsen plus en gratis plads til tilbehør. BEMÆRK: En dedikeret prøveholder4 eller en holder til katodoluminescerende observationer i omvendt konfiguration1 k...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

Installation og idriftsættelse af belysningen kræver grundlæggende servicekendskab og kan beskadige mikroskopet. Den enkleste måde at introducere lyset til mikroskopet er at forbinde den optiske fiber fra toppen af objektivlinsen, hvor der normalt er plads til TEM-afbøjningsspolerne og yderligere detektorer. Der kan også forventes mere ledig plads fra ældre topindgangsenheder, hvor det samme sted huser prøvevakuumlåsen og prøveinstallationsmekanismen. Denne konfiguration er bredt beskrevet i en tidligere rappor...

Lysinducerede fænomener i høj opløsning er interessante inden for mange områder såsom nanoengineering 1,2,3, katalyse 4,5 og biofotonik6. Nogle originale designs, der tillader sådanne eksperimenter, kan findes i litteraturen, herunder ændringer af prøveindehaverne 1,4,7,8,9 og den optiske fiber, der er fastgjort til mikroskopet 10,11.
Kombinationen af lysbelysning, et flydende miljø og transmissionselektronmikroskopi (TEM) giver en fantastisk mulighed for detaljerede, dynamiske undersøgelser af fotoinducerede processer. Imidlertid er højvakuumtilstanden inde i mikroskopet ret ugunstig for mange væsker, især vandopløsninger. Væskeindkapsling, som beskytter den mod miljøet, kan opnås ved hjælp af nogle få teknikker, der hovedsageligt er baseret på grafen 12, siliciumnitrid13 eller kulstof14 substrater. Ud over forskning i materialevidenskab2 giver såkaldte flydende celler mulighed for at udføre ukonventionelle mikroskopiske observationer af biologiske prøver nær deres oprindelige forhold15. Sådanne observationer er ekstremt krævende, især for levende mikroorganismer såsom bakterieceller. Elektronstrålen som ioniserende stråling forårsager irreversibel skade på de hydrerede prøver, så elektrondosis skal specificeres16. Dette er nødvendigt for at minimere ugunstige virkninger, kontrollere skaden og undgå forvirrende artefakter. Den optimale maksimale elektrondosis, der tillader observationer af levende celler, er stadig et tvivlsomt emne16, men dosis på 30 e-/nm2 ser ud til at være tærskelværdien, i det mindste for bakterier17.
Nogle af emnerne af interesse for sådanne mikroskopiske undersøgelser er processer under antimikrobiel fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt fortsætter terapien som følger. Bakteriecellerne er omgivet af den lysfølsomme væske kaldet fotosensibilisator. Når lysbelysning gives ved en bestemt bølgelængde, genereres de cytotoksiske reaktive iltarter (ROS) fra energi- eller ladningsoverførsel fra de ophidsede fotosensibilisatormolekyler til det ilt, der er naturligt til stede i opløsningen. Patogener udsat for ROS inaktiveres hurtigt med meget høj effektivitet uden bivirkninger19. Responsen på terapien varierer for forskellige mikrober - for eksempel kan virkningen af den samme fotosensibilisator være helt forskellig for grampositive og gramnegative bakterier20. Generelt er det blevet fastslået, at hovedmålet for ROS er cellernes ydre strukturer, hvor skader resulterer i funktionelle lidelser i cellemembranen og følgelig fører til bakteriedød21,22. Imidlertid kan skader på nukleinsyrer og proteiner også betragtes som en årsag til inaktivering18, så det er stadig ukendt, hvilke cellestrukturer der er de vigtigste mål under denne proces19. En dybere forståelse af de skadelige processer kan bidrage til at forbedre denne endelige terapi. Sammenlignet med de lysmikroskopimetoder, der anvendes i APDT-forskning23, giver TEM-teknikker flere muligheder for at se på APDT-mekanismen med højere opløsning og forstørrelse24. TEM er allerede med succes blevet brugt til celleobservation under igangværende behandling, hvilket gjorde det muligt for os at studere grampositive bakterier og beskrive ændringerne i cellevæggen i detaljer 6,25.
Den nuværende protokol præsenterer en passende eksperimentel opsætning til højopløsningsbilleddannelse af lysinduceret bakterieinaktivering ved hjælp af TEM, hvilket kræver et ordentligt lysbelysningssystem, indkapsling af celler med en væske og streng elektrondosiskontrol. Bakterierne, der blev brugt til observationen, var Staphylococcus aureus, og en methylenblå opløsning blev brugt som fotosensibilisator. Den specielle lysbelysningsopsætning består af en justerbar halvlederlaser, der er forbundet direkte til mikroskopsøjlen ved hjælp af lysfiberen. Dette design giver ensartet bestråling i hele prøven på grund af den næsten parallelle placering af den optiske fiber til mikroskopaksen. Monokromatisk lys med høj intensitet genereret af laseren kan derefter bruges til at studere forskellige fotokemiske effekter. Lyset, der blev brugt i eksperimentet, havde en bølgelængde svarende til 660 nm, fordi methylenblåt i det synlige område har absorptionstoppe ved 613 nm og 664 nm26. Protokollen for væskeindkapsling er baseret på kulstofsubstrater, hvilket gør proceduren hurtig og ukompliceret. Endelig præsenteres en metode til lavdosis in situ TEM-observation af celler i væske. Vanskelighederne med prøveforberedelse, elektrondosiseffekterne på den følsomme prøve og rimelig billedfortolkning diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

