Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av Fondazione Pisa (prosjekt 114/16). Forfatterne vil gjerne takke Raffaele Gaeta fra Histopathology Unit of Azienda Ospedaliera Pisana for pasientprøvevalg og patologistøtte. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske støtten i eksperimentene. Denne artikkelen er basert på arbeid fra COST Action TRANSPAN, CA21116, støttet av COST (European Cooperation in Science and Technology).

Det italienske folkehelsedepartementet godkjente alle dyreforsøkene som ble beskrevet, i samsvar med direktiv 2010/63/EU om bruk og stell av dyr. Den lokale etiske komiteen godkjente studien, under registreringsnummer 70213. Informert samtykke ble innhentet fra alle involverte personer. Før start skal alle løsninger og utstyr klargjøres (del 1) og fisken krysses (seksjon 2).
1. Klargjøring av løsninger og utstyr
MERK: Se tabell 1</strong...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

In vivo-modeller innen kreftforskning gir uvurderlige verktøy for å forstå kreftbiologi og forutsi kreftbehandlingsresponsen. For tiden er forskjellige in vivo-modeller tilgjengelige, for eksempel genetisk modifiserte dyr (transgene og knockoutmus) eller pasientavledede xenotransplantater fra humane primære celler. Til tross for mange optimale funksjoner, har hver og en forskjellige begrensninger. Spesielt mangler de nevnte modellene en pålitelig måte å etterligne pasientens tumorvevsmikromiljø ...

Et av problemene med klinisk kreftforskning er at kreft ikke er en enkelt sykdom, men en rekke forskjellige sykdommer som kan utvikle seg over tid, og krever spesifikke behandlinger avhengig av egenskapene til selve svulsten og pasienten1. Følgelig er utfordringen å bevege seg mot pasientorientert kreftforskning, for å identifisere nye personlige strategier for tidlig prediksjon av kreftbehandlingsresultater2. Dette er spesielt relevant for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC), siden det regnes som en vanskelig å behandle kreft, med en 5-års overlevelsesrate på 11%3.
Den sene diagnosen, rask progresjon og mangel på effektive terapier forblir de mest presserende kliniske problemene med PDAC. Hovedutfordringen er derfor å modellere pasienten og identifisere biomarkører som kan brukes i klinikken for å velge den mest effektive terapien i tråd med persontilpasset medisin 4,5,6. Over tid har nye tilnærminger blitt foreslått for å modellere kreftsykdommer: pasientavledede organoider (PDOer) og muspatientavledede xenotransplantater (mPDX) stammer fra en kilde til humant tumorvev. De har blitt brukt til å reprodusere sykdommen for å studere responsen og motstanden mot terapi, samt sykdomsfall 7,8,9.
På samme måte har interessen for sebrafiskbaserte pasientavledede xenograftmodeller (zPDX) økt, takket være deres unike og lovende egenskaper10, som representerer et raskt og billig verktøy for kreftforskning11,12. zPDX-modeller krever bare en liten tumorprøvestørrelse, noe som gjør høy gjennomstrømningsscreening av kjemoterapi mulig13. Den vanligste teknikken som brukes til zPDX-modeller er basert på fullstendig prøvefordøyelse og implantasjon av de primære cellepopulasjonene, som delvis reproduserer svulsten, men har ulempene med mangel på tumormikromiljø og crosstalk mellom ondartede og friske celler14.
Dette arbeidet viser hvordan zPDX kan brukes som en preklinisk modell for å identifisere kjemosensitivitetsprofilen til pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Den verdifulle strategien letter xenograftprosessen, siden det ikke er behov for celleutvidelse, noe som muliggjør akselerasjon av kjemoterapiscreeningen. Modellens styrke er at alle mikromiljøkomponentene opprettholdes som de er i pasientens kreftvev, fordi, som det er kjent, avhenger svulstens oppførsel av samspillet15,16. Dette er svært gunstig i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er mulig å bevare tumorheterogeniteten og bidra til å forbedre forutsigbarheten av behandlingsutfall og tilbakefall på en pasientspesifikk måte, slik at zPDX-modellen kan brukes i kokliniske studier. Dette manuskriptet beskriver trinnene som er involvert i å lage zPDX-modellen, som starter med et stykke pasienttumorreseksjon og behandler det for å analysere responsen på kjemoterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

