Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Fondazione Pisa (projekt 114/16). Forfatterne vil gerne takke Raffaele Gaeta fra Histopatologisk Enhed i Azienda Ospedaliera Pisana for patientprøveudvælgelsen og patologistøtten. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske support i eksperimenterne. Denne artikel er baseret på arbejde udført af COST Action Transpan, CA21116, støttet af COST (European Cooperation in Science and Technology).

Det italienske ministerium for folkesundhed godkendte alle de beskrevne dyreforsøg i overensstemmelse med direktiv 2010/63/EU om brug og pasning af dyr. Den lokale etiske komité godkendte undersøgelsen under registreringsnummer 70213. Der blev indhentet informeret samtykke fra alle involverede forsøgspersoner. Før start skal alle opløsninger og udstyr forberedes (afsnit 1), og fisken skal krydses (afsnit 2).
1. Fremstilling af opløsninger og udstyr
<p class="jove_cont...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

In vivo-modeller i kræftforskning giver uvurderlige værktøjer til at forstå kræftbiologi og forudsige kræftbehandlingsresponsen. I øjeblikket findes der forskellige in vivo-modeller , f.eks. genetisk modificerede dyr (transgene mus og knockout-mus) eller patientafledte xenotransplantater fra humane primære celler. På trods af mange optimale funktioner har hver enkelt forskellige begrænsninger. Især mangler de ovennævnte modeller en pålidelig måde at efterligne patientens tumorvævsmikromil...

Et af problemerne med klinisk kræftforskning er, at kræft ikke er en enkelt sygdom, men en række forskellige sygdomme, der kan udvikle sig over tid, hvilket kræver specifikke behandlinger afhængigt af selve tumorens egenskaber og patienten1. Derfor er udfordringen at bevæge sig mod patientorienteret kræftforskning for at identificere nye personaliserede strategier til tidlig forudsigelse af kræftbehandlingsresultater2. Dette er især relevant for pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), da det betragtes som en svær at behandle kræft med en 5-årig overlevelsesrate på 11%3.
Den sene diagnose, hurtige progression og mangel på effektive terapier forbliver de mest presserende kliniske problemer med PDAC. Den største udfordring er derfor at modellere patienten og identificere biomarkører, der kan anvendes i klinikken for at vælge den mest effektive terapi på linje med personlig medicin 4,5,6. Over tid er der blevet foreslået nye tilgange til modellering af kræftsygdomme: patientafledte organoider (BDO'er) og musepatientafledte xenotransplantater (mPDX'er) stammer fra en kilde til humant tumorvæv. De er blevet brugt til at reproducere sygdommen for at studere responsen og modstanden mod terapi samt sygdomsgentagelse 7,8,9.
På samme måde er interessen for zebrafiskbaserede patientafledte xenograftmodeller (zPDX) steget takket være deres unikke og lovende egenskaber10, hvilket repræsenterer et hurtigt og billigt værktøj til kræftforskning11,12. zPDX-modeller kræver kun en lille tumorprøvestørrelse, hvilket gør screening med høj kapacitet af kemoterapi mulig13. Den mest almindelige teknik, der anvendes til zPDX-modeller, er baseret på fuldstændig prøvefordøjelse og implantation af de primære cellepopulationer, som delvist reproducerer tumoren, men har ulemperne ved mangel på tumormikromiljø og krydstale mellem ondartede og sunde celler14.
Dette arbejde viser, hvordan zPDX'er kan bruges som en præklinisk model til at identificere kemofølsomhedsprofilen hos patienter med kræft i bugspytkirtlen. Den værdifulde strategi letter xenograft-processen, da der ikke er behov for celleudvidelse, hvilket muliggør acceleration af kemoterapiscreeningen. Modellens styrke er, at alle mikromiljøkomponenterne opretholdes som de er i patientens kræftvæv, fordi tumorens opførsel som bekendt afhænger af deres samspil15,16. Dette er yderst gunstigt i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er muligt at bevare tumorheterogeniteten og bidrage til at forbedre forudsigeligheden af behandlingsresultatet og tilbagefald på en patientspecifik måde, hvilket gør det muligt at anvende zPDX-modellen i co-kliniske forsøg. Dette manuskript beskriver de trin, der er involveret i at lave zPDX-modellen, startende med et stykke patientstumorresektion og behandle det for at analysere responsen på kemoterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