Den nuværende protokol beskriver ændringerne af transmissionselektronmikroskopet (TEM) opsætning til in situ lysinducerede observationer. En optisk glasfiber indsat i elektronsøjlen over objektivlinsens polstykke og en laser, en justerbar lyskilde, blev brugt til at fremstille enheden. Efter at belysningen er kalibreret ved hjælp af et eksternt målesystem, giver det en mulighed for at justere belysningens intensitet til behovene i den observerede proces. Dette belysningssystem blev brugt til at afbilde antimikrobielle fotodynamiske terapifænomener, som i øjeblikket er genstand for intens forskning. Prøven blev fremstillet ved at spotte en suspension af bakterier på et carbon-, grafen- eller siliciumnitridsubstrat, blotte den overskydende opløsning, spotte fotosensibilisatoropløsningen, blotte den overskydende væske igen og derefter samle væskecellen med et andet substrat eller grafenfilm. Processen med selve billeddannelseseksperimentet omfatter valg af det rigtige sted til observation ved brug af lav forstørrelse og en minimumsdosis elektroner og derefter cyklisk aktivering af lyskilden for at tage efterfølgende billeder med bestemte intervaller med den mindste mængde elektroner, der er nødvendig. Elektrondosis for hver eksponering og tid og intensitet af den anvendte belysning skal registreres omhyggeligt på grund af kompleksiteten af de observerede fænomener, da processen samtidig er både lys- og elektrondrevet. Efter at det faktiske forsøg er udført, skal der foretages yderligere kontrolobservationer, hvor de samme doser elektroner anvendes, men uden yderligere lyspåvirkning, og mindre doser elektroner anvendes til højere doser lys. Dette gør det muligt at skelne lysinducerede mikrostrukturelle virkninger fra dem, der er forårsaget af elektroner inden for både livs- og materialevidenskab.

Den eksperimentelle opsætning blev designet til at observere de lysinducerede processer, der forekommer i en væske med høj opløsning. Den konkurrencedygtige analyse af billederne tillod os at skelne skaden forårsaget af elektronstrålen fra ændringer relateret til den fotokemiske reaktion. Elektronstrålens virkning på den følsomme prøve (i dette tilfælde cellerne indkapslet med væske) var synlig over hele det bestrålede område, da elektronerne trængte ensartet igennem det. Selvfølgelig afhænger effekten ...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Den nuværende protokol beskriver transmissionselektronmikroskop (TEM) modifikationer med et lysbelysningssystem, fremstilling af flydende celler og in situ TEM-observationer af lysinducerede interaktioner mellem bakterieceller og en fotosensibilisator. Prøveforberedelsesmetoderne, elektronstråleskader og billeddannelse diskuteres også.

Lysinduceret in situ transmissionselektronmikroskopi til observation af interaktionen mellem flydende og blødt stof