Kreft er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og forekomsten av mange typer kreft fortsetter å øke. Mye fremgang har blitt gjort når det gjelder screening, forebygging og behandling; Imidlertid mangler fortsatt prekliniske modeller som forutsier kjemosensitivitetsprofilen til kreftpasienter. For å fylle dette gapet ble en in vivo pasientderivert xenograftmodell utviklet og validert. Modellen var basert på sebrafisk (Danio rerio) embryoer 2 dager etter befruktning, som ble brukt som mottakere av xenograftfragmenter av tumorvev tatt fra pasientens kirurgiske prøve. 
Det er også verdt å merke seg at bioptiske prøver ikke ble fordøyd eller disaggregert for å opprettholde tumormikromiljøet, noe som er avgjørende når det gjelder å analysere tumoradferd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode for å etablere sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) fra primær solid tumor kirurgisk reseksjon. Etter screening av en anatomopatolog, blir prøven dissekert ved hjelp av et skalpellblad. Nekrotisk vev, kar eller fettvev fjernes og hakkes deretter i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm stykker. 
Bitene blir deretter fluorescerende merket og xenotransplantert inn i perivitellinerommet til sebrafiskembryoer. Et stort antall embryoer kan behandles til en lav kostnad, noe som muliggjør høy gjennomstrømning in vivo-analyser av kjemosensitiviteten til zPDX for flere kreftmedisiner. Konfokale bilder blir rutinemessig anskaffet for å oppdage og kvantifisere de apoptotiske nivåene indusert av kjemoterapibehandling sammenlignet med kontrollgruppen. Xenograft-prosedyren har en betydelig tidsfordel, siden den kan fullføres på en enkelt dag, noe som gir et rimelig tidsvindu for å utføre en terapeutisk screening for samtidige kliniske studier.

Denne protokollen beskriver den eksperimentelle tilnærmingen for å etablere zPDX fra primært humant adenokarsinom i pankreas. En tumorprøve ble samlet, hakket og farget med fluorescerende fargestoff, som beskrevet i protokoll avsnitt 4. zPDX ble deretter vellykket etablert ved implantasjon av et stykke tumor i perivitellinerommet til 2 dpf sebrafiskembryoer, som beskrevet i protokollavsnitt 5. Som beskrevet i protokollavsnitt 6 ble zPDX-ene ytterligere screenet for å identifisere kjemoterapisensitivitetsprofilene ti...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Prekliniske modeller tar sikte på å fremme kunnskapen om kreftbiologi og forutsi behandlingseffekt. Denne artikkelen beskriver genereringen av sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) med tumorvevsfragmenter. ZPDX-ene ble behandlet med kjemoterapi, hvis terapeutiske effekt ble vurdert med hensyn til celleapoptose i det transplanterte vevet.

Etablering av sebrafisk pasientderiverte xenotransplantater fra bukspyttkjertelkreft for kjemosensitivitetstesting

