Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Forskningen ble støttet av Miniatura-stipendet (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

1. Transmisjonselektronmikroskopmodifisering
<ol><li>Endre transmisjonselektronmikroskopet ved å koble den optiske fiberen (se materialtabellen) til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillat noen få centimeter mellomrom mellom objektivlinsen og kondensatorlinsen, pluss et gratis spor for tilbehør. MERK: En dedikert prøveholder4 eller en holder for katodoluminescerende observasjoner i omvendt konfigurasjon1 kan også bruk...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

Installasjon og igangkjøring av belysningen krever grunnleggende servicekunnskap og kan skade mikroskopet. Den enkleste måten å introdusere lyset til mikroskopet er å koble den optiske fiberen fra toppen av objektivlinsen, der det vanligvis er plass til TEM-avbøyningsspolene og ekstra detektorer. Mer ledig plass kan også forventes fra eldre toppinngangsenheter, der samme sted huser prøvevakuumlåsen og prøveinstallasjonsmekanismen. Denne konfigurasjonen er mye beskrevet i en tidligere rapport25<...

Lysinduserte fenomener i høy oppløsning er interessante på mange felt som nanoengineering 1,2,3, katalyse 4,5 og biofotonikk6. Noen originale design som tillater slike eksperimenter, finnes i litteraturen, inkludert modifikasjoner av prøveholderne 1,4,7,8,9 og den optiske fiberen festet til mikroskopet 10,11.
Kombinasjonen av lysbelysning, et flytende miljø og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) gir en flott mulighet for detaljerte, dynamiske studier av fotoinduserte prosesser. Imidlertid er høyvakuumtilstanden inne i mikroskopet ganske ugunstig for mange væsker, spesielt vannløsninger. Flytende innkapsling, som beskytter den mot miljøet, kan oppnås ved hjelp av noen få teknikker basert hovedsakelig på grafen12, silisiumnitrid13 eller karbon14 substrater. I tillegg til forskning innen materialvitenskap2, gir såkalte flytende celler muligheter for å gjennomføre ukonvensjonelle mikroskopiske observasjoner på biologiske prøver nær deres opprinnelige forhold15. Slike observasjoner er ekstremt krevende, spesielt for levende mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som ioniserende stråling forårsaker irreversibel skade på de hydrerte prøvene, så elektrondosen må spesifiseres16. Dette er nødvendig for å minimere ugunstige effekter, kontrollere skaden og unngå forvirrende gjenstander. Den optimale maksimale elektrondosen som tillater observasjoner av levende celler er fortsatt et tvilsomt tema16, men dosen på 30 e−/nm2 ser ut til å være grenseverdien, i hvert fall for bakterier17.
Noen av fagene av interesse for slike mikroskopiske studier er prosesser under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt, terapien fortsetter som følger. Bakteriecellene er omgitt av den lysfølsomme væsken kalt fotosensibilisator. Når lysbelysning gis ved en bestemt bølgelengde, genereres de cytotoksiske reaktive oksygenartene (ROS) fra energi eller ladningsoverføring fra de eksiterte fotosensibilisatormolekylene til oksygenet som er naturlig tilstede i løsningen. Patogener utsatt for ROS blir raskt inaktivert med svært høy effektivitet, uten bivirkninger19. Responsen på terapien varierer for forskjellige mikrober - for eksempel kan virkningen av samme fotosensibilisator være ganske forskjellig for Gram-positive og Gram-negative bakterier20. Generelt har det blitt fastslått at hovedmålet for ROS er de ytre strukturer av celler, hvor skade resulterer i funksjonsforstyrrelser i cellemembranen og dermed fører til bakteriedød21,22. Imidlertid kan skade på nukleinsyrer og proteiner også betraktes som en årsak til inaktivering18, så det er fortsatt ukjent hvilke cellestrukturer som er hovedmålene under denne prosessen19. En dypere forståelse av de skadelige prosessene kan bidra til å forbedre denne definitive terapien. Sammenlignet med lysmikroskopimetodene som brukes i APDT-forskning23, gir TEM-teknikker flere muligheter til å se på APDT-mekanismen med høyere oppløsning og forstørrelse24. TEM har allerede blitt brukt til celleobservasjon under pågående behandling, noe som tillot oss å studere Gram-positive bakterieskader og beskrive endringene som forekommer i celleveggen i detalj 6,25.
Den nåværende protokollen presenterer et egnet eksperimentelt oppsett for høyoppløselig avbildning av lysindusert bakterieinaktivering ved bruk av TEM, som krever et riktig lysbelysningssystem, innkapsling av celler med væske og streng elektrondosekontroll. Bakteriene som ble brukt til observasjonen var Staphylococcus aureus, og en metylenblå løsning ble brukt som fotosensibilisator. Det spesielle lysbelysningsoppsettet består av en justerbar halvlederlaser koblet direkte til mikroskopkolonnen ved hjelp av lysfiberen. Denne utformingen gir jevn bestråling gjennom hele prøven på grunn av den nesten parallelle plasseringen av den optiske fiberen til mikroskopaksen. Monokromatisk lys med høy intensitet generert av laseren kan deretter brukes til å studere ulike fotokjemiske effekter. Lyset som ble brukt i forsøket hadde en bølgelengde lik 660 nm fordi metylenblått i det synlige området har absorpsjonstopper ved 613 nm og 664 nm26. Protokollen for flytende innkapsling er basert på karbonsubstrater, noe som gjør prosedyren rask og ukomplisert. Til slutt presenteres en metode for lavdose in situ TEM-observasjon av celler i væske. Vanskelighetene med prøvepreparering, elektrondoseeffekter på det følsomme prøven og rimelig bildetolkning diskuteres.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