Kræft er en af de vigtigste dødsårsager på verdensplan, og forekomsten af mange typer kræft fortsætter med at stige. Der er gjort store fremskridt med hensyn til screening, forebyggelse og behandling; Der mangler dog stadig prækliniske modeller, der forudsiger kræftpatienters kemosensitivitetsprofil. For at udfylde dette hul blev der udviklet og valideret en in vivo patientafledt xenograftmodel. Modellen var baseret på zebrafisk (Danio rerio) embryoner 2 dage efter befrugtning, som blev brugt som modtagere af xenograft fragmenter af tumorvæv taget fra en patients kirurgiske prøve. 
Det er også værd at bemærke, at bioptiske prøver ikke blev fordøjet eller disaggregeret for at opretholde tumormikromiljøet, hvilket er afgørende med hensyn til analyse af tumoradfærd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode til etablering af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) fra primær solid tumorkirurgisk resektion. Efter screening af en anatomiopatog dissekeres prøven ved hjælp af et skalpelblad. Nekrotisk væv, kar eller fedtvæv fjernes og hakkes derefter i stykker på 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm. 
Stykkerne mærkes derefter fluorescerende og xenotransplanteres i perivitellinerummet hos zebrafiskembryoner. Et stort antal embryoner kan behandles til en lav pris, hvilket muliggør in vivo-analyser med høj kapacitet af zPDX'ers kemofølsomhed over for flere kræftlægemidler. Konfokale billeder erhverves rutinemæssigt for at detektere og kvantificere de apoptotiske niveauer induceret af kemoterapibehandling sammenlignet med kontrolgruppen. Xenograftproceduren har en betydelig tidsfordel, da den kan gennemføres på en enkelt dag, hvilket giver et rimeligt tidsvindue til at udføre en terapeutisk screening for cokliniske forsøg.

Denne protokol beskriver den eksperimentelle tilgang til etablering af zPDX'er fra primært humant pancreas adenocarcinom. En tumorprøve blev opsamlet, hakket og farvet ved hjælp af fluorescerende farvestof, som beskrevet i protokol afsnit 4. zPDX'er blev derefter med succes etableret ved implantation af et stykke tumor i perivitellinerummet af 2 dpf zebrafiskembryoner, som beskrevet i protokolafsnit 5. Som beskrevet i protokolafsnit 6 blev zPDX'erne yderligere screenet for at identificere kemoterapifølsomhedsprofiler...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Prækliniske modeller sigter mod at fremme viden om kræftbiologi og forudsige behandlingseffektivitet. Dette papir beskriver dannelsen af zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater (zPDX'er) med tumorvævsfragmenter. zPDX'erne blev behandlet med kemoterapi, hvis terapeutiske virkning blev vurderet med hensyn til celleapoptose i det transplanterede væv.

Etablering af zebrafisk patientafledte xenotransplantater fra kræft i bugspytkirtlen til kemosensitivitetstest

