Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
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A pesquisa foi apoiada pela bolsa Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Centro Nacional de Ciências, Polônia).

1. Modificação do microscópio eletrônico de transmissão
<ol><li>Modifique o microscópio eletrônico de transmissão conectando a fibra óptica (consulte Tabela de materiais) à coluna do microscópio na parte superior da lente objetiva. Permita alguns centímetros de espaço entre a lente objetiva e a lente condensadora, além de um slot livre para acessórios. NOTA: Um suporte de amostra dedicado4 ou um suporte para observações catodoluminescentes em...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

A instalação e o comissionamento do iluminador exigem conhecimento básico de serviço e podem danificar o microscópio. A maneira mais simples de introduzir a luz no microscópio é conectar a fibra óptica a partir do topo da lente objetiva, onde geralmente há espaço para as bobinas de deflexão TEM e detectores adicionais. Mais espaço livre também pode ser esperado de dispositivos de entrada superior mais antigos, onde o mesmo local abriga a trava de vácuo da amostra e o mecanismo de instalação da amostra. Es...

Fenômenos induzidos pela luz em alta resolução são interessantes em muitos campos, como nanoengenharia 1,2,3, catálise 4,5 e biofotônica6. Alguns desenhos originais que permitem tais experimentos podem ser encontrados na literatura, incluindo modificações dos suportes amostrais 1,4,7,8,9 e da fibra óptica acoplada ao microscópio 10,11.
A combinação de iluminação de luz, um ambiente líquido e microscopia eletrônica de transmissão (MET) oferece uma grande oportunidade para estudos detalhados e dinâmicos de processos fotoinduzidos. No entanto, a condição de alto vácuo dentro do microscópio é bastante desfavorável para muitos líquidos, especialmente soluções de água. O encapsulamento líquido, que o protege do meio ambiente, pode ser alcançado usando algumas técnicas baseadas principalmente em substratos de grafeno 12, nitreto de silício13 ou carbono14. Além das pesquisas em ciência dos materiais2, as chamadas células líquidas oferecem possibilidades para a realização de observações microscópicas não convencionais em espécimes biológicos próximos às suas condições nativas15. Tais observações são extremamente exigentes, especialmente para microrganismos vivos, como células bacterianas. O feixe de elétrons como radiação ionizante causa danos irreversíveis aos corpos de prova hidratados, de modo que a dose de elétrons deve ser especificada16. Isso é necessário para minimizar os efeitos desfavoráveis, controlar os danos e evitar artefatos confusos. A dose máxima ideal de elétrons que permite observações de células vivas ainda é um tópico questionável16, mas a dose de 30 e−/nm2 parece ser o valor limiar, pelo menos para as bactérias17.
Alguns dos assuntos de interesse para tais estudos microscópicos são processos durante a terapia fotodinâmica antimicrobiana (TAPA)18. Em suma, a terapia prossegue da seguinte forma. As células bacterianas são cercadas pelo líquido fotossensível chamado fotossensibilizador. Quando a iluminação da luz é dada em um comprimento de onda específico, as espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS) são geradas a partir da transferência de energia ou carga das moléculas fotossensibilizadoras excitadas para o oxigênio naturalmente presente na solução. Patógenos expostos a ERO são rapidamente inativados com altíssima eficiência, sem efeitos colaterais19. A resposta à terapia varia para micróbios distintos – por exemplo, o impacto do mesmo fotossensibilizador pode ser bastante diferente para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas20. Em geral, estabeleceu-se que o principal alvo das ERO são as estruturas externas das células, onde o dano resulta em distúrbios funcionais da membrana celular e, consequentemente, leva à morte de bactérias21,22. No entanto, danos aos ácidos nucleicos e proteínas também podem ser considerados uma causa de inativação18, por isso ainda não se sabe quais estruturas celulares são os principais alvos durante esse processo19. Uma compreensão mais profunda dos processos prejudiciais poderia ajudar a melhorar esta terapia definitiva. Em comparação com os métodos de microscopia de luz utilizados na pesquisa de APDT23, as técnicas de MET dão mais possibilidades de olhar para o mecanismo de APDT com maior resolução e ampliação24. O ETEM já foi utilizado com sucesso para observação celular durante a terapia em curso, o que nos permitiu estudar os danos bacterianos Gram-positivos e descrever detalhadamente as alterações ocorridas dentro da parede celular 6,25.
O protocolo atual apresenta uma configuração experimental adequada para imagens de alta resolução de inativação de bactérias induzidas por luz usando TEM, que requer um sistema adequado de iluminação de luz, o encapsulamento de células com um líquido e um rigoroso controle de dose de elétrons. A bactéria utilizada para a observação foi Staphylococcus aureus, e uma solução de azul de metileno foi utilizada como fotossensibilizador. A configuração especial de iluminação de luz compreende um laser semicondutor ajustável conectado diretamente à coluna do microscópio usando a fibra de luz. Este projeto fornece irradiação uniforme em toda a amostra devido à colocação quase paralela da fibra óptica ao eixo do microscópio. A luz monocromática de alta intensidade gerada pelo laser pode então ser usada para estudar vários efeitos fotoquímicos. A luz utilizada no experimento apresentou comprimento de onda igual a 660 nm, pois, na região visível, o azul de metileno apresenta picos de absorção de 613 nm e 664 nm26. O protocolo para encapsulamento de líquidos é baseado em substratos de carbono, o que torna o procedimento rápido e descomplicado. Finalmente, um método para observação de TEM in situ de baixa dose de células em líquido é apresentado. As dificuldades em relação à preparação da amostra, os efeitos da dose de elétrons sobre a amostra sensível e a interpretação razoável da imagem são discutidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

