Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Исследование было поддержано грантом Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, Национальный научный центр, Польша).

1. Модификация просвечивающего электронного микроскопа
<ol><li>Модифицируйте просвечивающий электронный микроскоп, подключив оптическое волокно (см. Таблицу материалов) к колонке микроскопа в верхней части объектива. Оставьте несколько сантиметров пространства межд?...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

Установка и ввод в эксплуатацию осветителя требуют базовых сервисных знаний и могут повредить микроскоп. Самый простой способ ввести свет в микроскоп - это подключить оптическое волокно с верхней части объектива, где обычно есть место для катушек отклонения ТЭМ и дополнительных детек?...

Световые явления в высоком разрешении интересны во многих областях, таких как наноинженерия 1,2,3, катализ 4,5 и биофотоника 6. Некоторые оригинальные конструкции, позволяющие проводить подобные эксперименты, можно найти в литературе, в том числе модификации образцов держателей 1,4,7,8,9 и оптического волокна, прикрепленного к микроскопу 10,11.
Сочетание светового освещения, жидкой среды и просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) дает прекрасную возможность для детальных, динамических исследований фотоиндуцированных процессов. Однако состояние высокого вакуума внутри микроскопа довольно неблагоприятно для многих жидкостей, особенно водных растворов. Жидкая инкапсуляция, которая защищает его от окружающей среды, может быть достигнута с использованием нескольких методов, основанных главным образом на графене12, нитриде кремния13 или подложках углерода14. В дополнение к исследованиям в области материаловедения2, так называемые жидкие клетки предлагают возможности для проведения нетрадиционных микроскопических наблюдений за биологическими образцами вблизи ихродных условий 15. Такие наблюдения чрезвычайно требовательны, особенно для живых микроорганизмов, таких как бактериальные клетки. Электронный пучок как ионизирующее излучение вызывает необратимые повреждения гидратированных образцов, поэтому доза электронов должна быть указана16. Это необходимо, чтобы минимизировать неблагоприятные последствия, контролировать ущерб и избегать путаницы артефактов. Оптимальная максимальная доза электронов, которая позволяет наблюдать за живыми клетками, по-прежнему является сомнительной темой16, но доза 30 e−/нм2, по-видимому, является пороговым значением, по крайней мере, для бактерий17.
Некоторые из предметов, представляющих интерес для таких микроскопических исследований, являются процессами во время антимикробной фотодинамической терапии (APDT)18. Короче говоря, терапия протекает следующим образом. Бактериальные клетки окружены светочувствительной жидкостью, называемой фотосенсибилизатором. Когда световое освещение дается на определенной длине волны, цитотоксические активные формы кислорода (АФК) генерируются из энергии или передачи заряда от возбужденных молекул фотосенсибилизатора к кислороду, естественно присутствующему в растворе. Патогены, подвергшиеся воздействию АФК, быстро инактивируются с очень высокой эффективностью, без побочных эффектов19. Реакция на терапию варьируется для разных микробов – например, воздействие одного и того же фотосенсибилизатора может быть совершенно разным для грамположительных и грамотрицательных бактерий20. В целом установлено, что основной мишенью АФК являются внешние структуры клеток, где повреждение приводит к функциональным нарушениям клеточной мембраны и, следовательно, приводит к гибелибактерий 21,22. Однако повреждение нуклеиновых кислот и белков также может считаться причиной инактивации18, поэтому до сих пор неизвестно, какие клеточные структуры являются основными мишенями во время этого процесса19. Более глубокое понимание разрушительных процессов может помочь улучшить эту окончательную терапию. По сравнению с методами световой микроскопии, используемыми в исследовании APDT23, методы TEM дают больше возможностей для изучения механизма APDT с более высоким разрешением и увеличением24. ТЭМ уже успешно используется для наблюдения за клетками во время проводимой терапии, что позволило детально изучить грамположительные повреждения бактерий и подробно описать изменения, происходящие внутри клеточной стенки 6,25.
Текущий протокол представляет собой подходящую экспериментальную установку для визуализации с высоким разрешением инактивации светоиндуцированных бактерий с использованием ТЭМ, что требует надлежащей системы освещения света, инкапсуляции клеток жидкостью и строгого контроля дозы электронов. Бактериями, использованными для наблюдения, был золотистый стафилококк, а в качестве фотосенсибилизатора использовался раствор метиленового синего. Специальная установка светового освещения содержит перестраиваемый полупроводниковый лазер, подключенный непосредственно к колонке микроскопа с помощью светового волокна. Такая конструкция обеспечивает равномерное облучение по всему образцу из-за почти параллельного размещения оптического волокна к оси микроскопа. Монохроматический свет высокой интенсивности, генерируемый лазером, затем может быть использован для изучения различных фотохимических эффектов. Свет, используемый в эксперименте, имел длину волны, равную 660 нм, потому что в видимой области метиленовый синий имеет пики поглощения при 613 нм и 664 нм26. Протокол инкапсуляции жидкости основан на углеродных субстратах, что делает процедуру быстрой и несложной. Наконец, представлен метод наблюдения за клетками в жидкости в низких дозах IN situ TEM. Обсуждаются трудности, связанные с подготовкой образца, воздействием дозы электронов на чувствительный образец и разумной интерпретацией изображения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