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Zebrafish pasientderivert xenograft er en kraftig preklinisk modell for å forutsi kjemosensitivitetsprofil for kreftpasienter in vivo. Protokollen beskriver genereringen av modellen med utgangspunkt i en pasient kirurgisk prøve. Ved å xenografere et lite vevsfragment i stedet for å isolere celler i sebrafiskembryoer, er det mulig å opprettholde tumormikromiljøet som er det avgjørende trinnet for tumorprogresjon og responsen på kjemoterapi.Den store fordelen med modellen er gitt av potensialet til å forutsi pasientens prognose i en klinisk relevant tidsramme på bare en uke, og fungerer som et verktøy for personlig medisin. Begynn prøvebehandlingen ved å vaske hele tumorvevet samlet fra pasienten med fem milliliter friskt tumormedium. Pipetter den opp og ned 10 ganger med en plastisk Pasteur-pipette.Aspirer forsiktig og kast vaskemediet før du gjentar vasken tre ganger. Fordyp prøven i en til to milliliter friskt tumormedium. Klipp svulstprøven i en til to millimeter kubebiter ved hjelp av et skalpellblad, og legg dem deretter i et sterilt fem milliliter plastrør med tumormedium.Etter å ha satt McIlwain Tissue Chopper til 100 mikrometer tykkelse, plasser tumorbitene på det sirkulære plastbordet på helikopteret og hakk dem. Roter bordet 90 grader og gjenta hakkingen. Samle de hakkede tumorfragmentene i et 15 milliliter plastrør som inneholder tumormediet.Sentrifuger de hakkede tumorfragmentene ved 300 G i tre minutter før du aspirerer og kaster supernatanten. Inkuber fragmentene med cellesporløsningen eller med en alternativ fluorescerende cellesporing som CM-DiI eller Deep Red i 30 minutter i et 37 grader Celsius vannbad. Under inkubasjon, resuspender fragmentene forsiktig hvert 10. minutt.På slutten av fargingen, fjern ethvert fritt fargestoff ved å tilsette et tumormedium supplert med minst 1% protein. Volumet vil være fem ganger fargevolumet. Sentrifuger fragmentene ved 300 G i tre minutter og kast supernatanten.Tilsett en milliliter Dulbecco's Phosphate Buffered Saline eller DPBS og gjenta dette vasketrinnet tre ganger. Når du er ferdig, suspender fragmentene i fem milliliter DPBS i en 60 millimeter petriskål. For å etablere sebrafiskbaserte pasientavledede xenotransplantater eller zPDX, bedøve de to dagene etter befruktningsembryoer.I en petriskål med tre agarosesylindere, legg et sebrafiskembryo på en sylinder som blottlegger den ene siden. Fjern overflødig løsning for å holde embryoet i en tynn film. Ved hjelp av steril tang, overfør stykket farget tumorvevfragmenter fra en 60 millimeter petriskål til 1% agarosestøtten der embryoet legges.Deretter plukker du opp vevet og legger det på embryoplommen før du skyver det inn i perivitellinerommet ved hjelp av den varmetrukne glassmikronedlen. Legg til noen dråper E3 1% penicillin streptomycin til embryoet for å bringe det tilbake i væsken. Etter å ha gjentatt implantasjonen av tumorvev i alle embryoer, fjern agarosestøttene fra petriskålen og inkuber embryoene ved 35 grader Celsius.To timer etter implantasjon, sjekk embryoene for de riktige xenotransplantatene med positiv farging ved hjelp av et fluorescerende stereomikroskop. Kast bort døde embryoer og embryoer uten tumorfragmentene helt inne i perivitellinerommet. Når du er ferdig, fordel embryoene tilfeldig i seks flerbrønnsplater, like delt inn i grupper i henhold til eksperimentell plan.Fortynn stoffene ved å blande dem i E3 1% pen-streptokokker for å forberede FOLFOXIRI cocktail. Etter to timers implantasjon, fjern media fra hver brønn og legg til stoffcocktailen. Plasser embryoene i inkubatoren ved 35 grader Celsius i tre dager med daglige endringer av mediet for å fornye legemidlene.For avbildning, ta bilder under et 40X mål for konfokalmikroskopet. Bruk oppløsningen på 1024 x 512 piksler med en Z-avstand på fem mikrometer. Hele monteringsbildene av zPDX-er som ble oppnådd for å analysere apoptosen oppdaget i cyano, viste at den kombinerte terapien økte celleapoptose sammenlignet med kontrollgruppen.Kasusstudien rapporterte at en statistisk signifikant økning i fraksjonen av apoptotiske celler i implanterte xenotransplantater ble identifisert for FOLFOXIRI-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Protokollen viser et eksempel ved bruk av kreftvev i bukspyttkjertelen, men sebrafiskpasientavledede xenotransplantater kan etableres fra ulike typer kreft. I tillegg, siden modellen har lav etisk effekt, er den lett utnyttbar for in vivo screening av nye legemidler.Metoden er teknisk utfordrende og krever en ekspertoperatør. Tidligere ekspertise innen sebrafiskembryomanipulasjon og mikroinjeksjon vil fremskynde opplæringen av teknikken.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Merking av brystkreftpasient-avledet xenografter med Spor Reporters for tumorvekst og metastase Studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Etablering av en primære kultur for pasient-avledede bløtvev sarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Pasient-avledet heterogen Xenograft modell av bukspyttkjertelen Cancer bruke sebrafisk larver som verter for sammenlignende Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering og karakterisering av pasient-avledet bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testing av målrettede behandlinger mot kreft ved hjelp av strukturell DNA-endringsanalyse og pasientavledede Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Forbedret levedyktighet for Ex vivo 3D hydrogelkulturer av pasientavledede Xenografts i en perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...