O protocolo atual descreve as modificações da configuração do microscópio eletrônico de transmissão (MET) para observações induzidas pela luz in situ . Uma fibra óptica de vidro inserida na coluna de elétrons acima do polo da lente objetiva e um laser, uma fonte de luz ajustável, foram usados para fabricar o dispositivo. Depois que o iluminador foi calibrado usando um sistema de medição externo, ele permite ajustar a intensidade da iluminação às necessidades do processo observado. Este sistema de iluminação foi utilizado para visualizar fenômenos de terapia fotodinâmica antimicrobiana, que atualmente são objeto de intensa pesquisa. A amostra foi preparada detectando uma suspensão de bactérias em um substrato de carbono, grafeno ou nitreto de silício, borrando o excesso de solução, detectando a solução fotossensibilizadora, borrando o excesso de líquido novamente e, em seguida, montando a célula líquida com um segundo substrato ou filme de grafeno. O processo do experimento de imagem em si inclui a escolha do local certo para a observação com o uso de baixa ampliação e uma dose mínima de elétrons e, em seguida, a ativação cíclica da fonte de luz para capturar imagens subsequentes em intervalos especificados com a quantidade mínima de elétrons necessária. A dose de elétrons de cada exposição e o tempo e a intensidade da iluminação usada precisam ser cuidadosamente registrados devido à complexidade dos fenômenos observados, pois, ao mesmo tempo, o processo é impulsionado pela luz e pelo elétron. Depois que o experimento real é realizado, observações de controle adicionais devem ser feitas, nas quais as mesmas doses de elétrons são usadas, mas sem influência adicional da luz e doses menores de elétrons são usadas para doses mais altas de luz. Isso torna possível distinguir os efeitos microestruturais induzidos pela luz daqueles causados por elétrons nos campos da vida e da ciência dos materiais.

A configuração experimental foi projetada para observar os processos induzidos pela luz que ocorrem em um líquido com alta resolução. A análise competitiva das imagens permitiu distinguir os danos causados pelo feixe de elétrons das mudanças relacionadas à reação fotoquímica. O efeito do feixe de elétrons sobre a amostra sensível (neste caso, as células encapsuladas com líquido) foi visível em toda a área irradiada à medida que os elétrons penetravam através dela uniformemente. Naturalmente, o efeito...

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Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

O presente protocolo descreve modificações do microscópio eletrônico de transmissão (MET) com um sistema de iluminação de luz, a fabricação de células líquidas e observações in situ de TEM de interações induzidas pela luz entre células bacterianas e um fotossensibilizador. Os métodos de preparação da amostra, os danos causados pelo feixe de elétrons e as imagens também são discutidos.

Microscopia Eletrônica de Transmissão In Situ Induzida pela Luz para Observação da Interação Matéria-Líquido Mole

