Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pela Fondazione Pisa (projeto 114/16). Os autores agradecem a Raffaele Gaeta, da Unidade de Histopatologia da Azienda Ospedaliera Pisana, pela seleção da amostra e apoio anatomopatológico. Agradecemos também a Alessia Galante pelo suporte técnico nos experimentos. Este artigo baseia-se no trabalho da COST Action TRANSPAN, CA21116, apoiado pela COST (Cooperação Europeia em Ciência e Tecnologia).

O Ministério da Saúde Pública italiano aprovou todas as experiências com animais descritas, em conformidade com a Diretiva 2010/63/UE relativa à utilização e aos cuidados a prestar aos animais. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética local, sob o registro número 70213. Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos envolvidos. Antes de começar, todas as soluções e equipamentos devem ser preparados (secção 1) e os peixes devem ser cruzados (secção 2).
1. Prepa...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. 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Modelos in vivo na pesquisa do câncer fornecem ferramentas inestimáveis para entender a biologia do câncer e prever a resposta ao tratamento do câncer. Atualmente, diferentes modelos in vivo estão disponíveis, por exemplo, animais geneticamente modificados (camundongos transgênicos e knockout) ou xenoenxertos derivados de pacientes a partir de células primárias humanas. Apesar de muitas características ideais, cada um tem várias limitações. Em particular, os modelos acima mencionados carece...

Um dos problemas da pesquisa clínica do câncer é que o câncer não é uma doença única, mas uma variedade de doenças diferentes que podem evoluir ao longo do tempo, exigindo tratamentos específicos dependendo das características do próprio tumor e do paciente1. Consequentemente, o desafio é avançar em direção à pesquisa do câncer orientada ao paciente, a fim de identificar novas estratégias personalizadas para a predição precoce dos resultados do tratamento do câncer2. Isso é particularmente relevante para o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), por ser considerado um câncer de difícil tratamento, com sobrevida em 5 anos de 11%3.
O diagnóstico tardio, a rápida progressão e a falta de terapias eficazes continuam sendo os problemas clínicos mais prementes da ADP. O principal desafio é, portanto, modelar o paciente e identificar biomarcadores que possam ser aplicados na clínica para selecionar a terapia mais eficaz de acordo com a medicina personalizada 4,5,6. Ao longo do tempo, novas abordagens têm sido propostas para modelar doenças oncológicas: organoides derivados do paciente (PDOs) e xenoenxertos derivados do paciente de camundongo (mPDXs) originados de uma fonte de tecido tumoral humano. Eles têm sido usados para reproduzir a doença para estudar a resposta e a resistência à terapia, bem como a recorrência da doença 7,8,9.
Da mesma forma, o interesse em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (zPDX) baseado em peixe-zebra tem aumentado, graças às suas características únicas epromissoras10, representando uma ferramenta rápida e de baixo custo para a pesquisa docâncer11,12. Os modelos zPDX requerem apenas um pequeno tamanho de amostra tumoral, o que torna viável o rastreamento de quimioterapiaem alto rendimento13. A técnica mais comumente utilizada para modelos zPDX baseia-se na digestão completa da amostra e implantação das populações celulares primárias, que reproduz parcialmente o tumor, mas tem como desvantagens a falta de microambiente tumoral e crosstalk entre células malignas esaudáveis14.
