Name: light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction
Uploaded: 2022-07-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Forskningen stöddes av Miniatura-bidraget (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polen).

1. Modifiering av transmissionselektronmikroskop
<ol><li>Ändra överföringselektronmikroskopet genom att ansluta den optiska fibern (se materialtabell) till mikroskopkolonnen högst upp på objektivlinsen. Tillåt några centimeter utrymme mellan objektivlinsen och kondensorlinsen, plus en gratis plats för tillbehör. OBS: En dedikerad provhållare4 eller en hållare för katodoluminescerande observationer i omvänd konfiguration1 k...

<ol>
	<li>Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+observation+of+plasmon-controlled+photocatalytic+dehydrogenation+of+individual+palladium+nanoparticles.">In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).</li><li>Weng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+light-induced+dynamic+structural+transformations+of+Au+clusters-based+photocatalyst+via+in+situ+TEM.">Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM.</a> Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).</li><li>Cao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+TEM+investigation+on+ultrafast+reversible+lithiation+and+delithiation+cycling+of+Sn@C+yolk-shell+nanoparticles+as+anodes+for+lithium+ion+batteries.">In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries.</a> Nano Energy. 40, 187-194 (2017).</li><li>Cavalca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+transmission+electron+microscopy+of+light-induced+photocatalytic+reactions.">In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions.</a> Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).</li><li>Tung, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+adaptive+junction+for+efficient+solar-driven+oxygen+evolution:+In+situ+unraveling+the+interfacial+metal-silicon+junction.">Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction.</a> Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+in+situ+transmission+electron+microscopy:+Novel+approach+for+antimicrobial+photodynamic+therapy+imaging.">Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).</li><li>Shindo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multifunctional+TEM+specimen+holder+equipped+with+a+piezodriving+probe+and+a+laser+irradiation+port.">Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port.</a> Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensing+performance+of+branched+CdS/ZnO+heterostructures+as+revealed+by+in+situ+TEM+and+photodetector+tests.">Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests.</a> Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistically+analyzed+photoresponse+of+elastically+bent+CdS+nanowires+probed+by+light-compatible+in+situ+high-resolution+TEM.">Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM.</a> Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).</li><li>Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+observation+of+photodecomposition+process+of+poly-hydrocarbons+on+catalytic+TiO2+films.">In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films.</a> Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).</li><li>Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+high-resolution+transmission+electron+microscopy+of+photocatalytic+reactions+by+excited+electrons+in+ionic+liquid.">In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).</li><li>Textor, M., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+preparing+graphene+liquid+cells+for+transmission+electron+microscopy.">Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy.</a> Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).</li><li>Ring, E. A., De Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy.">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).</li><li>Inayoshi, Y., Minoda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+carbon+sandwich+environmental+cell+for+wet+specimens.">A carbon sandwich environmental cell for wet specimens.</a> Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).</li><li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+using+graphene+veils.">Live cell electron microscopy using graphene veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li><li>De Jonge, N., Peckys, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.">Live cell electron microscopy is probably impossible.</a> ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).</li><li>Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+electron-beam-irradiated+bacteria+in+reply+to+&amp;#34;live+cell+electron+microscopy+is+probably+impossible.&amp;#34.">Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to &amp;#34;live cell electron microscopy is probably impossible.&amp;#34.</a> ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).</li><li>Alves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+insight+on+bacterial+cellular+targets+of+photodynamic+inactivation.">An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation.</a> Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).</li><li>Cieplik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+photodynamic+therapy-What+we+know+and+what+we+don't.">Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't.</a> Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+Type+II+mechanisms+of+antimicrobial+photodynamic+therapy:+An+in+vitro+study+on+gram-negative+and+gram-positive+bacteria.">Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).</li><li>Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Escherichia+coli+photodynamic+inactivation+by+an+amphiphilic+tricationic+porphyrin+and+5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl)+porphyrin.">Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin.</a> Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).</li><li>Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-pot+synthesis+of+a+cyclic+antimicrobial+peptide-conjugated+phthalocyanine+for+synergistic+chemo-photodynamic+killing+of+multidrug-resistant+bacteria.">One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria.</a> Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).</li><li>Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+fluorescence+imaging+to+evaluate+the+effect+of+antimicrobial+photodynamic+therapy+depth+on+P.+gingivalis+and+T.+denticola+biofilms.">Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).</li><li>Maldonado-Carmona, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porphyrin-loaded+lignin+nanoparticles+against+bacteria:+A+photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+application.">Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).</li><li>&#379;ak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grz&#281;da, J., Matczyszyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-optic+sample+illuminator+design+for+the+observation+of+light+induced+phenomena+with+transmission+electron+microscopy+in+situ:+Antimicrobial+photodynamic+therapy.">Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy.</a> Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).</li><li>Dinh, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+adsorption+mechanisms+of+methylene+blue+and+chromium(III)+from+aqueous+solution+onto+pomelo+fruit+peel.">Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel.</a> RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).</li><li>&#379;ak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+to+controlling+the+electron+dose+to+improve+low-dose+imaging+of+sensitive+samples.">Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples.</a> Micron. 145, 103058 (2021).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).</li><li>Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+on+negative+stain+electron+microscopy+methods:+Tools+for+tackling+challenging+systems.">Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).</li><li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM:+From+grid+preparation+to+image+acquisition.">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+A+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Miller, B. K., Crozier, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System+for+in+situ+UV-visible+illumination+of+environmental+transmission+electron+microscopy+samples.">System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).</li><li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells.">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336 (6077), 61-64 (2012).</li><li>Schneider, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-Water+interactions+and+implications+for+liquid+cell+electron+microscopy.">Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy.</a> Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).</li></ol>

