Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة بيزا (المشروع 114/16). يود المؤلفون أن يشكروا رافاييل جيتا من وحدة علم أمراض الأنسجة في Azienda Ospedaliera Pisana على اختيار عينة المريض ودعم علم الأمراض. كما نشكر أليسيا جالانتي على الدعم الفني في التجارب. تستند هذه المقالة إلى عمل من COST Action TRANSPAN ، CA21116 ، بدعم من COST (التعاون الأوروبي في العلوم والتكنولوجيا).

وافقت وزارة الصحة العامة الإيطالية على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة ، وفقا للتوجيه 2010/63 / EU بشأن استخدام الحيوانات ورعايتها. وافقت اللجنة الأخلاقية المحلية على الدراسة ، تحت رقم التسجيل 70213. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المعنيين. قبل البدء ، يجب إعداد جميع الحلول وال...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

توفر النماذج في الجسم الحي في أبحاث السرطان أدوات لا تقدر بثمن لفهم بيولوجيا السرطان والتنبؤ باستجابة علاج السرطان. حاليا ، تتوفر نماذج مختلفة في الجسم الحي ، على سبيل المثال ، الحيوانات المعدلة وراثيا (الفئران المعدلة وراثيا والضربة القاضية) أو الطعوم الخارجية المشتقة من المري...

تتمثل إحدى مشاكل أبحاث السرطان السريرية في أن السرطان ليس مرضا واحدا ، ولكنه مجموعة متنوعة من الأمراض المختلفة التي يمكن أن تتطور بمرور الوقت ، مما يتطلب علاجات محددة اعتمادا على خصائص الورم نفسه والمريض1. وبالتالي ، فإن التحدي هو التحرك نحو أبحاث السرطان الموجهة نحو المريض ، من أجل تحديد استراتيجيات شخصية جديدة للتنبؤ المبكر بنتائج علاج السرطان2. هذا مهم بشكل خاص للسرطان الغدي القنوي البنكرياسي (PDAC) ، لأنه يعتبر سرطانا يصعب علاجه ، بمعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 11٪ 3.
لا يزال التشخيص المتأخر والتقدم السريع ونقص العلاجات الفعالة هي المشاكل السريرية الأكثر إلحاحا ل PDAC. لذلك ، يتمثل التحدي الرئيسي في نمذجة المريض وتحديد المؤشرات الحيوية التي يمكن تطبيقها في العيادة لاختيار العلاج الأكثر فعالية بما يتماشى مع الطب الشخصي4،5،6. بمرور الوقت ، تم اقتراح مناهج جديدة لنمذجة أمراض السرطان: نشأت الكائنات العضوية المشتقة من المريض (PDOs) والطعوم الخارجية المشتقة من مريض الفئران (mPDXs) من مصدر لأنسجة الورم البشري. لقد تم استخدامها لإعادة إنتاج المرض لدراسة الاستجابة ومقاومة العلاج ، وكذلك تكرار المرض7،8،9.
وبالمثل ، زاد الاهتمام بنماذج xenograft المشتقة من المرضى (zPDX) القائمة على الزرد ، وذلك بفضل خصائصها الفريدة والواعدة10 ، والتي تمثل أداة سريعة ومنخفضة التكلفة لأبحاث السرطان11,12. تتطلب نماذج zPDX حجم عينة ورم صغير فقط ، مما يجعل الفحص عالي الإنتاجية للعلاج الكيميائي ممكنا13. تعتمد التقنية الأكثر شيوعا المستخدمة في نماذج zPDX على هضم العينة الكاملة وزرع مجموعات الخلايا الأولية ، والتي تعيد إنتاج الورم جزئيا ، ولكن لها عيوب نقص البيئة المكروية للورم والحديث المتبادل بين الخلايا الخبيثة والسليمة14.
يوضح هذا العمل كيف يمكن استخدام zPDXs كنموذج قبل السريري لتحديد ملف تعريف الحساسية الكيميائية لمرضى سرطان البنكرياس. تسهل الاستراتيجية القيمة عملية الكسب غير المشروع ، حيث لا توجد حاجة لتوسيع الخلايا ، مما يسمح بتسريع فحص العلاج الكيميائي. تكمن قوة النموذج في الحفاظ على جميع مكونات البيئة المكروية كما هي في أنسجة سرطان المريض ، لأنه ، كما هو معروف ، يعتمد سلوك الورم على تفاعلها15,16. هذا مناسب للغاية على الطرق البديلة في الأدبيات ، حيث أنه من الممكن الحفاظ على عدم تجانس الورم والمساهمة في تحسين القدرة على التنبؤ بنتائج العلاج والانتكاس بطريقة خاصة بالمريض ، وبالتالي تمكين استخدام نموذج zPDX في التجارب السريرية المشتركة. تصف هذه المخطوطة الخطوات المتبعة في صنع نموذج zPDX ، بدءا من قطعة من استئصال ورم المريض ومعالجته لتحليل الاستجابة للعلاج الكيميائي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