Este trabalho mostra como zPDXs podem ser usados como um modelo pré-clínico para identificar o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer de pâncreas. A valiosa estratégia facilita o processo de xenoenxerto, uma vez que não há necessidade de expansão celular, permitindo a aceleração da triagem quimioterápica. A força do modelo é que todos os componentes do microambiente são mantidos como estão no tecido do paciente com câncer, pois, como se sabe, o comportamento do tumor depende de sua interação15,16. Isso é altamente favorável em relação aos métodos alternativos na literatura, pois é possível preservar a heterogeneidade tumoral e contribuir para melhorar a previsibilidade do resultado do tratamento e a recidiva de forma paciente-específica, permitindo que o modelo zPDX seja utilizado em ensaios coclínicos. Este artigo descreve as etapas envolvidas na confecção do modelo zPDX, começando com um pedaço de ressecção tumoral do paciente e tratando-o para analisar a resposta à quimioterapia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e a incidência de muitos tipos de câncer continua aumentando. Muito se avançou em termos de rastreio, prevenção e tratamento; no entanto, ainda faltam modelos pré-clínicos que predizem o perfil quimiossensível de pacientes com câncer. Para preencher essa lacuna, um modelo de xenoenxerto derivado do paciente in vivo foi desenvolvido e validado. O modelo foi baseado em embriões de zebrafish (Danio rerio) aos 2 dias pós-fecundação, os quais foram utilizados como receptores de fragmentos de xenoenxerto de tecido tumoral retirados da peça cirúrgica de uma paciente. 
Vale ressaltar também que as amostras bióticas não foram digeridas ou desagregadas, a fim de manter o microambiente tumoral, o que é crucial para analisar o comportamento tumoral e a resposta à terapia. O protocolo detalha um método para estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) baseados em peixe-zebra a partir da ressecção cirúrgica de tumor sólido primário. Após triagem por um anatomopatologista, o espécime é dissecado com lâmina de bisturi. Tecido necrótico, vasos ou tecido adiposo são removidos e, em seguida, picados em pedaços de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm. 
As peças são então marcadas fluorescentemente e xenotransplantadas para o espaço perivitelino de embriões de peixe-zebra. Um grande número de embriões pode ser processado a baixo custo, permitindo análises in vivo de alto rendimento da quimiossensibilidade de zPDXs a múltiplas drogas anticâncer. Imagens confocais são rotineiramente adquiridas para detectar e quantificar os níveis apoptóticos induzidos pelo tratamento quimioterápico em comparação com o grupo controle. O procedimento de xenoenxerto tem uma vantagem de tempo significativa, uma vez que pode ser concluído em um único dia, proporcionando uma janela de tempo razoável para realizar uma triagem terapêutica para ensaios co-clínicos.