Текущий протокол описывает модификации установки просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ) для наблюдений in situ , индуцированных светом. Стеклянное оптическое волокно, вставленное в электронную колонну над полюсом объектива, и лазер, регулируемый источник света, использовались для изготовления устройства. После калибровки осветителя с помощью внешней измерительной системы он позволяет регулировать интенсивность освещения в соответствии с потребностями наблюдаемого процесса. Эта система освещения была использована для изображения явлений антимикробной фотодинамической терапии, которые в настоящее время являются предметом интенсивных исследований. Образец готовили путем обнаружения суспензии бактерий на подложке из углерода, графена или нитрида кремния, промокания избыточного раствора, обнаружения раствора фотосенсибилизатора, повторного промокания избыточной жидкости, а затем сборки жидкой ячейки со второй подложкой или графеновой пленкой. Сам процесс визуализационного эксперимента включает в себя выбор правильного места для наблюдения с использованием малого увеличения и минимальной дозы электронов, а затем циклическую активацию источника света для захвата последующих изображений через заданные промежутки времени с минимальным необходимым количеством электронов. Электронная доза каждого воздействия, а также время и интенсивность используемого освещения должны быть тщательно записаны из-за сложности наблюдаемых явлений, поскольку в то же время процесс управляется как светом, так и электронами. После проведения собственно эксперимента необходимо провести дополнительные контрольные наблюдения, в которых используются те же дозы электронов, но без дополнительного светового воздействия, а для более высоких доз света используются меньшие дозы электронов. Это позволяет отличить световые микроструктурные эффекты от эффектов, вызванных электронами как в области жизни, так и в области материаловедения.

Экспериментальная установка была разработана для наблюдения за световыми процессами, происходящими в жидкости с высоким разрешением. Конкурентный анализ изображений позволил отличить повреждения, вызванные электронным пучком, от изменений, связанных с фотохимической реакцией. Влия...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Настоящий протокол описывает модификации просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ) с системой светового освещения, изготовление жидких клеток и наблюдения IN SITU TEM за светоиндуцированными взаимодействиями между бактериальными клетками и фотосенсибилизатором. Также обсуждаются методы подготовки образцов, электронно-лучевые повреждения и визуализация.

Светоиндуцированная электронная микроскопия in situ transmission для наблюдения взаимодействия жидкости и мягкой материи

