Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי מענק Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, המרכז הלאומי למדע, פולין).

1. שינוי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
<ol><li>שנה את מיקרוסקופ האלקטרונים המעביר על-ידי חיבור הסיב האופטי (ראו טבלת חומרים) לעמודת המיקרוסקופ בחלק העליון של העדשה האובייקטיבית. אפשר מרווח של כמה סנטימטרים בין העדשה האובייקטיבית לעדשת המעבה, בתוספת חריץ פנוי לאביזרים. הער?...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

ההתקנה וההפעלה של התאורה דורשות ידע בסיסי בשירות ועלולות לפגוע במיקרוסקופ. הדרך הפשוטה ביותר להכניס את האור למיקרוסקופ היא לחבר את הסיב האופטי מהחלק העליון של העדשה האובייקטיבית, שם בדרך כלל יש מקום לסלילי ההטיה של TEM ולגלאים נוספים. ניתן לצפות ליותר מקום פנוי גם ממכשירי כניסה עליונים ישנ...

תופעות הנגרמות על ידי אור ברזולוציה גבוהה מעניינות בתחומים רבים כגון ננו-הנדסה 1,2,3, קטליזה 4,5 וביו-פוטוניקה6. כמה עיצובים מקוריים המאפשרים ניסויים כאלה ניתן למצוא בספרות, כולל שינויים של מחזיקי המדגם 1,4,7,8,9 והסיבים האופטיים המחוברים למיקרוסקופ 10,11.
השילוב של תאורת אור, סביבה נוזלית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מעניק הזדמנות מצוינת למחקרים דינמיים מפורטים של תהליכים המושרים על ידי פוטו. עם זאת, מצב הוואקום הגבוה בתוך המיקרוסקופ הוא שלילי למדי עבור נוזלים רבים, במיוחד פתרונות מים. אנקפסולציה נוזלית, המגנה עליו מפני הסביבה, יכולה להיות מושגת באמצעות כמה טכניקות המבוססות בעיקר על גרפן12, סיליקון ניטריד 13, או מצעי פחמן14. בנוסף למחקר במדע החומרים2, מה שמכונה תאים נוזליים מציעים אפשרויות לביצוע תצפיות מיקרוסקופיות לא קונבנציונליות על דגימות ביולוגיות בקרבת התנאים הטבעיים שלהם15. תצפיות כאלה הן תובעניות ביותר, במיוחד עבור מיקרואורגניזמים חיים כגון תאי חיידקים. קרן האלקטרונים כקרינה מייננת גורמת נזק בלתי הפיך לדגימות הלחות, ולכן יש לציין את מינון האלקטרונים16. זה הכרחי כדי למזער השפעות שליליות, לשלוט על הנזק, ולמנוע ממצאים מבלבלים. מינון האלקטרונים המרבי האופטימלי המאפשר תצפיות על תאים חיים הוא עדיין נושא מפוקפק16, אך נראה כי המינון של 30 e−/nm2 הוא ערך הסף, לפחות עבור חיידקים17.
חלק מהנושאים שמעניינים מחקרים מיקרוסקופיים כאלה הם תהליכים במהלך טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (APDT)18. בקיצור, הטיפול ממשיך כדלקמן. תאי החיידקים מוקפים בנוזל רגיש לאור הנקרא פוטוסנסיטייזר. כאשר תאורת אור ניתנת באורך גל מסוים, מיני החמצן הריאקטיבי הציטוטוקסי (ROS) נוצרים מהעברת אנרגיה או מטען ממולקולות הפוטוסנסיטייזר המעוררות אל החמצן שנמצא באופן טבעי בתמיסה. פתוגנים שנחשפו ל- ROS מושתקים במהירות ביעילות גבוהה מאוד, ללא תופעות לוואי19. התגובה לטיפול משתנה עבור מיקרובים שונים – לדוגמה, ההשפעה של אותו פוטוסנסיטייזר עשויה להיות שונה לגמרי עבור חיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים20. באופן כללי, נקבע כי המטרה העיקרית של ROS היא המבנים החיצוניים של התאים, שם נזק גורם להפרעות תפקודיות של קרום התא, וכתוצאה מכך, להוביל למוות של חיידקים21,22. עם זאת, נזק חומצות גרעין וחלבוניםיכול גם להיחשב גורם