Installation och idrifttagning av belysningen kräver grundläggande servicekunskap och kan skada mikroskopet. Det enklaste sättet att introducera ljuset till mikroskopet är att ansluta den optiska fibern från toppen av objektivlinsen, där det vanligtvis finns plats för TEM-avböjningsspolar och ytterligare detektorer. Mer ledigt utrymme kan också förväntas från äldre toppinmatningsenheter, där samma plats rymmer provvakuumlåset och provinstallationsmekanismen. Denna konfiguration beskrivs allmänt i en tidig...

Ljusinducerade fenomen i hög upplösning är intressanta inom många områden som nanoengineering 1,2,3, katalys 4,5 och biofotonik6. Några ursprungliga mönster som tillåter sådana experiment finns i litteraturen, inklusive modifieringar av provhållarna 1,4,7,8,9 och den optiska fibern fäst vid mikroskopet 10,11.
Kombinationen av ljusbelysning, en flytande miljö och transmissionselektronmikroskopi (TEM) ger en stor möjlighet till detaljerade, dynamiska studier av fotoinducerade processer. Högvakuumtillståndet inuti mikroskopet är emellertid ganska ogynnsamt för många vätskor, särskilt vattenlösningar. Vätskeinkapsling, som skyddar den från miljön, kan uppnås med hjälp av några tekniker baserade huvudsakligen på grafen12, kiselnitrid13 ellerkol 14 substrat. Förutom forskning inom materialvetenskap2 erbjuder så kallade flytande celler möjligheter att genomföra okonventionella mikroskopiska observationer på biologiska prover nära deras ursprungliga förhållanden15. Sådana observationer är extremt krävande, särskilt för levande mikroorganismer som bakterieceller. Elektronstrålen som joniserande strålning orsakar irreversibel skada på de hydratiserade proverna, så elektrondosen måste specificeras16. Detta är nödvändigt för att minimera ogynnsamma effekter, kontrollera skadorna och undvika förvirrande artefakter. Den optimala maximala elektrondosen som tillåter observationer av levande celler är fortfarande ett tveksamt ämne16, men dosen på 30 e−/nm2 verkar vara tröskelvärdet, åtminstone för bakterier17.
Några av de ämnen som är av intresse för sådana mikroskopiska studier är processer under antimikrobiell fotodynamisk terapi (APDT)18. Kort sagt, terapin fortsätter enligt följande. Bakteriecellerna är omgivna av den ljuskänsliga vätskan som kallas fotosensibiliserare. När ljusbelysning ges vid en specifik våglängd genereras de cytotoxiska reaktiva syrearterna (ROS) från energi- eller laddningsöverföring från de exciterade fotosensibiliserande molekylerna till syret som finns naturligt i lösningen. Patogener som utsätts för ROS inaktiveras snabbt med mycket hög effektivitet, utan biverkningar19. Svaret på terapin varierar för distinkta mikrober - till exempel kan effekten av samma fotosensibiliserare vara helt annorlunda för grampositiva och gramnegativa bakterier20. I allmänhet har det fastställts att huvudmålet för ROS är cellernas yttre strukturer, där skador resulterar i funktionella störningar i cellmembranet och följaktligen leder till bakteriedöd21,22. Skador på nukleinsyror och proteinerkan emellertid också betraktas som en orsak till inaktivering18, så det är fortfarande okänt vilka cellstrukturer som är huvudmålen under denna process19. En djupare förståelse för de skadliga processerna kan bidra till att förbättra denna definitiva terapi. Jämfört med de ljusmikroskopimetoder som används i APDT-forskning23 ger TEM-tekniker fler möjligheter att titta på APDT-mekanismen med högre upplösning och förstoring24. TEM har redan framgångsrikt använts för cellobservation under pågående behandling, vilket gjorde det möjligt för oss att studera grampositiva bakterieskador och beskriva de förändringar som sker i cellväggen i detalj 6,25.
Det nuvarande protokollet presenterar en lämplig experimentell inställning för högupplöst avbildning av ljusinducerad bakterieinaktivering med TEM, vilket kräver ett ordentligt ljusbelysningssystem, inkapsling av celler med en vätska och strikt elektrondoskontroll. Bakterierna som användes för observationen var Staphylococcus aureus, och en metylenblå lösning användes som fotosensibiliserare. Den speciella ljusbelysningsinställningen består av en avstämbar halvledarlaser ansluten direkt till mikroskopkolonnen med hjälp av ljusfibern. Denna design ger enhetlig bestrålning genom hela provet på grund av den nästan parallella placeringen av den optiska fibern till mikroskopaxeln. Monokromatiskt ljus med hög intensitet som genereras av lasern kan sedan användas för att studera olika fotokemiska effekter. Ljuset som användes i experimentet hade en våglängd lika med 660 nm eftersom metylenblått i det synliga området har absorptionstoppar vid 613 nm och 664 nm26. Protokollet för vätskeinkapsling är baserat på kolsubstrat, vilket gör proceduren snabb och okomplicerad. Slutligen presenteras en metod för lågdos in situ TEM-observation av celler i vätska. Svårigheterna med provberedning, elektrondoseffekter på det känsliga provet och rimlig bildtolkning diskuteras.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carbon film on 200 mesh copper grid</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGS160</td>
			<td>The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crossover Tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>N5</td>
			<td>The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodiode Power Sensor</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S130C</td>
			<td>The sensor used for light intensity measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyimide-Coated Multimode Fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FG400UEP</td>
			<td>Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-800</td>
			<td>Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuneable Diode Laser</td>
			<td>CNI</td>
			<td>MRL-III-660D</td>
			<td>The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer&#39;s absorption spectrum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced in situ transmission electron microscopy for observation of the liquid-soft matter interaction