السرطان هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم ، ويستمر معدل الإصابة بالعديد من أنواع السرطان في الزيادة. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بالفحص والوقاية والعلاج. ومع ذلك ، لا تزال النماذج قبل السريرية التي تتنبأ بملف الحساسية الكيميائية لمرضى السرطان غير موجودة. لسد هذه الفجوة ، تم تطوير نموذج xenograft المشتق من المريض في الجسم الحي والتحقق من صحته. استند النموذج إلى أجنة الزرد (Danio rerio) في 2 أيام بعد الإخصاب ، والتي تم استخدامها كمتلقين لشظايا xenograft من أنسجة الورم المأخوذة من عينة جراحية للمريض. 
ومن الجدير بالذكر أيضا أن العينات ثنائية البصر لم يتم هضمها أو تفكيكها ، من أجل الحفاظ على البيئة المكروية للورم ، وهو أمر بالغ الأهمية من حيث تحليل سلوك الورم والاستجابة للعلاج. يفصل البروتوكول طريقة لإنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (zPDXs) من الاستئصال الجراحي للورم الصلب الأولي. بعد الفحص من قبل أخصائي علم التشريح ، يتم تشريح العينة باستخدام شفرة مشرط. تتم إزالة الأنسجة الميتة أو الأوعية أو الأنسجة الدهنية ثم تقطيعها إلى قطع 0.3 مم × 0.3 مم × 0.3 مم. 
ثم يتم وضع علامات على القطع الفلورية وزرعها في الفضاء المحيط بأجنة الزرد. يمكن معالجة عدد كبير من الأجنة بتكلفة منخفضة ، مما يتيح إجراء تحليلات عالية الإنتاجية في الجسم الحي للحساسية الكيميائية ل zPDXs للعديد من الأدوية المضادة للسرطان. يتم الحصول على الصور متحدة البؤر بشكل روتيني للكشف عن مستويات موت الخلايا المبرمج التي يسببها العلاج الكيميائي وتحديدها كميا مقارنة بالمجموعة الضابطة. يتمتع إجراء xenograft بميزة زمنية كبيرة ، حيث يمكن إكماله في يوم واحد ، مما يوفر نافذة زمنية معقولة لإجراء فحص علاجي للتجارب السريرية المشتركة.

يصف هذا البروتوكول النهج التجريبي لإنشاء zPDXs من سرطان البنكرياس الغدي البشري الأولي. تم جمع عينة الورم وفرمها وتلطيخها باستخدام صبغة الفلورسنت ، كما هو موضح في قسم البروتوكول 4. ثم تم إنشاء zPDXs بنجاح عن طريق زرع قطعة من الورم في الفضاء المحيط لأجنة 2 من الزرد dpf ، كما هو موضح في قسم البروتوكول...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

تهدف النماذج قبل السريرية إلى تعزيز المعرفة ببيولوجيا السرطان والتنبؤ بفعالية العلاج. تصف هذه الورقة جيل الطعوم الخارجية المشتقة من المرضى (zPDXs) القائمة على الزرد مع شظايا أنسجة الورم. تم علاج zPDXs بالعلاج الكيميائي ، وتم تقييم التأثير العلاجي من حيث موت الخلايا المبرمج للأنسجة المزروعة.

إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من سرطان البنكرياس لاختبار الحساسية الكيميائية