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Zebrafisk patientafledt xenograft er en kraftfuld præklinisk model til at forudsige kræftpatienters kemosensitivitetsprofil in vivo. Protokollen beskriver genereringen af modellen startende fra en patient kirurgisk prøve. Ved at xenogpode et lille vævsfragment i stedet for at isolere celler i zebrafiskembryoner er det muligt at opretholde tumormikromiljøet, som er det afgørende skridt for tumorprogression og respons på kemoterapi.Den store fordel ved modellen er givet ved dens potentiale til at forudsige patientens prognose inden for en klinisk relevant tidsramme på kun en uge, der fungerer som et værktøj til personlig medicin. Begynd prøvebehandlingen ved at vaske hele tumorvævet opsamlet fra patienten med fem ml frisk tumormedium. Den pipetteres op og ned 10 gange med en Pasteur-pipette af plast.Aspirer forsigtigt og kassér vaskemediet, inden du gentager vasken tre gange. Dyp prøven i en til to ml frisk tumormedium. Skær tumorprøven i en til to millimeter terningstykker ved hjælp af et skalpelblad, og læg dem derefter i et sterilt fem milliliter plastrør med tumormedium.Når du har indstillet McIlwain Tissue Chopper til 100 mikrometer tykkelse, skal du placere tumorstykkerne på helikopterens cirkulære plastbord og hugge dem. Drej bordet 90 grader, og gentag hakningen. Saml de hakkede tumorfragmenter i et 15 ml plastrør indeholdende tumormediet.De hakkede tumorfragmenter centrifugeres ved 300 G i tre minutter, før supernatanten suges op og kasseres. Inkuber fragmenterne med cellesporingsopløsningen eller med en alternativ fluorescerende celletracker såsom CM-DiI eller Deep Red i 30 minutter i et 37 grader Celsius vandbad. Under inkubation resuspenderes fragmenterne forsigtigt hvert 10. minut.Ved afslutningen af farvningen fjernes ethvert frit farvestof ved at tilsætte et tumormedium suppleret med mindst 1% protein. Lydstyrken vil være fem gange farvningsvolumenet. Fragmenterne centrifugeres ved 300 G i tre minutter, og supernatanten kasseres.Tilsæt en milliliter Dulbeccos fosfatbufferede saltvand eller DPBS, og gentag dette vasketrin tre gange. Når du er færdig, suspenderes fragmenterne i fem ml DPBS i en 60 millimeter petriskål. For at etablere de zebrafiskbaserede patientafledte xenotransplantater eller zPDX skal du bedøve de to dage efter befrugtningsembryoner.I en petriskål med tre agarosecylindre skal du lægge et zebrafiskembryo på en cylinder, der udsætter den ene side. Fjern overskydende opløsning for at holde embryoet i en tynd film. Brug sterile tang til at overføre stykket farvede tumorvævsfragmenter fra en 60 millimeter petriskål til 1% agarosestøtten, hvor embryoet lægges.Tag derefter vævet op og læg det på embryoblommen, før du skubber det ind i perivitellinerummet ved hjælp af mikronålen til varmetrukket glas. Tilsæt nogle dråber E3 1% penicillin streptomycin til embryoet for at bringe det tilbage i væsken. Efter gentagelse af implantationen af tumorvæv i alle embryonerne fjernes agarosestøtterne fra petriskålen og inkuberer embryonerne ved 35 grader Celsius.To timer efter implantationen kontrolleres embryonerne for de korrekte xenotransplantater med positiv farvning ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop. Kassér døde embryoner og embryonerne uden tumorfragmenterne helt inde i perivitellinerummet. Når det er gjort, fordeles embryonerne tilfældigt i seks multibrøndplader, ligeligt opdelt i grupper i henhold til forsøgsplanen.Fortynd stofferne ved at blande dem i E3 1% pen-strep for at forberede FOLFOXIRI-cocktailen. Efter to timers implantation skal du fjerne mediet fra hver brønd og tilføje lægemiddelcocktailen. Placer embryonerne i inkubatoren ved 35 grader Celsius i tre dage med daglige ændringer af mediet for at forny lægemidlerne.Til billeddannelse skal du tage billeder under et 40X mål for det konfokale mikroskop. Brug opløsningen på 1024 x 512 pixels med en Z-afstand på fem mikrometer. Hele monteringsbillederne af zPDX'er erhvervet for at analysere apoptose påvist i cyano viste, at den kombinerede terapi øgede celleapoptose sammenlignet med kontrolgruppegruppen.Casestudiet rapporterede, at en statistisk signifikant stigning i fraktionen af apoptotiske celler i implanterede xenotransplantater blev identificeret for den FOLFOXIRI-behandlede gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Protokollen viser et eksempel ved hjælp af kræft i bugspytkirtlen, men zebrafisk patientafledte xenotransplantater kan etableres fra forskellige typer kræft. Da modellen desuden har en lav etisk indvirkning, kan den let udnyttes til in vivo-screening af nye lægemidler.Metoden er teknisk udfordrende og kræver en ekspertoperatør. Tidligere ekspertise i zebrafiskembryomanipulation og mikroinjektion vil fremskynde træningen af teknikken.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Etablering af en primær kultur af Patient-afledte bløddelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-afledt heterogene xenograft model af kræft i bugspytkirtlen ved hjælp af Zebrafish larver som værter for sammenlignende Lægemiddelvurdering

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering af patient-afledte bugspytkirtel ductal adenokarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test målrettede behandlinger i kræft ved hjælp af strukturel dna ændringsanalyse og patient-afledte Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedygtighed for Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer af patient-afledte Xenografts i en perfunderet microfluidic platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...