Det nuvarande protokollet beskriver modifieringarna av transmissionselektronmikroskopet (TEM) för in situ ljusinducerade observationer. En optisk glasfiber införd i elektronkolonnen ovanför objektivlinspolstycket och en laser, en justerbar ljuskälla, användes för att tillverka enheten. Efter att belysningen har kalibrerats med hjälp av ett externt mätsystem tillåter det en att justera belysningens intensitet till behoven hos den observerade processen. Detta belysningssystem användes för att avbilda antimikrobiella fotodynamiska terapifenomen, som för närvarande är föremål för intensiv forskning. Provet framställdes genom att upptäcka en suspension av bakterier på ett kol-, grafen- eller kiselnitridsubstrat, blotta överskottslösningen, upptäcka fotosensibiliseringslösningen, blotta överskottsvätskan igen och sedan montera vätskecellen med ett andra substrat eller grafenfilm. Processen med själva avbildningsexperimentet innefattar att välja rätt plats för observation med användning av låg förstoring och en minsta dos elektroner och sedan cyklisk aktivering av ljuskällan för att fånga efterföljande bilder med angivna intervall med den minsta mängd elektroner som behövs. Elektrondosen för varje exponering och tiden och intensiteten för belysning som används måste registreras noggrant på grund av komplexiteten hos de observerade fenomenen eftersom processen samtidigt är både ljus- och elektrondriven. Efter att själva experimentet har utförts måste ytterligare kontrollobservationer göras, där samma doser elektroner används men utan ytterligare ljuspåverkan och mindre doser elektroner används för högre doser ljus. Detta gör det möjligt att skilja ljusinducerade mikrostrukturella effekter från de som orsakas av elektroner inom både livs- och materialvetenskap.

Den experimentella installationen var utformad för att observera de ljusinducerade processerna som förekommer i en vätska med hög upplösning. Konkurrensanalysen av bilderna gjorde det möjligt för oss att skilja skadorna orsakade av elektronstrålen från förändringar relaterade till den fotokemiska reaktionen. Effekten av elektronstrålen på det känsliga provet (i detta fall cellerna inkapslade med vätska) var synliga över hela det bestrålade området när elektronerna trängde igenom det likformigt. Naturl...

Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction at JoVE.com

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Detta protokoll beskriver transmissionselektronmikroskop (TEM) modifieringar med ett ljusbelysningssystem, tillverkning av flytande celler och in situ TEM-observationer av ljusinducerade interaktioner mellan bakterieceller och en fotosensibiliserare. Provberedningsmetoderna, elektronstråleskador och avbildning diskuteras också.

Ljusinducerad in situ-transmissionselektronmikroskopi för observation av interaktionen mellan vätska och mjuk materia

The current protocol describes the modifications of the transmission electron microscope (TEM) setup for in situ light-induced observations. A glass ...