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

O protocolo apresenta como a combinação de MET de células líquidas e iluminação luminosa pode ser usada para observar as mudanças estruturais nas bactérias encapsuladas com fotossensibilizador sobre a iluminação luminosa. A principal vantagem desta técnica é a sua simplicidade. O protocolo não requer preparação difícil da amostra e fornece encapsulamento suficiente de bactérias com solução fotossensibilizadora.Para começar, modifique o microscópio eletrônico de transmissão conectando a fibra óptica à coluna do microscópio na parte superior da lente objetiva. Permita alguns centímetros de espaço entre a lente objetiva e a lente condensadora, além de um slot livre para acessórios. Coloque duas grades MET não tratadas cobertas com carbono amorfo entre duas pinças cruzadas, voltadas para o lado revestido de carbono até o topo.Mantenha as grades o mais próximo possível da borda. Coloque quatro microlitros de solução bacteriana em uma das grades. A densidade óptica da amostra deve situar-se entre cinco e 10.Aguarde 60 segundos e limpe cuidadosamente o líquido usando papel de filtro. Tente espalhar o líquido por toda a superfície da grade durante o processo. Coloque quatro microlitros de fotossensibilizador na mesma grade.Após cinco segundos, apague o líquido. Deixe uma camada muito fina de líquido sobre o substrato. Coloque rapidamente a grade seca em cima da coberta com líquido.Mova suavemente a grade superior para a borda da segunda e esprema os substratos nas bordas usando uma pinça. Repita cuidadosamente o aperto. Deixe a célula líquida entre as pinças por um minuto.Inserir a amostra no suporte TEM logo após o término da preparação. Depois de inserir a amostra no microscópio, inicie as observações no modo de baixa ampliação para encontrar uma área de observação adequada. Durante as observações, mantenha a dose de elétrons o mais baixa possível.Expanda o tempo de exposição. Encontre as células cercadas por líquido na ampliação apropriada com tempo de exposição prolongado e capture a primeira imagem imediatamente. Mantenha a dose de elétrons constante e colete imagens a cada 30 segundos para observar as mudanças.Examine cuidadosamente as imagens e calcule a dose total de elétrons que corresponde às primeiras mudanças visíveis nas células. Antes de iniciar o experimento, defina a intensidade da luz laser ajustando o valor atual. Insira a amostra no microscópio e encontre a área de observação.Capture a primeira imagem da célula antes de iniciar a iluminação da amostra e use o feixe em branco para desligar o feixe de elétrons para evitar os efeitos da irradiação de elétrons. Ligue o laser. Comece com um curto tempo de iluminação, pois a luz do laser tem intensidade relativamente alta.Após esse tempo, desligue a fonte de luz. Desligue o feixe em branco e capture a imagem imediatamente. Se possível, use um algoritmo automático para expor a amostra apenas pelo tempo necessário para tirar a imagem.Meça cuidadosamente o tempo de irradiação de elétrons para calcular a dose de elétrons usada para imagens. Observa-se uma notável degradação da camada externa da célula causada pelas espécies reativas de oxigênio geradas pela radiação mais leve do fotossensibilizador após um minuto. Uma maior iluminação de luz tornou as mudanças mais visíveis.Pontos de observação adequados com líquido suficiente podem ser facilmente encontrados em baixa ampliação, pois essas áreas parecem mais escuras e borradas. As bactérias cobertas de líquido são menos visíveis do que as secas, mas ainda podem ser distinguidas. É útil olhar para o limite do líquido durante a imagem, e seu movimento pode ser facilmente detectado, o que implica que a área escolhida pode ser inadequada e instável.Outro problema durante as observações é a evaporação da água e a precipitação da solução, que pode ocorrer em áreas aleatórias da amostra, incluindo as áreas ao redor das bactérias. O encapsulamento de bactérias também pode ser realizado usando membranas de grafeno e nitrato de silício. A preparação da amostra é mais difícil, mas a estabilidade da célula líquida será melhor.O método apresentado pode ser usado para observações de reações induzidas pela luz em líquido. Por exemplo, a influência da luz em materiais metálicos, catalisadores induzidos pela luz e reações fotoquímicas.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Revelando processos dinâmicos de Materiais em Líquidos Usando líquido celular Microscopia Eletrônica de Transmissão

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

Engenharia

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

Em ruptura dielétrica Situ dependentes do tempo no Microscópio Eletrônico de Transmissão: A possibilidade de compreender o mecanismo de falha em dispositivos microeletrônicos

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Estudar processos dinâmicos de Nano porte Objects no líquido utilizando a Transmissão Microscopia Eletrônica de Varredura

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

Caracterização de Ultra-grão fino e nanocristalinos Materiais Usando Transmissão Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

Transição Orientacional em Cristal Líquido Ativada pelo Crescimento Termodinâmico de Folhas Múltiplas Interfaciais

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

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Um método para a obtenção de seções ultra-finas Serial de microorganismos em microscopia eletrônica de transmissão

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

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The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

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Métodos de Ex Situ e In Situ investigações de transformações estruturais: O caso de cristalização de vidros metálicos

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Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Litografia de feixe de elétrons do nanômetro do dígito com uma aberração corrigida digitalização microscópio eletrônico de transmissão

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...