של השבתה18, ולכן עדיין לא ידוע אילו מבנים התא הם המטרות העיקריות במהלך תהליך זה19. הבנה מעמיקה יותר של התהליכים המזיקים עשויה לסייע בשיפור הטיפול הסופי הזה. בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיית האור המשמשות במחקר APDT23, טכניקות TEM נותנות אפשרויות רבות יותר להסתכל על מנגנון APDT עם רזולוציה והגדלהגבוהות יותר 24. TEM כבר שימש בהצלחה לתצפית תאים במהלך טיפול מתמשך, מה שאיפשר לנו לחקור חיידקים גראם-חיוביים ולתאר את השינויים המתרחשים בתוך דופן התא בפירוט 6,25.
הפרוטוקול הנוכחי מציג מערך ניסויי מתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה של השבתת חיידקים הנגרמים על ידי אור באמצעות TEM, הדורשת מערכת תאורת אור תקינה, עטיפת תאים עם נוזל ובקרת מינון אלקטרונים קפדנית. החיידק ששימש לתצפית היה סטפילוקוקוס אאורוס, ותמיסת מתילן כחולה שימשה כפוטוסנסיטייזר. מערך תאורת האור המיוחד כולל לייזר מוליך למחצה הניתן לכוונון המחובר ישירות לעמוד המיקרוסקופ באמצעות סיבי האור. תכנון זה מספק הקרנה אחידה לאורך כל הדגימה בגלל המיקום הכמעט מקביל של הסיב האופטי לציר המיקרוסקופ. אור מונוכרומטי בעוצמה גבוהה שנוצר על ידי הלייזר יכול לשמש לאחר מכן כדי לחקור השפעות פוטוכימיות שונות. לאור ששימש בניסוי היה אורך גל השווה ל-660 ננומטר מכיוון שבאזור הנראה, למתילן כחול יש שיאי בליעה ב-613 ננומטר ו-664 ננומטר26. הפרוטוקול לאנקפסולציה נוזלית מבוסס על מצעי פחמן, מה שהופך את ההליך למהיר ולא מסובך. לבסוף, מוצגת שיטה לתצפית במינון נמוך באתרה TEM של תאים בנוזל . נדונים הקשיים לגבי הכנת הדגימה, השפעות מינון האלקטרונים על הדגימה הרגישה ופענוח תמונה סביר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השינויים במערך מיקרוסקופ האלקטרונים (TEM) עבור תצפיות הנגרמות על ידי אור באתרו . סיב אופטי מזכוכית שהוכנס לעמוד האלקטרונים מעל קוטב העדשה האובייקטיבית, ולייזר, מקור אור מתכוונן, שימש לייצור המכשיר. לאחר שהתאורה כוילה באמצעות מערכת מדידה חיצונית, היא מאפשרת להתאים את עוצמת התאורה לצרכי התהליך הנצפה. מערכת תאורה זו נוצלה כדי לדמות תופעות של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי, שהן כיום נושא למחקר אינטנסיבי. הדגימה הוכנה על ידי איתור תרחיף של חיידקים על מצע פחמן, גרפן או סיליקון ניטריד, הכתמת התמיסה העודפת, איתור תמיסת הפוטוסנסיטייזר, הכתמת הנוזל העודף, ולאחר מכן הרכבת התא הנוזלי עם מצע שני או סרט גרפן. תהליך ניסוי ההדמיה עצמו כולל בחירת המקום הנכון לתצפית תוך שימוש בהגדלה נמוכה ומינון מינימלי של אלקטרונים, ולאחר מכן הפעלה מחזורית של מקור האור כדי ללכוד תמונות עוקבות במרווחים מוגדרים עם כמות האלקטרונים המינימלית הדרושה. מינון האלקטרונים של כל חשיפה וזמן ועוצמת התאורה המשמשים צריכים להיות מתועדים בקפידה בשל המורכבות של התופעות הנצפות, שכן יחד עם זאת, התהליך הוא גם מונחה אור וגם אלקטרונים. לאחר ביצוע הניסוי בפועל, יש לבצע תצפיות בקרה נוספות, שבהן נעשה שימוש במינונים זהים של אלקטרונים אך ללא השפעת אור נוספת ומינונים קטנים יותר של אלקטרונים משמשים למינונים גבוהים יותר של אור. זה מאפשר להבחין בין השפעות מיקרו-סטרוקטורליות הנגרמות על ידי אור לבין אלה הנגרמות על ידי אלקטרונים הן בתחומי החיים והן בתחומי מדע החומרים.