Protokollet presenterar hur kombinationen av flytande cell TEM och ljusbelysning kan användas för att observera de strukturella förändringarna i bakterierna inkapslade med fotosensibiliserare vid ljusbelysning. Den största fördelen med denna teknik är dess enkelhet. Protokollet kräver inte svår provberedning och ger tillräcklig inkapsling av bakterier med fotosensibiliserande lösning.Börja med att modifiera överföringselektronmikroskopet genom att ansluta den optiska fibern till mikroskopkolonnen högst upp på objektivlinsen. Tillåt några centimeter utrymme mellan objektivlinsen och kondensorlinsen, plus en gratis plats för tillbehör. Placera två obehandlade TEM-galler täckta med amorft kol mellan två korsade pincetter, vända mot den kolbelagda sidan till toppen.Håll gallren så nära kanten som möjligt. Lägg fyra mikroliter bakterielösning på ett av gallren. Provets optiska densitet måste ligga i intervallet fem till 10.Vänta i 60 sekunder och torka försiktigt vätskan med filterpapper. Försök att sprida vätskan över hela gallerytan under processen. Sätt fyra mikroliter fotosensibiliserare på samma galler.Efter fem sekunder, torka ut vätskan. Lämna ett mycket tunt lager vätska på substratet. Placera snabbt det torra gallret ovanpå det som är täckt med vätska.Flytta försiktigt det övre gallret till kanten av det andra och pressa underlagen vid kanterna med pincett. Upprepa försiktigt pressningen. Lämna vätskecellen mellan pincetten i en minut.Sätt in provet i TEM-hållaren direkt efter avslutad beredning. När du har satt in provet i mikroskopet, starta observationerna i lågt förstoringsläge för att hitta ett lämpligt observationsområde. Under observationerna håll elektrondosen så låg som möjligt.Utöka exponeringstiden. Hitta cellerna omgivna av vätska med lämplig förstoring med förlängd exponeringstid och fånga den första bilden omedelbart. Håll elektrondosen konstant och samla in bilder var 30: e sekund för att observera förändringarna.Undersök bilderna noggrant och beräkna den totala elektrondosen som motsvarar de första synliga förändringarna i cellerna. Innan du börjar experimentet, ställ in laserljusintensiteten genom att justera det aktuella värdet. Sätt in provet i mikroskopet och hitta observationsområdet.Ta den första bilden av cellen innan du börjar belysa provet och använd strålblankaren för att stänga av elektronstrålen för att undvika effekterna av elektronbestrålning. Slå på lasern. Börja med en kort belysningstid, eftersom laserljuset har relativt hög intensitet.Efter den tiden stänger du av ljuskällan. Stäng av strålblankaren och ta bilden omedelbart. Om möjligt, använd en automatisk algoritm för att exponera provet endast under den tid som behövs för att ta bilden.Mät noggrant elektronbestrålningstiden för att beräkna elektrondosen som används för avbildning. En anmärkningsvärd nedbrytning av det yttre skiktet av cellen orsakad av de reaktiva syrearterna som genereras av lättare strålning av fotosensibiliseraren efter en minut observeras. Ytterligare ljusbelysning gjorde förändringarna mer synliga.Korrekta observationsfläckar med tillräckligt med vätska kan lätt hittas vid låg förstoring, eftersom dessa områden verkar mörkare och suddiga. De flytande täckta bakterierna är mindre synliga