Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
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Die Forschung wurde durch das Miniatura-Stipendium (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen) unterstützt.

1. Modifikation des Transmissionselektronenmikroskops
<ol><li>Modifizieren Sie das Transmissionselektronenmikroskop, indem Sie die optische Faser (siehe Materialtabelle) mit der Mikroskopsäule oben auf der Objektivlinse verbinden. Lassen Sie einige Zentimeter Platz zwischen der Objektivlinse und der Kondensatorlinse sowie einen freien Schlitz für Zubehör. HINWEIS: Ein dedizierter Probenhalter4 oder ein Halter für kathodolumineszierende Beobachtungen in um...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

Die Installation und Inbetriebnahme der Beleuchtung erfordert grundlegende Servicekenntnisse und kann das Mikroskop beschädigen. Der einfachste Weg, das Licht in das Mikroskop einzuführen, besteht darin, die optische Faser von der Oberseite der Objektivlinse aus zu verbinden, wo normalerweise Platz für die TEM-Ablenkspulen und zusätzliche Detektoren ist. Mehr Freiraum kann auch von älteren Top-Entry-Geräten erwartet werden, bei denen sich am selben Ort die Probenvakuumschleuse und der Probeninstallationsmechanismus...

Lichtinduzierte Phänomene in hoher Auflösung sind in vielen Bereichen wie Nanoengineering 1,2,3, Katalyse 4,5 und Biophotonik6 interessant. Einige originelle Designs, die solche Experimente ermöglichen, finden sich in der Literatur, einschließlich Modifikationen der Probenhalter 1,4,7,8,9 und der am Mikroskop 10,11 befestigten optischen Faser.
Die Kombination aus Lichtbeleuchtung, flüssiger Umgebung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet eine großartige Gelegenheit für detaillierte, dynamische Untersuchungen photoinduzierter Prozesse. Die Hochvakuumbedingungen im Mikroskop sind jedoch für viele Flüssigkeiten, insbesondere Wasserlösungen, eher ungünstig. Die Flüssigkeitsverkapselung, die es vor der Umwelt schützt, kann mit einigen Techniken erreicht werden, die hauptsächlich auf Graphen 12, Siliziumnitrid13 oder Kohlenstoff14-Substraten basieren. Neben der materialwissenschaftlichen Forschung2 bieten sogenannte flüssige Zellen Möglichkeiten, unkonventionelle mikroskopische Beobachtungen an biologischen Proben in der Nähe ihrer nativen Bedingungendurchzuführen 15. Solche Beobachtungen sind vor allem für lebende Mikroorganismen wie Bakterienzellen äußerst anspruchsvoll. Der Elektronenstrahl als ionisierende Strahlung verursacht irreversible Schäden an den hydratisierten Proben, so dass die Elektronendosis angegeben werden muss16. Dies ist notwendig, um ungünstige Auswirkungen zu minimieren, den Schaden zu kontrollieren und verwirrende Artefakte zu vermeiden. Die optimale maximale Elektronendosis, die Beobachtungen lebender Zellen erlaubt, ist noch ein fragwürdiges Thema16, aber die Dosis von 30 e−/nm2 scheint der Schwellenwert zu sein, zumindest für Bakterien17.
Einige der Themen, die für solche mikroskopischen Studien von Interesse sind, sind Prozesse während der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (APDT)18. Kurz gesagt, die Therapie verläuft wie folgt. Die Bakterienzellen sind von der lichtempfindlichen Flüssigkeit namens Photosensibilisator umgeben. Wenn die Lichtbeleuchtung bei einer bestimmten Wellenlänge gegeben wird, werden die zytotoxischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Energie- oder Ladungstransfer von den angeregten Photosensibilisatormolekülen auf den natürlich in der Lösung vorhandenen Sauerstoff erzeugt. Krankheitserreger, die ROS ausgesetzt sind, werden schnell mit sehr hoher Effizienz inaktiviert, ohne Nebenwirkungen19. Das Ansprechen auf die Therapie variiert für verschiedene Mikroben – zum Beispiel kann die Wirkung desselben Photosensibilisators für grampositive und gramnegative Bakterien sehr unterschiedlich sein20. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass das Hauptziel von ROS die äußeren Strukturen von Zellen sind, wo Schäden zu Funktionsstörungen der Zellmembran und folglich zum Tod von Bakterien führen21,22. Aber auch Schäden an Nukleinsäuren und Proteinen können als Ursache für die Inaktivierung angesehen werden18, so dass noch unbekannt ist, welche Zellstrukturen die Hauptziele während dieses Prozesses sind19. Ein tieferes Verständnis der schädigenden Prozesse könnte helfen, diese definitive Therapie zu verbessern. Im Vergleich zu den lichtmikroskopischen Methoden, die in der APDT-Forschung23 verwendet werden, bieten TEM-Techniken mehr Möglichkeiten, den APDT-Mechanismus mit höherer Auflösung und Vergrößerung zu betrachten24. TEM wurde bereits erfolgreich zur Zellbeobachtung während der laufenden Therapie eingesetzt, wodurch wir grampositive Bakterienschäden untersuchen und die Veränderungen innerhalb der Zellwand detailliert beschreibenkonnten 6,25.
Das aktuelle Protokoll stellt einen geeigneten Versuchsaufbau für die hochauflösende Bildgebung der lichtinduzierten Bakterieninaktivierung mittels TEM dar, was ein geeignetes Lichtbeleuchtungssystem, die Verkapselung von Zellen mit einer Flüssigkeit und eine strenge Elektronendosiskontrolle erfordert. Das für die Beobachtung verwendete Bakterium war Staphylococcus aureus, und eine Methylenblaulösung wurde als Photosensibilisator verwendet. Der spezielle Lichtbeleuchtungsaufbau besteht aus einem durchstimmbaren Halbleiterlaser, der über die Lichtfaser direkt mit der Mikroskopsäule verbunden ist. Dieses Design bietet eine gleichmäßige Bestrahlung in der gesamten Probe aufgrund der nahezu parallelen Platzierung der optischen Faser zur Mikroskopachse. Monochromatisches Licht von hoher Intensität, das vom Laser erzeugt wird, kann dann verwendet werden, um verschiedene photochemische Effekte zu untersuchen. Das im Experiment verwendete Licht hatte eine Wellenlänge gleich 660 nm, da Methylenblau im sichtbaren Bereich Absorptionspeaks bei 613 nm und 664 nm26 aufweist. Das Protokoll für die Flüssigkeitsverkapselung basiert auf Kohlenstoffsubstraten, was das Verfahren schnell und unkompliziert macht. Schließlich wird eine Methode zur niedrig dosierten in situ TEM-Beobachtung von Zellen in Flüssigkeit vorgestellt. Die Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung, die Auswirkungen der Elektronendosis auf die empfindliche Probe und die vernünftige Bildinterpretation werden diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Modifikationen des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) für in situ lichtinduzierte Beobachtungen. Eine Glasfaser, die in die Elektronensäule über dem Polstück der Objektivlinse eingeführt wurde, und ein Laser, eine einstellbare Lichtquelle, wurde verwendet, um das Gerät herzustellen. Nachdem die Beleuchtung mit einem externen Messsystem kalibriert wurde, kann die Intensität der Beleuchtung an die Bedürfnisse des beobachteten Prozesses angepasst werden. Dieses Beleuchtungssystem wurde verwendet, um antimikrobielle photodynamische Therapiephänomene abzubilden, die derzeit Gegenstand intensiver Forschung sind. Die Probe wurde vorbereitet, indem eine Bakteriensuspension auf einem Kohlenstoff-, Graphen- oder Siliziumnitridsubstrat entdeckt, die überschüssige Lösung abgetupft, die Photosensibilisatorlösung entdeckt, die überschüssige Flüssigkeit erneut abgetupft und dann die flüssige Zelle mit einem zweiten Substrat oder Graphenfilm zusammengesetzt wurde. Der Prozess des bildgebenden Experiments selbst umfasst die Auswahl des richtigen Beobachtungsortes mit geringer Vergrößerung und einer minimalen Elektronendosis und dann die zyklische Aktivierung der Lichtquelle, um nachfolgende Bilder in festgelegten Intervallen mit der minimalen Menge an Elektronen aufzunehmen. Die Elektronendosis jeder Exposition sowie die Zeit und Intensität der verwendeten Beleuchtung müssen aufgrund der Komplexität der beobachteten Phänomene sorgfältig aufgezeichnet werden, da der Prozess gleichzeitig licht- und elektronengetrieben ist. Nach Durchführung des eigentlichen Experiments müssen zusätzliche Kontrollbeobachtungen gemacht werden, bei denen die gleichen Elektronendosen verwendet werden, jedoch ohne zusätzlichen Lichteinfluss und kleinere Elektronendosen für höhere Lichtdosen verwendet werden. Dies ermöglicht es, lichtinduzierte Mikrostruktureffekte sowohl in den Lebens- als auch in den Materialwissenschaften von denen zu unterscheiden, die durch Elektronen verursacht werden.

