Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי Fondazione Pisa (פרויקט 114/16). המחברים רוצים להודות לרפלה גאטה מהיחידה להיסטופתולוגיה של Azienda Ospedaliera Pisana על בחירת דגימת המטופל והתמיכה הפתולוגית. אנו מודים גם לאלסיה גלנטה על התמיכה הטכנית בניסויים. מאמר זה מבוסס על עבודה של COST Action TRANSPAN, CA21116, הנתמכת על ידי COST (שיתוף פעולה אירופי במדע וטכנולוגיה).

משרד בריאות הציבור האיטלקי אישר את כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים, בהתאם לדירקטיבה 2010/63/EU בנושא שימוש וטיפול בבעלי חיים. ועדת האתיקה המקומית אישרה את המחקר, תחת מספר רישום 70213. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים המעורבים. לפני שמתחילים, יש להכין את כל הפתרונות והציוד (סעיף 1) ולחצות את הדגים (סעי?...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

מודלים In vivo בחקר הסרטן מספקים כלים שלא יסולא בפז להבנת הביולוגיה של הסרטן ולחיזוי התגובה לטיפול בסרטן. כיום, מודלים שונים in vivo זמינים, למשל, בעלי חיים מהונדסים גנטית (עכברים מהונדסים ונוקאאוט) או xenografts שמקורם בחולה מתאים ראשוניים אנושיים. למרות תכונות אופטימליות רבות, לכל אחד מהם ...

אחת הבעיות של חקר הסרטן הקליני היא שסרטן אינו מחלה אחת, אלא מגוון מחלות שונות שיכולות להתפתח עם הזמן, ודורשות טיפולים ספציפיים בהתאם למאפייני הגידול עצמו והחולה1. כתוצאה מכך, האתגר הוא לנוע לעבר מחקר סרטן מוכוון מטופל, על מנת לזהות אסטרטגיות מותאמות אישית חדשות לחיזוי מוקדם של תוצאות הטיפול בסרטן2. זה רלוונטי במיוחד עבור אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), שכן הוא נחשב לסרטן קשה לטיפול, עם שיעור הישרדות של 5 שנים של 11%3.
האבחנה המאוחרת, ההתקדמות המהירה והיעדר טיפולים יעילים נותרו הבעיות הקליניות הדחופות ביותר של PDAC. האתגר העיקרי הוא, אם כן, למדל את המטופל ולזהות סמנים ביולוגיים שניתן ליישם במרפאה כדי לבחור את הטיפול היעיל ביותר בקנה אחד עם רפואה מותאמת אישית 4,5,6. עם הזמן, גישות חדשות הוצעו למדל מחלות סרטן: אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) וקסנוגרפטים שמקורם בעכבר (mPDXs) שמקורם ברקמת גידול אנושית. הם שימשו כדי לשחזר את המחלה כדי לחקור את התגובה ואת ההתנגדות לטיפול, כמו גם הישנות המחלה 7,8,9.
באופן דומה, העניין במודלים מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה xenograft (zPDX) גדל, הודות למאפיינים הייחודיים והמבטיחים שלהם10, המייצגים כלי מהיר וזול לחקר הסרטן11,12. מודלים של zPDX דורשים רק דגימת גידול קטנה, מה שהופך את ההקרנה בתפוקה גבוהה של כימותרפיה לאפשרית13. הטכניקה הנפוצה ביותר המשמשת למודלים של zPDX מבוססת על עיכול דגימה מלא והשתלה של אוכלוסיות התאים הראשוניות, אשר משחזרת חלקית את הגידול, אך יש לה את החסרונות של היעדר מיקרו-סביבה של הגידול ותקשורת צולבת בין תאים ממאירים ובריאים14.
עבודה זו מראה כיצד zPDX יכול לשמש כמודל פרה-קליני לזיהוי פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן הלבלב. האסטרטגיה רבת הערך מקלה על תהליך הקסנוגרפט, שכן אין צורך בהרחבת תאים, מה שמאפשר את האצת ההקרנה הכימותרפית. כוחו של המודל הוא שכל מרכיבי המיקרו-סביבה נשמרים כפי שהם ברקמת הסרטן החולה, כי, כידוע, התנהגות הגידול תלויה ביחסי הגומלין ביניהם15,16. זה עדיף מאוד על פני שיטות חלופיות בספרות, שכן ניתן לשמר את ההטרוגניות של הגידול ולתרום לשיפור יכולת החיזוי של תוצאת הטיפול והישנות באופן ספציפי למטופל, ובכך לאפשר שימוש במודל zPDX בניסויים קליניים משותפים. כתב יד זה מתאר את השלבים הכרוכים ביצירת מודל zPDX, החל מכריתה של גידול בחולה וטיפול בו כדי לנתח את התגובה לכימותרפיה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