Este protocolo descreve a abordagem experimental para o estabelecimento de zPDXs a partir de adenocarcinoma pancreático humano primário. Uma amostra tumoral foi coletada, picada e corada com corante fluorescente, conforme descrito na seção 4 do protocolo. zPDXs foram então estabelecidos com sucesso pela implantação de um pedaço de tumor no espaço perivitelino de 2 embriões de peixe-zebra dpf, conforme descrito na seção 5 do protocolo. Conforme descrito na seção 6 do protocolo, os zPDXs foram rastreados para...

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Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

O xenoenxerto derivado de pacientes com peixe-zebra é um poderoso modelo pré-clínico para predizer o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer in vivo. O protocolo descreve a geração do modelo a partir de uma peça cirúrgica do paciente. Ao xenoenxertar um pequeno fragmento de tecido em vez de isolar células em embriões de peixe-zebra, é possível manter o microambiente tumoral, que é o passo crucial para a progressão do tumor e a resposta à quimioterapia.A grande vantagem do modelo é dada pelo seu potencial de prever o prognóstico do paciente em um período de tempo clinicamente relevante de apenas uma semana, atuando como uma ferramenta para a medicina personalizada. Iniciar o processamento da amostra lavando todo o tecido tumoral coletado do paciente com cinco mililitros de meio tumoral fresco. Pipetar para cima e para baixo 10 vezes usando uma pipeta plástica Pasteur.Aspirar e descartar cuidadosamente o meio de lavagem antes de repetir a lavagem três vezes. Imergir a amostra em um a dois mililitros de meio tumoral fresco. Corte a amostra do tumor em pedaços de cubo de um a dois milímetros usando uma lâmina de bisturi e, em seguida, coloque-os em um tubo plástico estéril de cinco mililitros com meio tumoral.Depois de ajustar o McIlwain Tissue Chopper para 100 micrômetros de espessura, coloque as peças tumorais na mesa circular de plástico do picador e pique-as. Gire a mesa em 90 graus e repita o corte. Coletar os fragmentos de tumor picados em um tubo plástico de 15 mililitros contendo o meio tumoral.Centrifugar os fragmentos tumorais picados a 300 G por três minutos antes de aspirar e descartar o sobrenadante. Incube os fragmentos com a solução de traço celular ou com um rastreador de células fluorescente alternativo, como CM-DiI ou Deep Red, por 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius. Durante a incubação, ressuspenda suavemente os fragmentos a cada 10 minutos.No final da coloração, remova qualquer corante livre adicionando um meio tumoral suplementado com pelo menos 1% de proteína. O volume será cinco vezes o volume de coloração. Centrifugar os fragmentos a 300 G por três minutos e descartar o sobrenadante.Adicione um mililitro de Fosfato Tamponada de Dulbecco ou DPBS e repita esta etapa de lavagem três vezes. Uma vez feito, suspenda os fragmentos em cinco mililitros de DPBS em uma placa de Petri de 60 milímetros. Para estabelecer os xenoenxertos derivados do paciente à base de peixe-zebra ou zPDX, anestesiar os embriões dois dias após a fertilização.Em uma placa de Petri com três cilindros de agarose, coloque um embrião de peixe-zebra em um cilindro expondo um lado. Retire o excesso de solução para manter o embrião em uma película fina. Usando pinças estéreis, transfira o pedaço de fragmentos de tecido tumoral corados de uma placa de Petri de 60 milímetros para o suporte de agarose a 1% onde o embrião é colocado.Em seguida, pegue o tecido e coloque-o na gema do embrião antes de empurrá-lo para o espaço perivitelino usando a microagulha de vidro puxada pelo calor. Adicione algumas gotas de E3 1% penicilina estreptomicina ao embrião para trazê-lo de volta ao líquido. Depois de repetir a implantação do tecido tumoral em todos os embriões, remova os suportes de agarose da placa de Petri e incube os embriões a 35 graus Celsius.Duas horas após a implantação, verificar os embriões quanto aos xenoenxertos corretos com coloração positiva utilizando estereomicroscópio fluorescente. Descarte embriões mortos e os embriões sem fragmentos tumorais completamente dentro do espaço perivitelino. Uma vez feito, distribuir aleatoriamente os embriões em seis placas multipoços, igualmente divididas em grupos de acordo com o plano experimental.Diluir os medicamentos misturando-os em E3 1%pen-strep para preparar o coquetel FOLFOXIRI. Após duas horas de implantação, retire o meio de cada poço e adicione o coquetel de drogas. Coloque os embriões na incubadora a 35 graus Celsius por três dias com trocas diárias do meio para renovar as drogas.Para aquisição de imagens, capturar imagens sob uma objetiva de 40X do microscópio confocal. Use a resolução de 1024 por 512 pixels com um espaçamento Z de cinco micrômetros. As imagens de montagem de zPDXs adquiridas para analisar a apoptose detectada no ciano mostraram que a terapia combinada aumentou a apoptose celular em comparação com o grupo controle.O estudo de caso relatou que um aumento estatisticamente significativo na fração de células apoptóticas em xenoenxertos implantados foi identificado para o grupo tratado com FOLFOXIRI em comparação com o grupo controle. O protocolo mostra um exemplo usando tecido de câncer de pâncreas, mas xenoenxertos derivados de pacientes de peixe-zebra podem ser estabelecidos a partir de diferentes tipos de câncer. Além disso, como o modelo tem baixo impacto ético, é facilmente explorável para triagem in vivo de novos medicamentos.O método é tecnicamente desafiador e requer um operador especializado. A experiência prévia em manipulação de embriões de peixe-zebra e microinjeção acelerará o treinamento da técnica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Pesquisa do câncer

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modelo de Xenoenxerto heterogêneo derivado do paciente do câncer pancreático usando larvas de zebrafish como hospedeiros para avaliação comparativa de fármacos

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...