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

В протоколе представлено, как комбинация ТЕА жидких клеток и светового освещения может быть использована для наблюдения структурных изменений в бактериях, инкапсулированных фотосенсибилизатором при световом освещении. Главным преимуществом данной методики является ее простота. Протокол не требует сложной пробоподготовки и обеспечивает достаточную инкапсуляцию бактерий раствором фотосенсибилизатора.Для начала модифицируйте просвечивающий электронный микроскоп, подключив оптическое волокно к колонке микроскопа в верхней части объектива. Оставьте несколько сантиметров пространства между объективом и объективом конденсатора, а также свободный слот для аксессуаров. Поместите две необработанные решетки ТЕА, покрытые аморфным углеродом, между двумя скрещенными пинцетами, обращенными к стороне с углеродным покрытием сверху.Держите сетки как можно ближе к краю. Нанесите четыре микролитра раствора бактерий на одну из сеток. Оптическая плотность образца должна находиться в диапазоне от пяти до 10.Подождите 60 секунд и тщательно промойте жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Постарайтесь распределить жидкость по всей поверхности сетки во время процесса. Поместите четыре микролитра фотосенсибилизатора на одну сетку.Через пять секунд смойте жидкость. Оставьте очень тонкий слой жидкости на подложке. Быстро поместите сухую сетку поверх той, которая покрыта жидкостью.Аккуратно переместите верхнюю сетку к краю второй, и сожмите подложки по краям с помощью пинцета. Осторожно повторите сжатие. Оставьте жидкую клетку между пинцетом на одну минуту.Вставьте образец в держатель ТЕА сразу после завершения подготовки. После введения образца в микроскоп начните наблюдения в режиме низкого увеличения, чтобы найти подходящую область наблюдения. Во время наблюдений держите электронную дозу как можно ниже.Увеличьте время экспозиции. Найдите клетки, окруженные жидкостью, при соответствующем увеличении с увеличенным временем экспозиции и немедленно захватите первое изображение. Держите электронную дозу постоянной и собирайте изображения каждые 30 секунд, чтобы наблюдать за изменениями.Внимательно изучите изображения и рассчитайте общую дозу электронов, которая соответствует первым видимым изменениям в клетках. Перед началом эксперимента установите интенсивность лазерного света, отрегулировав текущее значение. Вставьте образец в микроскоп и найдите область наблюдения.Захватите первое изображение ячейки перед началом освещения образца и используйте пучковый гашок, чтобы отключить электронный пучок, чтобы избежать последствий электронного облучения. Включите лазер. Начните с короткого времени освещения, так как лазерный свет имеет относительно высокую интенсивность.По истечении этого времени выключите источник света. Выключите заглушку луча и немедленно захватите изображение. Если возможно, используйте автоматический алгоритм для предоставления образца только в течение времени, необходимого для получения изображения.Тщательно измерьте время электронного облучения, чтобы рассчитать дозу электрона, используемую для визуализации. Наблюдается заметная деградация внешнего слоя клетки, вызванная активными формами кислорода, генерируемыми более легким излучением фотосенсибилизатора через одну минуту. Дальнейшее световое освещение сделало изменения более заметными.Правильные пятна наблюдения с достаточным количеством жидкости можно легко найти при небольшом увеличении, так как эти области кажутся темнее и размытыми. Бактерии, покрытые жидкостью, менее заметны, чем сухие, но их все же можно различить. Полезно смотреть на границу жидкости во время визуализации, и ее движение может быть легко обнаружено, что означает, что выбранная область может быть неподходящей и нестабильной.Другой проблемой во время наблюдений является испарение воды и осаждение раствора, которые могут происходить в случайных областях образца, включая области, окружающие бактерии. Инкапсуляция бактерий также может быть выполнена с использованием мембран графена и нитрата кремния. Пробоподготовка сложнее, но стабильность жидкой клетки будет лучше.Представленный способ может быть использован для наблюдений за светоиндуцированными реакциями на жидкость. Например, влияние света на металлические материалы, светоиндуцированные катализаторы и фотохимические реакции.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Выявление динамических процессов в жидкостях материалов с использованием жидкого сотовых просвечивающей электронной микроскопии

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

В Ситу Время-зависимой пробой диэлектрика в просвечивающий электронный микроскоп: возможность понять механизм Отказ в микроэлектронных устройств

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Изучение динамических процессов наноразмерных объектов в жидкости с помощью сканирующего просвечивающего электронного микроскопа

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

Характеристика Ультра мелкозернистый и нанокристаллических материалов с помощью просвечивающей Кикучи дифракции

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

Ориентационный переход в жидком кристалле, инициированный термодинамическим ростом межфазных смачивающих листов

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

ВС электронные решена НС сканирующий туннельный микроскопии: Содействие исследования динамики одного легирующего заряда

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Методы Ex Situ и In Situ исследования структурных преобразований: В случае кристаллизации металлических стекол

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Однозначных нанометр электронно лучевая литография с исправления аберраций сканирования просвечивающий электронный микроскоп

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...