מערך הניסוי נועד לצפות בתהליכים הנגרמים על ידי אור המתרחשים בנוזל בעל רזולוציה גבוהה. הניתוח התחרותי של התמונות איפשר לנו להבחין בין הנזק שנגרם על ידי קרן האלקטרונים לבין שינויים הקשורים לתגובה הפוטוכימית. ההשפעה של קרן האלקטרונים על הדגימה הרגישה (במקרה זה, התאים העטופים בנוזל) נראתה בכ?...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינויים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) עם מערכת תאורת אור, ייצור תאים נוזליים, ותצפיות in situ TEM של אינטראקציות הנגרמות על ידי אור בין תאי חיידקים לבין פוטוסנסיטייזר. כמו כן נדונו שיטות הכנת הדגימה, נזק לקרן אלקטרונים והדמיה.

מיקרוסקופיית אלקטרונים המושרה על ידי אור באתרו לתצפית על אינטראקציית החומר הנוזלי-רך

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

הפרוטוקול מציג כיצד ניתן להשתמש בשילוב של TEM של תאים נוזליים ותאורת אור כדי לבחון את השינויים המבניים בחיידקים העטופים בפוטוסנסיטייזר בעת הארת האור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הפשטות שלה. הפרוטוקול אינו דורש הכנת דגימה קשה ומספק אנקפסולציה מספקת של חיידקים עם תמיסת פוטוסנסיטייזר.כדי להתחיל, שנה את מיקרוסקופ האלקטרונים על ידי חיבור הסיב האופטי לעמודת המיקרוסקופ בחלק העליון של העדשה האובייקטיבית. אפשר מרווח של כמה סנטימטרים בין העדשה האובייקטיבית לעדשת המעבה, בתוספת חריץ פנוי לאביזרים. הניחו שתי רשתות TEM לא מטופלות המכוסות בפחמן אמורפי בין שתי פינצטות חצויות, הפונות לצד המצופה פחמן למעלה.החזק את הרשתות קרוב ככל האפשר לקצה. שים ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת חיידקים על אחת הרשתות. הצפיפות האופטית של המדגם חייבת להיות בטווח של 5 עד 10.המתן 60 שניות, והכתים בזהירות את הנוזל באמצעות נייר סינון. נסו לפזר את הנוזל על פני כל משטח הרשת במהלך התהליך. שים ארבעה מיקרוליטרים של פוטוסנסיטייזר על אותה רשת.לאחר חמש שניות, כתם את הנוזל. השאירו שכבה דקה מאוד של נוזל על המצע. הניחו במהירות את הרשת היבשה על גבי זו המכוסה בנוזל.הזיזו בעדינות את הרשת העליונה לקצה הרשת השנייה, וסחטו את המצעים בקצוות באמצעות פינצטה. חזרו בזהירות על הסחיטה. השאירו את התא הנוזלי בין הפינצטה למשך דקה אחת.הכנס את הדגימה למחזיק ה- TEM מיד לאחר סיום ההכנה. לאחר הכנסת הדגימה למיקרוסקופ, התחל את התצפיות במצב הגדלה נמוכה כדי למצוא אזור תצפית מתאים. במהלך התצפיות שומרים על מינון אלקטרונים נמוך ככל האפשר.הרחב את זמן החשיפה. מצא את התאים המוקפים בנוזל בהגדלה המתאימה עם זמן חשיפה ממושך, ולכוד את התמונה הראשונה באופן מיידי. הקפידו על מינון אלקטרונים קבוע, ואספו תמונות כל 30 שניות כדי לצפות בשינויים.בחן היטב את התמונות וחשב את מינון האלקטרונים הכולל המתאים לשינויים הגלויים הראשונים בתאים. לפני תחילת הניסוי, הגדר את עוצמת אור הלייזר על ידי התאמת הערך הנוכחי. הכנס את הדגימה למיקרוסקופ ומצא את אזור התצפית.