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Protokollen præsenterer, hvordan kombinationen af flydende celle TEM og lysbelysning kan bruges til at observere de strukturelle ændringer i bakterierne indkapslet med fotosensibilisator ved lysbelysning. Den største fordel ved denne teknik er dens enkelhed. Protokollen kræver ikke vanskelig prøveforberedelse og giver tilstrækkelig indkapsling af bakterier med fotosensibilisatoropløsning.Til at begynde med skal du ændre transmissionselektronmikroskopet ved at forbinde den optiske fiber til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillad et par centimeter mellemrum mellem objektivlinsen og kondensatorlinsen plus en gratis plads til tilbehør. Placer to ubehandlede TEM-gitre dækket med amorft kulstof mellem to krydsede pincetter, der vender mod den kulstofbelagte side mod toppen.Hold gitterene så tæt på kanten som muligt. Sæt fire mikroliter bakterieopløsning på et af gitterene. Prøvens optiske tæthed skal ligge mellem fem og 10.Vent i 60 sekunder, og tør forsigtigt væsken ved hjælp af filterpapir. Prøv at sprede væsken gennem hele gitteroverfladen under processen. Sæt fire mikroliter fotosensibilisator på samme gitter.Efter fem sekunder skal du slette væsken. Efterlad et meget tyndt lag væske på underlaget. Placer hurtigt det tørre gitter oven på det, der er dækket af væske.Flyt forsigtigt det øverste gitter til kanten af det andet, og klem underlagene ved kanterne ved hjælp af pincet. Gentag forsigtigt klemmen. Lad væskecellen stå mellem pincetten i et minut.Prøven indsættes i TEM-holderen lige efter afslutningen af tilberedningen. Når prøven er indsat i mikroskopet, skal du starte observationerne i lav forstørrelsestilstand for at finde et passende observationsområde. Under observationerne holdes elektrondosis så lav som muligt.Udvid eksponeringstiden. Find cellerne omgivet af væske ved den passende forstørrelse med forlænget eksponeringstid, og tag det første billede med det samme. Hold elektrondosis konstant, og saml billeder hvert 30. sekund for at observere ændringerne.Undersøg omhyggeligt billederne og beregn den samlede elektrondosis, der svarer til de første synlige ændringer i cellerne. Før du starter eksperimentet, skal du indstille laserlysintensiteten ved at justere den aktuelle værdi. Indsæt prøven i mikroskopet og find observationsområdet.Tag det første billede af cellen, før du begynder belysning af prøven, og brug stråleblankeren til at slukke for elektronstrålen for at undgå virkningerne af elektronbestråling. Tænd laseren. Start med en kort belysningstid, da laserlyset har relativt høj intensitet.Efter den tid skal du slukke for lyskilden. Sluk for stråleemnet, og tag billedet med det samme. Hvis det er muligt, skal du bruge en automatisk algoritme til kun at udsætte prøven for den tid, der er nødvendig for at tage billedet.Mål omhyggeligt elektronbestrålingstiden for at beregne den elektrondosis, der anvendes til billeddannelse. En bemærkelsesværdig nedbrydning af det ydre lag af cellen forårsaget af den reaktive iltart, der genereres af lettere stråling af fotosensibilisatoren efter et minut, observeres. Yderligere lysbelysning gjorde ændringerne mere synlige.Korrekte observationssteder med tilstrækkelig væske kan let findes ved lav forstørrelse, da disse områder ser mørkere og slørede ud. De flydende dækkede bakterier er mindre synlige end de tørre, men kan stadig skelnes. Det er nyttigt at se på væskegrænsen under billeddannelsen, og dens bevægelse kan let detekteres, hvilket indebærer, at det valgte område kan være uegnet og ustabilt.Et andet problem under observationer er fordampning af vandet og udfældning af opløsningen, som kan forekomme i tilfældige områder af prøven, herunder områderne omkring bakterierne. Indkapsling af bakterier kan også udføres ved anvendelse af grafen og siliciumnitratmembraner. Prøveforberedelsen er vanskeligere, men stabiliteten af den flydende celle vil være bedre.Den præsenterede metode kan bruges til observationer af lysinducerede reaktioner på væske. For eksempel lysets indflydelse på metalmaterialer, lysinducerede katalysatorer og fotokemiske reaktioner.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Afslørende dynamiske processer af materialer i væsker ved brug Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Tidsafhængig Dielektriske Opdeling i Transmission Electron Microscope: En Mulighed for at forstå Manglende Mechanism i mikroelektroniske indretninger

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Studere dynamiske processer af Nano-størrelse Objekter i Liquid hjælp Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

Karakterisering af Ultra-finkornede og Nanokrystallinske Materialer Brug Transmission Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

Orienterende overgang i en flydende krystal udløst af den termodynamiske vækst af grænseflader

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

En metode til at indhente seriel ultratynde sektioner af mikroorganismer i transmissions Elektron Mikroskopi

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

All-elektroniske nanosekund-løst Scanning Tunneling Mikroskopi: At lette undersøgelsen af enkelt Dopant afgift Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Metoder til Ex Situ og In Situ undersøgelser af strukturelle forandringer: sagen om krystallisering af metalliske briller

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Encifrede Nanometer Electron-Beam litografi med en Aberration-korrigeret Scanning transmissions elektron mikroskop

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Mikroskopi med biasing og fremstilling af asymmetriske overliggere baseret på blandet faset en-VOx