Den nåværende protokollen beskriver modifikasjonene av transmisjonselektronmikroskopet (TEM) oppsett for in situ lysinduserte observasjoner. Et glass optisk fiber satt inn i elektronkolonnen over objektivlinsens polstykke, og en laser, en justerbar lyskilde, ble brukt til å fremstille enheten. Etter at belysningen er kalibrert ved hjelp av et eksternt målesystem, tillater det en å justere intensiteten av belysningen til behovene til den observerte prosessen. Dette belysningssystemet ble brukt til å avbilde antimikrobielle fotodynamiske terapifenomener, som for tiden er gjenstand for intens forskning. Prøven ble fremstilt ved å oppdage en suspensjon av bakterier på et karbon-, grafen- eller silisiumnitridsubstrat, blotting av overflødig løsning, spotting av fotosensibiliseringsløsningen, blotting av overflødig væske igjen og deretter montering av væskecellen med et andre substrat eller grafenfilm. Prosessen med selve bildeeksperimentet inkluderer å velge riktig sted for observasjon ved bruk av lav forstørrelse og en minimumsdose elektroner, og deretter syklisk aktivering av lyskilden for å ta påfølgende bilder med angitte intervaller med den minste mengden elektroner som er nødvendig. Elektrondosen av hver eksponering og tiden og intensiteten av belysningen som brukes, må registreres nøye på grunn av kompleksiteten til de observerte fenomenene, samtidig som prosessen er både lys- og elektrondrevet. Etter at selve eksperimentet er utført, må det gjøres ytterligere kontrollobservasjoner, der de samme dosene elektroner brukes, men uten ekstra lyspåvirkning og mindre doser elektroner brukes til høyere doser lys. Dette gjør det mulig å skille lysinduserte mikrostrukturelle effekter fra de som er forårsaket av elektroner innen både livs- og materialvitenskap.

Det eksperimentelle oppsettet ble designet for å observere de lysinduserte prosessene som forekommer i en væske med høy oppløsning. Konkurranseanalysen av bildene tillot oss å skille skaden forårsaket av elektronstrålen fra endringer relatert til den fotokjemiske reaksjonen. Effekten av elektronstrålen på den følsomme prøven (i dette tilfellet cellene innkapslet med væske) var synlig over hele det bestrålte området da elektronene trengte jevnt gjennom det. Selvfølgelig avhenger effekten av elektrondosen, s...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Denne protokollen beskriver transmisjonselektronmikroskop (TEM) modifikasjoner med et lysbelysningssystem, fabrikasjon av flytende celler og in situ TEM-observasjoner av lysinduserte interaksjoner mellom bakterieceller og en fotosensibilisator. Prøveprepareringsmetodene, elektronstråleskader og avbildning diskuteres også.

Lysindusert in situ transmisjonselektronmikroskopi for observasjon av interaksjonen mellom væske og myk materie