צלם את התמונה הראשונה של התא לפני תחילת ההארה של הדגימה, והשתמש בבלנקר הקרן כדי לכבות את קרן האלקטרונים כדי למנוע את ההשפעות של הקרנת אלקטרונים. הפעל את הלייזר. התחל עם זמן הארה קצר, שכן אור הלייזר הוא בעל עוצמה גבוהה יחסית.לאחר מכן, כבה את מקור האור. כבה את הקורה הריקה ולכוד את התמונה באופן מיידי. במידת האפשר, השתמש באלגוריתם אוטומטי כדי לחשוף את הדגימה רק למשך הזמן הדרוש לצילום התמונה.מדוד בזהירות את זמן הקרנת האלקטרונים כדי לחשב את מינון האלקטרונים המשמש להדמיה. נצפתה השפלה ניכרת של השכבה החיצונית של התא הנגרמת על ידי מיני החמצן הריאקטיבי שנוצר על ידי קרינה קלה יותר של הפוטוסנסיטייזר לאחר דקה אחת. תאורת אור נוספת הפכה את השינויים לגלויים יותר.נקודות תצפית נאותות עם מספיק נוזלים ניתן למצוא בקלות בהגדלה נמוכה, שכן אזורים אלה נראים כהים ומטושטשים יותר. החיידקים המכוסים בנוזל נראים פחות מהחיידקים היבשים, אך עדיין ניתן להבחין ביניהם. כדאי להסתכל על הגבול הנוזלי במהלך ההדמיה, וניתן לזהות את תנועתו בקלות, מה שמרמז על כך שהאזור הנבחר עשוי להיות לא מתאים ולא יציב.בעיה נוספת במהלך התצפיות היא אידוי המים ומשקעים של התמיסה שיכולים להתרחש באזורים אקראיים של הדגימה, כולל האזורים המקיפים את החיידקים. אנקפסולציה של חיידקים יכולה להתבצע גם באמצעות גרפן וממברנות סיליקון חנקתי. הכנת המדגם קשה יותר, אך יציבות התא הנוזלי תהיה טובה יותר.השיטה המוצגת יכולה לשמש לתצפיות של תגובות המושרות על ידי אור על נוזל. לדוגמה, השפעת האור על חומרים מתכתיים, זרזים הנגרמים על ידי אור ותגובות פוטוכימיות.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

חושף תהליכים דינמיים של חומרים בנוזלים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים סלולריים נוזלי

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

בפילוח של טרנספורמטור Situ זמן תלוי בהילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים: אפשרות להבין את מנגנון הכשל בהתקני מייקרו-אלקטרוניים

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

לימוד תהליכים דינמיים של אובייקטים בגודל ננו בנוזל באמצעות מיקרוסקופי אלקטרוני סריקת הילוכים

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

אפיון של אולטרה-קפדניים Nanocrystalline חומרים באמצעות דיפרקציה הילוכים קיקוצ&#39;י

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

מעבר אוריינטלי בקריסטל נוזלי המופעל על ידי הצמיחה התרמודינמית של גליונות הרטבה אינטרפסיאליים

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

כל-אלקטרונית ננו-נפתרה סריקה מינהור מיקרוסקופיה: הקלת החקירה של דינמיקה תשלום יחיד Dopant

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

שיטות של באתרו לשעבר בחיי עיר חקירות של המרות מבניים: המקרה של התגבשות של משקפיים מתכתי

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

חד-ספרתיות ננומטר ליתוגרפיה קרינה עם תיקון סטייה סריקה הילוכים מיקרוסקופ אלקטרוני

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...