Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
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La ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polonia).

1. Modifica del microscopio elettronico a trasmissione
<ol><li>Modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori. NOTA: È possibile utilizzare anche un portacampioni dedicato4 o un su...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

L'installazione e la messa in servizio dell'illuminatore richiedono conoscenze di base e possono danneggiare il microscopio. Il modo più semplice per introdurre la luce al microscopio è collegare la fibra ottica dalla parte superiore della lente dell'obiettivo, dove di solito c'è spazio per le bobine di deflessione TEM e rilevatori aggiuntivi. Ci si può aspettare più spazio libero anche dai vecchi dispositivi top-entry, dove la stessa posizione ospita il blocco a vuoto del campione e il meccanismo di installazione d...

I fenomeni indotti dalla luce in alta risoluzione sono interessanti in molti campi come la nanoingegneria 1,2,3, la catalisi 4,5 e la biofotonica 6. Alcuni disegni originali che consentono tali esperimenti possono essere trovati in letteratura, comprese le modifiche dei supporti del campione 1,4,7,8,9 e la fibra ottica attaccata al microscopio 10,11.
La combinazione di illuminazione luminosa, ambiente liquido e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) offre una grande opportunità per studi dettagliati e dinamici dei processi fotoindotti. Tuttavia, la condizione di alto vuoto all'interno del microscopio è piuttosto sfavorevole per molti liquidi, in particolare le soluzioni acquose. L'incapsulamento liquido, che lo protegge dall'ambiente, può essere ottenuto utilizzando alcune tecniche basate principalmente su substrati di grafene 12, nitruro di silicio13 o carbonio14. Oltre alla ricerca nella scienza dei materiali2, le cosiddette cellule liquide offrono la possibilità di condurre osservazioni microscopiche non convenzionali su campioni biologici vicini alle loro condizioni native15. Tali osservazioni sono estremamente impegnative, specialmente per i microrganismi viventi come le cellule batteriche. Il fascio di elettroni come radiazione ionizzante provoca danni irreversibili ai campioni idratati, quindi la dose di elettroni deve essere specificata16. Ciò è necessario per ridurre al minimo gli effetti sfavorevoli, controllare il danno ed evitare artefatti confusi. La dose massima ottimale di elettroni che consente l'osservazione delle cellule viventi è ancora un argomento discutibile16, ma la dose di 30 e−/nm2 sembra essere il valore soglia, almeno per i batteri17.
Alcuni dei soggetti di interesse per tali studi microscopici sono i processi durante la terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)18. In breve, la terapia procede come segue. Le cellule batteriche sono circondate dal liquido fotosensibile chiamato fotosensibilizzatore. Quando l'illuminazione della luce viene fornita a una lunghezza d'onda specifica, le specie citotossiche reattive dell'ossigeno (ROS) vengono generate dal trasferimento di energia o carica dalle molecole fotosensibilizzatrici eccitate all'ossigeno naturalmente presente nella soluzione. Gli agenti patogeni esposti ai ROS vengono rapidamente inattivati con un'efficienza molto elevata, senza effetti collaterali19. La risposta alla terapia varia per microbi distinti - ad esempio, l'impatto dello stesso fotosensibilizzatore può essere molto diverso per i batteri Gram-positivi e Gram-negativi20. In generale, è stato stabilito che il bersaglio principale dei ROS sono le strutture esterne delle cellule, dove il danno provoca disturbi funzionali della membrana cellulare e, di conseguenza, porta alla morte dei batteri21,22. Tuttavia, anche il danno agli acidi nucleici e alle proteine può essere considerato una causa di inattivazione18, quindi non è ancora noto quali strutture cellulari siano i principali bersagli durante questo processo19. Una comprensione più profonda dei processi dannosi potrebbe aiutare a migliorare questa terapia definitiva. Rispetto ai metodi di microscopia ottica utilizzati nella ricerca APDT23, le tecniche TEM offrono maggiori possibilità di osservare il meccanismo APDT con risoluzione e ingrandimento più elevati24. TEM è già stato utilizzato con successo per l'osservazione cellulare durante la terapia in corso, che ci ha permesso di studiare il danno batterico Gram-positivo e descrivere i cambiamenti che si verificano all'interno della parete cellulare in dettaglio 6,25.
L'attuale protocollo presenta una configurazione sperimentale adatta per l'imaging ad alta risoluzione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce utilizzando TEM, che richiede un adeguato sistema di illuminazione della luce, l'incapsulamento delle cellule con un liquido e un rigoroso controllo della dose di elettroni. Il batterio utilizzato per l'osservazione era Staphylococcus aureus e una soluzione di blu di metilene è stata utilizzata come fotosensibilizzante. La speciale configurazione di illuminazione della luce comprende un laser a semiconduttore sintonizzabile collegato direttamente alla colonna del microscopio utilizzando la fibra luminosa. Questo design fornisce un'irradiazione uniforme in tutto il campione a causa del posizionamento quasi parallelo della fibra ottica all'asse del microscopio. La luce monocromatica di alta intensità generata dal laser può quindi essere utilizzata per studiare vari effetti fotochimici. La luce utilizzata nell'esperimento aveva una lunghezza d'onda pari a 660 nm perché, nella regione visibile, il blu di metilene ha picchi di assorbimento a 613 nm e 664 nm26. Il protocollo per l'incapsulamento liquido si basa su substrati di carbonio, il che rende la procedura rapida e senza complicazioni. Infine, viene presentato un metodo per l'osservazione TEM in situ a basse dosi di cellule in liquido. Vengono discusse le difficoltà relative alla preparazione del campione, agli effetti della dose di elettroni sul campione sensibile e alla ragionevole interpretazione delle immagini.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