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Protokollen presenterer hvordan kombinasjonen av flytende celle TEM og lysbelysning kan brukes til å observere de strukturelle endringene i bakteriene innkapslet med fotosensibilisator ved lysbelysning. Den største fordelen med denne teknikken er dens enkelhet. Protokollen krever ikke vanskelig prøvepreparering og gir tilstrekkelig innkapsling av bakterier med fotosensibiliseringsløsning.For å begynne, modifiser transmisjonselektronmikroskopet ved å koble den optiske fiberen til mikroskopkolonnen øverst på objektivlinsen. Tillat noen få centimeter mellomrom mellom objektivlinsen og kondensatorlinsen, pluss et gratis spor for tilbehør. Plasser to ubehandlede TEM-rister dekket med amorft karbon mellom to kryssede pinsett, vendt mot den karbonbelagte siden til toppen.Hold rutenettene så nær kanten som mulig. Sett fire mikroliter bakterieoppløsning på et av rutenettene. Den optiske tettheten til prøven må ligge i området fem til 10.Vent i 60 sekunder, og fjern væsken forsiktig ved hjelp av filterpapir. Prøv å spre væsken gjennom hele rutenettoverflaten under prosessen. Sett fire mikroliter fotosensibilisator på samme rutenett.Etter fem sekunder, fjern væsken. La et veldig tynt lag væske ligge på underlaget. Plasser raskt det tørre rutenettet på toppen av det som er dekket med væske.Flytt forsiktig det øvre rutenettet til kanten av den andre, og klem underlagene i kantene ved hjelp av pinsett. Gjenta klemmen forsiktig. La væskecellen ligge mellom pinsetten i ett minutt.Sett prøven inn i TEM-holderen rett etter at tilberedningen er fullført. Etter å ha satt prøven inn i mikroskopet, start observasjonene i lav forstørrelsesmodus for å finne et passende observasjonsområde. Under observasjonene holder elektrondosen så lav som mulig.Utvid eksponeringstiden. Finn cellene omgitt av væske ved riktig forstørrelse med utvidet eksponeringstid, og ta det første bildet umiddelbart. Hold elektrondosen konstant, og samle bilder hvert 30. sekund for å observere endringene.Undersøk bildene nøye og beregn den totale elektrondosen som tilsvarer de første synlige endringene i cellene. Før du starter eksperimentet, still inn laserlysintensiteten ved å justere gjeldende verdi. Sett prøven inn i mikroskopet og finn observasjonsområdet.Ta det første bildet av cellen før du starter belysningen av prøven, og bruk stråleblankeren til å slå av elektronstrålen for å unngå effekten av elektronbestråling. Slå på laseren. Start med kort belysningstid, da laserlyset har relativt høy intensitet.Etter den tiden, slå av lyskilden. Slå av strålen blankere, og ta bildet umiddelbart. Hvis mulig, bruk en automatisk algoritme for å eksponere prøven bare i den tiden som trengs for å ta bildet.Mål nøye elektronbestrålingstiden for å beregne elektrondosen som brukes til avbildning. En bemerkelsesverdig nedbrytning av det ytre laget av cellen forårsaket av den reaktive oksygenarten generert av lettere stråling av fotosensibilisatoren etter ett minutt observeres. Ytterligere lysbelysning gjorde endringene mer synlige.Riktige observasjonspunkter med nok væske kan lett bli funnet ved lav forstørrelse, da disse områdene virker mørkere og uskarpe. De væskedekkede bakteriene er mindre synlige enn de tørre, men kan fortsatt skilles. Det er nyttig å se på væskegrensen under avbildningen, og bevegelsen kan lett oppdages, noe som innebærer at det valgte området kan være uegnet og ustabilt.Et annet problem under observasjoner er fordampning av vannet og utfelling av løsningen som kan oppstå i tilfeldige områder av prøven, inkludert områdene rundt bakteriene. Innkapsling av bakterier kan også utføres ved bruk av grafen og silisiumnitratmembraner. Prøveprepareringen er vanskeligere, men stabiliteten til væskecellen vil bli bedre.Den presenterte metoden kan brukes til observasjoner av lysinduserte reaksjoner på væske. For eksempel påvirkning av lys på metallmaterialer, lysinduserte katalysatorer og fotokjemiske reaksjoner.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Avslører dynamiske prosesser av materialer i væsker med flytende Cell transmisjonselektronmikroskopi

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Tidsavhengig Dielektrisk Sammenbrudd i transmisjonselektronmikroskop: En Mulighet til å forstå feilmekanisme i Mikro Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Studerer dynamiske prosesser av Nano store objekter i flytende ved hjelp av skanning transmisjonselektronmikroskopi

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

Karakterisering av Ultra-finkornet og nanocrystalline materialer Bruke Sende Kikuchi Diffraksjon

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

Orienteringsovergang i en flytende krystall utløst av den termodynamiske veksten av grensesnittet

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

En metode for å få føljetong Ultrathin deler av mikroorganismer i overføring elektronmikroskop

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

All-elektronisk nanosekund-løst skanning tunnelering mikroskopi: Tilrettelegge etterforskningen av enkelt Dopant kostnad Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Ex-Situ og In Situ undersøkelser av strukturelle transformasjoner: tilfelle av krystallisering av metallisk briller

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Ett siffer Nanometer elektronstråle Litografi med et avvik-korrigert skanning Transmission elektron mikroskop

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Mikroskopi med biasing og fabrikasjon av asymmetriske tverrligger basert på blandet faset a-VOx