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

يعد xenograft المشتق من مريض الزرد نموذجا قويا قبل السريري للتنبؤ بملف الحساسية الكيميائية لمرضى السرطان في الجسم الحي. يصف البروتوكول جيل النموذج بدءا من عينة جراحية للمريض. من خلال تطعيم جزء صغير من الأنسجة بدلا من عزل الخلايا في أجنة الزرد ، من الممكن الحفاظ على البيئة المكروية للورم وهي الخطوة الحاسمة لتطور الورم والاستجابة للعلاج الكيميائي.يتم إعطاء الميزة الكبيرة للنموذج من خلال قدرته على التنبؤ بتشخيص المريض في إطار زمني سريري ذي صلة مدته أسبوع واحد فقط يعمل كأداة للطب الشخصي. ابدأ معالجة العينة عن طريق غسل أنسجة الورم بأكملها التي تم جمعها من المريض بخمسة ملليلتر من وسط الورم الطازج. ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة باستور البلاستيكية.قم بشفط وسط الغسيل بعناية والتخلص منه قبل تكرار الغسيل ثلاث مرات. اغمر العينة في واحد إلى ملليلتر من وسط الورم الطازج. قطع عينة الورم إلى قطعة مكعبة من واحد إلى اثنين ملليمتر باستخدام شفرة مشرط ، ثم ضعها في أنبوب بلاستيكي معقم سعة خمسة ملليلتر مع وسط الورم.بعد ضبط مفرمة الأنسجة McIlwain على سمك 100 ميكرومتر ، ضع قطع الورم على الطاولة البلاستيكية الدائرية للمروحية واقطعها. قم بتدوير الطاولة بمقدار 90 درجة وكرر التقطيع. اجمع شظايا الورم المفرومة في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسط الورم.أجهزة الطرد المركزي شظايا الورم المفروم عند 300 غرام لمدة ثلاث دقائق قبل شفط والتخلص من المادة الطافية. احتضن الشظايا بمحلول تتبع الخلية أو بتعقب الخلايا الفلورية البديلة مثل CM-DiI أو Deep Red لمدة 30 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، أعد تعليق الشظايا برفق كل 10 دقائق.في نهاية التلوين ، قم بإزالة أي صبغة مجانية عن طريق إضافة وسط ورم مكمل بما لا يقل عن 1 ٪ من البروتين. سيكون الحجم خمسة أضعاف حجم التلطيخ. أجهزة الطرد المركزي شظايا في 300 G لمدة ثلاث دقائق وتجاهل طاف.أضف ملليلترا واحدا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco أو DPBS وكرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتعليق الشظايا في خمسة ملليلتر من DPBS في طبق بتري 60 ملم. لإنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من المريض أو zPDX القائمة على الزرد ، قم بتخدير الأجنة بعد يومين من الإخصاب.في طبق بتري يحتوي على ثلاث أسطوانات أغاروز ، ضع جنين الزرد على أسطوانة تعرض جانبا واحدا. قم بإزالة المحلول الزائد للحفاظ على الجنين في طبقة رقيقة. باستخدام ملقط معقم ، انقل قطعة شظايا أنسجة الورم الملطخة من طبق بتري 60 ملم إلى دعم 1٪ من الأغاروز حيث يتم وضع الجنين.ثم التقط المنديل وضعه على صفار الجنين قبل دفعه إلى الفضاء المحيط باستخدام الإبرة الزجاجية الدقيقة المسحوبة بالحرارة. أضف بعض قطرات E3 1٪ البنسلين ستربتومايسين إلى الجنين لإعادته إلى السائل. بعد تكرار زرع أنسجة الورم في جميع الأجنة ، قم بإزالة دعامات الأغاروز من طبق بتري واحتضان الأجنة عند 35 درجة مئوية.بعد ساعتين من الزرع ، افحص الأجنة بحثا عن الطعوم الخارجية الصحيحة مع تلطيخ إيجابي باستخدام مجهر ستيريو فلوري. تخلص من الأجنة الميتة والأجنة بدون شظايا الورم تماما داخل الفضاء المحيطي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتوزيع الأجنة بشكل عشوائي في ست لوحات متعددة الآبار ، مقسمة بالتساوي إلى مجموعات وفقا للخطة التجريبية.قم بتخفيف الأدوية عن طريق مزجها في E3 1٪ pen-strep لتحضير كوكتيل FOLFOXIRI. بعد ساعتين من الزرع ، قم بإزالة الوسائط من كل بئر وأضف كوكتيل الدواء. ضع الأجنة في الحاضنة عند 35 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام مع تغييرات يومية للوسط لتجديد الأدوية.للتصوير ، التقط صورا تحت هدف 40X من المجهر متحد البؤر. استخدم دقة 1024 × 512 بكسل مع تباعد Z يبلغ خمسة ميكرومترات. أظهرت صور التركيب الكاملة ل zPDXs التي تم الحصول عليها لتحليل موت الخلايا المبرمج المكتشف في cyano أن العلاج المشترك زاد من موت الخلايا المبرمج مقارنة بمجموعة المجموعة الضابطة.ذكرت دراسة الحالة أنه تم تحديد زيادة ذات دلالة إحصائية في جزء الخلايا المبرمج في الطعوم الخارجية المزروعة للمجموعة المعالجة ب FOLFOXIRI مقارنة بالمجموعة الضابطة. يظهر البروتوكول مثالا على استخدام أنسجة سرطان البنكرياس ، ولكن يمكن إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من أنواع مختلفة من السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن النموذج له تأثير أخلاقي منخفض ، فإنه يمكن استغلاله بسهولة للفحص في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.هذه الطريقة صعبة من الناحية الفنية وتتطلب مشغلا خبيرا. الخبرة السابقة في معالجة أجنة الزرد والحقن المجهري ستسرع من تدريب هذه التقنية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...