Der Versuchsaufbau wurde entwickelt, um die lichtinduzierten Prozesse in einer Flüssigkeit mit hoher Auflösung zu beobachten. Die kompetitive Analyse der Bilder erlaubte es uns, die durch den Elektronenstrahl verursachten Schäden von Veränderungen im Zusammenhang mit der photochemischen Reaktion zu unterscheiden. Die Wirkung des Elektronenstrahls auf die empfindliche Probe (in diesem Fall die mit Flüssigkeit verkapselten Zellen) war über den gesamten bestrahlten Bereich sichtbar, da die Elektronen gleichmäßig dur...

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Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Das vorliegende Protokoll beschreibt Modifikationen des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) mit einem Lichtbeleuchtungssystem, die Herstellung flüssiger Zellen und in situ TEM-Beobachtungen von lichtinduzierten Wechselwirkungen zwischen Bakterienzellen und einem Photosensibilisator. Die Probenvorbereitungsmethoden, die Elektronenstrahlschädigung und die Bildgebung werden ebenfalls diskutiert.

Lichtinduzierte In situ Transmissionselektronenmikroskopie zur Beobachtung der Wechselwirkung zwischen flüssiger und weicher Materie

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Das Protokoll stellt dar, wie die Kombination von flüssigem Zell-TEM und Lichtbeleuchtung verwendet werden kann, um die strukturellen Veränderungen in den Bakterien zu beobachten, die mit Photosensibilisator bei Lichtbeleuchtung verkapselt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Einfachheit. Das Protokoll erfordert keine schwierige Probenvorbereitung und bietet eine ausreichende Verkapselung von Bakterien mit Photosensibilisatorlösung.Um zu beginnen, modifizieren Sie das Transmissionselektronenmikroskop, indem Sie die optische Faser mit der Mikroskopsäule an der Oberseite der Objektivlinse verbinden. Lassen Sie einige Zentimeter Platz zwischen der Objektivlinse und der Kondensatorlinse sowie einen freien Schlitz für Zubehör. Platzieren Sie zwei unbehandelte TEM-Gitter, die mit amorphem Kohlenstoff bedeckt sind, zwischen zwei gekreuzten Pinzetten, die der kohlenstoffbeschichteten Seite nach oben zeigen.Halten Sie die Gitter so nah wie möglich am Rand. Legen Sie vier Mikroliter Bakterienlösung auf eines der Gitter. Die optische Dichte der Probe muss im Bereich von fünf bis 10 liegen.Warten Sie 60 Sekunden und tupfen Sie die Flüssigkeit vorsichtig mit Filterpapier ab. Versuchen Sie, die Flüssigkeit während des Prozesses über die gesamte Gitteroberfläche zu verteilen. Legen Sie vier Mikroliter Photosensibilisator auf das gleiche Raster.Nach fünf Sekunden die Flüssigkeit auslöschen. Lassen Sie eine sehr dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Substrat. Legen Sie den trockenen Rost schnell auf den mit Flüssigkeit bedeckten.Bewegen Sie das obere Gitter vorsichtig an den Rand des zweiten und drücken Sie die Substrate an den Rändern mit einer Pinzette zusammen. Wiederholen Sie den Druck vorsichtig. Lassen Sie die flüssige Zelle zwischen der Pinzette für eine Minute.Führen Sie die Probe direkt nach Abschluss der Präparation in den TEM-Halter ein. Nachdem Sie die Probe in das Mikroskop eingeführt haben, starten Sie die