än de torra, men kan fortfarande särskiljas. Det är användbart att titta på vätskegränsen under avbildningen, och dess rörelse kan lätt upptäckas, vilket innebär att det valda området kan vara olämpligt och instabilt.En annan fråga under observationer är avdunstningen av vattnet och utfällningen av lösningen som kan förekomma i slumpmässiga områden av provet, inklusive områdena kring bakterierna. Inkapsling av bakterier kan också utföras med användning av grafen- och kiselnitratmembran. Provberedningen är svårare, men stabiliteten hos vätskecellen blir bättre.Den presenterade metoden kan användas för observationer av ljusinducerade reaktioner på vätska. Till exempel påverkan av ljus på metallmaterial, ljusinducerade katalysatorer och fotokemiska reaktioner.

Research

JoVE Journal

Engineering

Light-Induced In Situ Transmission Electron Microscopy for Observation of the Liquid-Soft Matter Interaction

Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy

Avslöja dynamiska processer av material i vätskor använder flytande Cell transmissionselektronmikroskop

The recent development for in situ transmission electron microscopy, which allows imaging through liquids with high spatial resolution, has attracted ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

In Situ Tidsberoende dielektriska genombrottet i transmissionselektronmikroskop: En möjlighet att förstå mekanismen Fel i Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Studera dynamiska processer av Nano stora objekt i Liquid använder Scanning transmissionselektronmikroskopi

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

Karaktärisering av ultra finkornig och nanokristallina material att använda Transmission Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

Orientational Transition in a Liquid Crystal Triggered by the Thermodynamic Growth of Interfacial Wetting Sheets

Orienterande övergång i ett flytande kristall utlöst av den termodynamiska tillväxten av gränsvärda vätskeark

In liquid crystal (LC) physical chemistry, molecules near the surface play a great role in controlling bulk orientation. Thus far, mainly to achieve ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

En metod för att erhålla seriell Ultrathin sektioner av mikroorganismer i transmissionselektronmikroskopi

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

All-elektroniska nanosekund-löst Scanning Tunneling Microscopy: Att underlätta utredningen av enda dopämne kostnad Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Methods of Ex Situ and In Situ Investigations of Structural Transformations: The Case of Crystallization of Metallic Glasses

Metoder Ex Situ och In Situ utredningar av strukturomvandlingar: fallet av kristallisation av metalliska glasögon

We demonstrate the use of two nuclear-based analytical methods that can follow the modifications of microstructural arrangement of iron-based metallic ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

Ensiffriga Nanometer elektronstråle litografi med en Aberration-korrigerade skanning transmissionselektronmikroskop

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission ElectronMikroskopi med förspänning och tillverkning av asymmetriska tvärstänger baserade på blandade faser a-VOx