סרטן הוא אחד הגורמים העיקריים למוות ברחבי העולם, והשכיחות של סוגים רבים של סרטן ממשיכה לעלות. התקדמות רבה הושגה במונחים של סינון, מניעה וטיפול; עם זאת, מודלים פרה-קליניים המנבאים את פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן עדיין חסרים. כדי למלא את הפער הזה, פותח ואומת מודל קסנוגרפט שמקורו במטופל in vivo . המודל התבסס על עוברים של דגי זברה (Danio rerio) יומיים לאחר ההפריה, אשר שימשו כמושתלים של שברי קסנוגרפט של רקמת גידול שנלקחו מדגימה כירורגית של מטופל. 
ראוי גם לציין כי דגימות ביופטיות לא עוכלו או התפרקו, על מנת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, שהיא קריטית מבחינת ניתוח התנהגות הגידול והתגובה לטיפול. הפרוטוקול מפרט שיטה לביסוס xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם במטופל (zPDXs) מכריתה כירורגית ראשונית של גידול מוצק. לאחר הקרנה על ידי אנטומופתולוג, הדגימה מנותחת באמצעות להב אזמל. רקמת נמק, כלי דם או רקמת שומן מוסרים ולאחר מכן קצוצים לחתיכות 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ. 
לאחר מכן החלקים מסומנים באופן פלואורסצנטי ומושתלים בחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה. ניתן לעבד מספר רב של עוברים בעלות נמוכה, מה שמאפשר ניתוח in vivo בתפוקה גבוהה של הרגישות הכימותרפית של zPDXs למספר תרופות אנטי-סרטניות. תמונות קונפוקליות נרכשות באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את רמות אפופטוטיקה המושרות על ידי טיפול כימותרפי בהשוואה לקבוצת הביקורת. הליך xenograft יש יתרון זמן משמעותי, שכן ניתן להשלים אותו ביום אחד, מתן חלון זמן סביר לבצע סינון טיפולי עבור ניסויים קליניים משותפים.

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הניסיונית ליצירת zPDXs מאדנוקרצינומה ראשונית של הלבלב האנושי. דגימת גידול נאספת, טחונה ומוכתמת באמצעות צבע פלואורסצנטי, כמתואר בפרוטוקול סעיף 4. לאחר מכן zPDXs הוקמו בהצלחה על ידי השתלת פיסת גידול בחלל הפריביטלין של 2 עוברי דגי זברה dpf, כמתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול. כפי ש?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