L'attuale protocollo descrive le modifiche della configurazione del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per le osservazioni indotte dalla luce in situ . Una fibra ottica di vetro inserita nella colonna di elettroni sopra il polo dell'obiettivo e un laser, una sorgente luminosa regolabile, sono stati utilizzati per fabbricare il dispositivo. Dopo che l'illuminatore è stato calibrato utilizzando un sistema di misurazione esterno, consente di regolare l'intensità dell'illuminazione alle esigenze del processo osservato. Questo sistema di illuminazione è stato utilizzato per visualizzare fenomeni di terapia fotodinamica antimicrobica, attualmente oggetto di intense ricerche. Il campione è stato preparato individuando una sospensione di batteri su un substrato di carbonio, grafene o nitruro di silicio, tamponando la soluzione in eccesso, individuando la soluzione fotosensibilizzante, tamponando nuovamente il liquido in eccesso e quindi assemblando la cella liquida con un secondo substrato o film di grafene. Il processo dell'esperimento di imaging stesso include la scelta del posto giusto per l'osservazione con l'uso di un basso ingrandimento e una dose minima di elettroni, e quindi l'attivazione ciclica della sorgente luminosa per catturare immagini successive a intervalli specificati con la minima quantità di elettroni necessari. La dose elettronica di ciascuna esposizione e il tempo e l'intensità dell'illuminazione utilizzati devono essere accuratamente registrati a causa della complessità dei fenomeni osservati poiché, allo stesso tempo, il processo è guidato sia dalla luce che dall'elettrone. Dopo aver eseguito l'esperimento effettivo, devono essere fatte ulteriori osservazioni di controllo, in cui vengono utilizzate le stesse dosi di elettroni ma senza ulteriore influenza della luce e dosi più piccole di elettroni vengono utilizzate per dosi più elevate di luce. Ciò consente di distinguere gli effetti microstrutturali indotti dalla luce da quelli causati dagli elettroni sia nel campo della vita che nella scienza dei materiali.

La configurazione sperimentale è stata progettata per osservare i processi indotti dalla luce che si verificano in un liquido ad alta risoluzione. L'analisi competitiva delle immagini ha permesso di distinguere i danni causati dal fascio di elettroni dai cambiamenti legati alla reazione fotochimica. L'effetto del fascio di elettroni sul campione sensibile (in questo caso, le cellule incapsulate con liquido) era visibile in tutta l'area irradiata mentre gli elettroni penetravano uniformemente attraverso di essa. Naturalm...

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Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l'imaging.

Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Il protocollo presenta come la combinazione di TEM a celle liquide e illuminazione della luce può essere utilizzata per osservare i cambiamenti strutturali nei batteri incapsulati con fotosensibilizzatore su illuminazione della luce. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità. Il protocollo non richiede una difficile preparazione del campione e fornisce un incapsulamento sufficiente dei batteri con soluzione fotosensibilizzante.Per iniziare, modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori. Posizionare due griglie TEM non trattate ricoperte di carbonio amorfo tra due pinzette incrociate, rivolte verso l'alto verso l'alto.Tenere le griglie il più vicino possibile al bordo. Metti quattro microlitri di soluzione batterica su una delle griglie. La densità ottica del campione deve essere compresa tra cinque e 10.Attendere 60 secondi e asciugare accuratamente il liquido con carta da filtro. Cerca di distribuire il liquido su tutta la superficie della griglia durante il processo. Metti quattro microlitri di fotosensibilizzatore sulla stessa griglia.Dopo cinque secondi, asciugare il liquido. Lasciare uno strato molto sottile di liquido sul substrato. Posizionare rapidamente la griglia asciutta sopra quella coperta di liquido.Spostare delicatamente la griglia superiore sul bordo della seconda e spremere i substrati ai bordi usando una pinzetta. Ripetere attentamente la compressione. Lasciare la cellula liquida tra le pinzette per un minuto.Inserire il campione nel supporto TEM subito dopo aver terminato la preparazione. Dopo aver inserito il campione nel microscopio, avviare le osservazioni in modalità a basso ingrandimento per trovare un'area di osservazione adatta. Durante le osservazioni mantenere la dose di elettroni più bassa possibile.Espandi il tempo di esposizione. Trova le celle circondate da liquido all'ingrandimento appropriato con un tempo di esposizione prolungato e cattura immediatamente la prima immagine. Mantieni costante la dose di elettroni e raccogli immagini ogni 30 secondi per osservare i cambiamenti.Esaminare attentamente le immagini e calcolare la dose totale di elettroni che corrisponde ai primi cambiamenti visibili nelle cellule. Prima di iniziare l'esperimento, impostare l'intensità della luce laser regolando il valore corrente. Inserire il campione nel microscopio e trovare l'area di osservazione.Acquisire la prima immagine della cella prima di iniziare l'illuminazione del campione e utilizzare il beam blanker per spegnere il fascio di elettroni per evitare gli effetti dell'irradiazione elettronica. Accendi il laser. Inizia con un breve tempo di illuminazione, poiché la luce laser ha un'intensità relativamente elevata.Dopo quel tempo, spegnere la fonte di luce. Disattiva il beam blanker e acquisisci immediatamente l'immagine. Se possibile, utilizzare un algoritmo automatico per esporre il campione solo per il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine.Misurare attentamente il tempo di irradiazione elettronica per calcolare la dose di elettroni utilizzata per l'imaging. Si osserva una notevole degradazione dello strato esterno della cellula causata dalle specie reattive dell'ossigeno generate dalla radiazione più leggera del fotosensibilizzatore dopo un minuto. Un'ulteriore illuminazione luminosa ha reso i cambiamenti più visibili.Punti di osservazione adeguati con abbastanza liquido possono essere facilmente trovati a basso ingrandimento, poiché queste aree appaiono più scure e sfocate. I batteri coperti di liquido sono meno visibili di quelli secchi, ma possono ancora essere distinti. È utile osservare il confine del liquido durante l'imaging e il suo movimento può essere facilmente rilevato, il che implica che l'area scelta potrebbe essere inadatta e instabile.Un altro problema durante le osservazioni è l'evaporazione dell'acqua e la precipitazione della soluzione che può verificarsi in aree casuali del campione, comprese le aree circostanti i batteri. L'incapsulamento dei batteri può essere eseguito anche utilizzando membrane di grafene e nitrato di silicio. La preparazione del campione è più difficile, ma la stabilità della cella liquida sarà migliore.Il metodo presentato può essere utilizzato per osservazioni di reazioni indotte dalla luce su liquido. Ad esempio, l'influenza della luce su materiali metallici, catalizzatori indotti dalla luce e reazioni fotochimiche.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Rivelare processi dinamici dei materiali in liquidi con liquido di trasmissione microscopia elettronica cellulare

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

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Ingegneria

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