Beobachtungen im Modus mit geringer Vergrößerung, um einen geeigneten Beobachtungsbereich zu finden. Halten Sie während der Beobachtungen die Elektronendosis so gering wie möglich.Verlängern Sie die Belichtungszeit. Finden Sie die von Flüssigkeit umgebenen Zellen in der entsprechenden Vergrößerung mit verlängerter Belichtungszeit und nehmen Sie sofort das erste Bild auf. Halten Sie die Elektronendosis konstant und sammeln Sie alle 30 Sekunden Bilder, um die Veränderungen zu beobachten.Untersuchen Sie die Bilder sorgfältig und berechnen Sie die Gesamtelektronendosis, die den ersten sichtbaren Veränderungen in den Zellen entspricht. Stellen Sie vor Beginn des Experiments die Laserlichtintensität ein, indem Sie den aktuellen Wert anpassen. Führen Sie die Probe in das Mikroskop ein und finden Sie den Beobachtungsbereich.Nehmen Sie das erste Bild der Zelle auf, bevor Sie mit der Beleuchtung der Probe beginnen, und verwenden Sie den Strahlblanker, um den Elektronenstrahl auszuschalten, um die Auswirkungen der Elektronenbestrahlung zu vermeiden. Schalten Sie den Laser ein. Beginnen Sie mit einer kurzen Beleuchtungszeit, da das Laserlicht eine relativ hohe Intensität hat.Schalten Sie nach dieser Zeit die Lichtquelle aus. Schalten Sie den Strahlblanker aus und nehmen Sie das Bild sofort auf. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen automatischen Algorithmus, um die Probe nur für die Zeit verfügbar zu machen, die für die Aufnahme des Bildes benötigt wird.Messen Sie sorgfältig die Elektronenbestrahlungszeit, um die Elektronendosis zu berechnen, die für die Bildgebung verwendet wird. Es wird ein bemerkenswerter Abbau der äußeren Zellschicht beobachtet, der durch die reaktiven Sauerstoffspezies verursacht wird, die durch leichtere Strahlung des Photosensibilisators nach einer Minute erzeugt werden. Eine weitere Lichtbeleuchtung machte die Veränderungen sichtbarer.Richtige Beobachtungspunkte mit genügend Flüssigkeit können bei geringer Vergrößerung leicht gefunden werden, da diese Bereiche dunkler und verschwommen erscheinen. Die mit Flüssigkeit bedeckten Bakterien sind weniger sichtbar als die trockenen, können aber dennoch unterschieden werden. Es ist nützlich, die Flüssigkeitsgrenze während der Bildgebung zu betrachten, und ihre Bewegung kann leicht erkannt werden, was bedeutet, dass der gewählte Bereich ungeeignet und instabil sein könnte.Ein weiteres Problem während der Beobachtungen ist die Verdunstung des Wassers und die Ausfällung der Lösung, die in zufälligen Bereichen der Probe auftreten kann, einschließlich der Bereiche um die Bakterien. Die Verkapselung von Bakterien kann auch mit Graphen- und Siliziumnitratmembranen durchgeführt werden. Die Probenvorbereitung ist schwieriger, aber die Stabilität der flüssigen Zelle wird besser sein.Die vorgestellte Methode kann zur Beobachtung von lichtinduzierten Reaktionen an Flüssigkeiten verwendet werden. Zum Beispiel der Einfluss von Licht auf metallische Werkstoffe, lichtinduzierte Katalysatoren und photochemische Reaktionen.

Research

JoVE Journal

Engineering

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Forschung

Ingenieurwesen

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