xenograft שמקורו בדגי זברה הוא מודל פרה-קליני רב עוצמה לחיזוי פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן in vivo. הפרוטוקול מתאר את יצירת המודל החל מדגימה כירורגית של מטופל. על ידי השתלת מקטע רקמה קטן במקום לבודד תאים לעוברים של דגי זברה, ניתן לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול שהיא השלב המכריע להתקדמות הגידול ולתגובה לכימותרפיה.היתרון הגדול של המודל טמון בפוטנציאל שלו לחזות את הפרוגנוזה של המטופל במסגרת זמן קלינית רלוונטית של שבוע אחד בלבד המשמש ככלי לרפואה מותאמת אישית. התחל את עיבוד הדגימה על ידי שטיפת רקמת הגידול כולה שנאספה מהמטופל עם חמישה מיליליטר של מדיום גידול טרי. פיפטה אותו למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק.יש לשאוף בזהירות ולהשליך את אמצעי הכביסה לפני שחוזרים על הכביסה שלוש פעמים. לטבול את הדגימה אחד עד שני מיליליטר של מדיום הגידול הטרי. חותכים את דגימת הגידול לחתיכות קובייה של מילימטר עד שניים באמצעות להב אזמל, ולאחר מכן מניחים אותם בצינור פלסטיק סטרילי של חמישה מיליליטר עם תווך גידול.לאחר הגדרת מסוק רקמות McIlwain לעובי 100 מיקרומטר, מניחים את חתיכות הגידול על שולחן הפלסטיק העגול של המסוק וקוצצים אותם. סובבו את השולחן ב-90 מעלות וחזרו על החיתוך. אספו את שברי הגידול הקצוצים בצינור פלסטיק של 15 מיליליטר המכיל את תווך הגידול.צנטריפוגו את שברי הגידול הקצוצים ב 300 גרם במשך שלוש דקות לפני שואפים ומשליכים את supernatant. לדגור על השברים עם תמיסת עקבות התא או עם מעקב תאים פלואורסצנטי חלופי כגון CM-DiI או אדום עמוק במשך 30 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. במהלך הדגירה, בעדינות להשעות מחדש את השברים כל 10 דקות.בסיום הצביעה, יש להסיר כל צבע חופשי על ידי הוספת מדיום גידול בתוספת לפחות 1% חלבון. הנפח יהיה פי חמישה מנפח הצביעה. צנטריפוגו את השברים ב-300 גרם למשך שלוש דקות והשליכו את הסופרנטנט.הוסיפו מיליליטר אחד של מלח חוצץ פוספט או DPBS של Dulbecco וחזרו על שלב השטיפה שלוש פעמים. לאחר שתסיים, תשהה את השברים בחמישה מיליליטר של DPBS בצלחת פטרי 60 מ"מ. כדי לבסס את הקסנוגרפטים או zPDX המבוססים על דגי זברה, יש להרדים את העוברים יומיים לאחר ההפריה.בצלחת פטרי בעלת שלושה גלילי אגרוז, הניחו עובר דג זברה על גליל החושף צד אחד. הסר את התמיסה העודפת כדי לשמור על העובר בסרט דק. בעזרת מלקחיים סטריליים, מעבירים את פיסת שברי רקמת הגידול המוכתמת מצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ לתמיכה של 1% אגרוז שבה מניחים את העובר.לאחר מכן להרים את הרקמה ולהניח אותו על חלמון העובר לפני דחיפתו לתוך החלל perivitelline באמצעות מיקרו-מחט זכוכית משוך חום. הוסף כמה טיפות של E3 1% פניצילין סטרפטומיצין לעובר כדי להחזיר אותו לתוך הנוזל. לאחר חזרה על השתלת רקמת הגידול בכל העוברים, יש להסיר את תמיכות האגרוז מצלחת הפטרי ולדגור על העוברים בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס.שעתיים לאחר ההשתלה, בדוק את העוברים עבור xenografts הנכון עם כתמים חיוביים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. יש להשליך את העוברים המתים ואת העוברים ללא שברי הגידול לחלוטין בתוך החלל הפריביטלי. לאחר שסיימו, חלקו באופן אקראי את העוברים בשש צלחות מרובות בארות, המחולקות באופן שווה לקבוצות על פי תוכנית הניסוי.לדלל את התרופות על ידי ערבוב אותם לתוך E3 1% pen-strep כדי להכין את קוקטייל FOLFOXIRI. לאחר שעתיים של השתלה, להסיר את המדיה מכל באר ולהוסיף את קוקטייל התרופה. הכניסו את העוברים לאינקובטור בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים עם שינויים יומיים של המדיום כדי לחדש את התרופות.להדמיה, צלם תמונות תחת מטרה של 40X של המיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש ברזולוציה של 1024 על 512 פיקסלים עם מרווח Z של חמישה מיקרומטרים. כל תמונות ההר של zPDXs שנרכשו כדי לנתח את האפופטוזיס שזוהה בציאנו הראו כי הטיפול המשולב הגביר את אפופטוזיס התא בהשוואה לקבוצת הביקורת.מחקר המקרה דיווח כי זוהתה עלייה מובהקת סטטיסטית בשבר התאים האפופטוטיים בקסנוגרפטים מושתלים בקבוצה שטופלה ב- FOLFOXIRI בהשוואה לקבוצת הביקורת. הפרוטוקול מציג דוגמה באמצעות רקמת סרטן הלבלב, אך ניתן לקבוע קסנוגרפטים שמקורם בדגי זברה מסוגים שונים של סרטן. בנוסף, מכיוון שלמודל יש השפעה אתית נמוכה, הוא ניתן לניצול בקלות לסינון in vivo של תרופות חדשות.השיטה מאתגרת מבחינה טכנית ודורשת מפעיל מומחה. מומחיות קודמת במניפולציה של עוברים בדגי זברה ובמיקרו-הזרקה תאיץ את אימון הטכניקה.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

הקמתה של תרבות העיקרי של סרקומה של רקמות רכות, נגזר החולה

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

מטופל-נגזר הטרוגנית מודל Xenograft של סרטן הלבלב באמצעות הזחלים Zebrafish כפונדקאים עבור הערכת סמים השוואתי

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

בידוד ואפיון של החולה-הלבלב הנגזר דוטל אדנוקרצינומה מודלים אורגאיד

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

בדיקת טיפולים ייעודיים בסרטן באמצעות ניתוח שינוי DNA מבנית והמטופל נגזר Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

קיימות משופרת עבור תרבויות הידרוג'ל 3D Ex vivo של Xenografts נגזר המטופל בפלטפורמה מיקרופלויד perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...