Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Эта работа финансировалась Фондом Пизы (проект 114/16). Авторы хотели бы поблагодарить Раффаэле Гаэту из отделения гистопатологии Azienda Ospedaliera Pisana за отбор образцов пациентов и поддержку патологии. Мы также благодарим Алессию Галанте за техническую поддержку в экспериментах. Эта статья основана на работе COST Action TRANSPAN, CA21116, при поддержке COST (Европейское сотрудничество в области науки и техники).

Министерство здравоохранения Италии одобрило все описанные эксперименты на животных в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС об использовании животных и уходе за ними. Местный этический комитет одобрил исследование под регистрационным номером 70213. Информированное согласие было получено ?...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

Модели in vivo в исследованиях рака предоставляют бесценные инструменты для понимания биологии рака и прогнозирования ответа на лечение рака. В настоящее время доступны различные модели in vivo , например, генетически модифицированные животные (трансгенные и нокаутные мыши) или кс...

Одна из проблем клинических исследований рака заключается в том, что рак – это не отдельное заболевание, а множество различных заболеваний, которые могут развиваться с течением времени, требуя специфических методов лечения в зависимости от особенностей самой опухолии пациента1. Следовательно, задача состоит в том, чтобы перейти к исследованиям рака, ориентированным на пациента, чтобы определить новые персонализированные стратегии для раннего прогнозирования результатов лечения рака2. Это особенно актуально для аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC), поскольку она считается трудно поддающимся лечению раком с 5-летней выживаемостью 11%3.
Поздняя диагностика, быстрое прогрессирование и отсутствие эффективных методов лечения остаются наиболее актуальными клиническими проблемами PDAC. Таким образом, основная задача состоит в том, чтобы смоделировать пациента и определить биомаркеры, которые могут быть применены в клинике, чтобы выбрать наиболее эффективную терапию в соответствии с персонализированной медициной 4,5,6. Со временем были предложены новые подходы к моделированию раковых заболеваний: органоиды, полученные от пациента (PDO), и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов от мышей (mPDX), происходят из источника опухолевой ткани человека. Они были использованы для воспроизведения заболевания для изучения ответа и резистентности к терапии, а также рецидива заболевания 7,8,9.
Аналогичным образом, возрос интерес к моделям ксенотрансплантатов, полученных из пациентов (zPDX) на основе рыбок данио, благодаря их уникальным и многообещающим характеристикам10, представляющим собой быстрый и недорогой инструмент для исследования рака11,12. Модели zPDX требуют лишь небольшого размера выборки опухоли, что делает возможным высокопроизводительный скрининг химиотерапии13. Наиболее распространенный метод, используемый для моделей zPDX, основан на полном переваривании образца и имплантации первичных клеточных популяций, что частично воспроизводит опухоль, но имеет недостатки в виде отсутствия микроокружения опухоли и перекрестных помех между злокачественными и здоровыми клетками14.
Эта работа показывает, как zPDX могут быть использованы в качестве доклинической модели для определения профиля химиочувствительности пациентов с раком поджелудочной железы. Ценная стратегия облегчает процесс ксенотрансплантата, поскольку нет необходимости в расширении клеток, что позволяет ускорить химиотерапевтический скрининг. Сила модели заключается в том, что все компоненты микроокружения сохраняются в том виде, в каком они находятся в раковой ткани пациента, поскольку, как известно, поведение опухоли зависит от их взаимодействия15,16. Это очень выгодно по сравнению с альтернативными методами в литературе, поскольку можно сохранить гетерогенность опухоли и способствовать улучшению предсказуемости исхода лечения и рецидива в зависимости от конкретного пациента, что позволяет использовать модель zPDX в совместных клинических испытаниях. В этой рукописи описываются этапы, связанные с созданием модели zPDX, начиная с фрагмента резекции опухоли пациента и его лечения для анализа ответа на химиотерапию.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

Рак является одной из основных причин смерти во всем мире, и заболеваемость многими видами рака продолжает расти. Значительный прогресс был достигнут с точки зрения скрининга, профилактики и лечения; Тем не менее, доклинические модели, которые предсказывают профиль химиочувствительности онкологических больных, все еще отсутствуют. Чтобы восполнить этот пробел, была разработана и проверена модель ксенотрансплантата, полученная от пациента in vivo . Модель была основана на эмбрионах рыбок данио-рерио (Danio rerio) через 2 дня после оплодотворения, которые использовались в качестве реципиентов ксенотрансплантатных фрагментов опухолевой ткани, взятых из хирургического образца пациента. 
Также стоит отметить, что биоптические образцы не были переварены или дезагрегированы, чтобы сохранить микроокружение опухоли, что имеет решающее значение с точки зрения анализа поведения опухоли и ответа на терапию. В протоколе подробно описан метод получения ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио после хирургической резекции первичной солидной опухоли. После скрининга у анатомопатолога образец препарируют с помощью лезвия скальпеля. Некротизированная ткань, сосуды или жировая ткань удаляются, а затем измельчаются на кусочки размером 0,3 мм x 0,3 мм x 0,3 мм. 
Затем кусочки флуоресцентно маркируют и ксенотрансплантируют в перивителлиновое пространство эмбрионов рыбок данио. Большое количество эмбрионов может быть обработано с низкими затратами, что позволяет проводить высокопроизводительный анализ in vivo химиочувствительности zPDX к нескольким противоопухолевым препаратам. Конфокальные изображения обычно получаются для обнаружения и количественной оценки уровней апоптоза, вызванных химиотерапией, по сравнению с контрольной группой. Процедура ксенотрансплантата имеет значительное преимущество во времени, поскольку она может быть завершена за один день, что обеспечивает разумное временное окно для проведения терапевтического скрининга для совместных клинических испытаний.

Этот протокол описывает экспериментальный подход к установлению zPDX из первичной аденокарциномы поджелудочной железы человека. Образец опухоли собирали, измельчали и окрашивали с использованием флуоресцентного красителя, как описано в разделе протокола 4. Затем zPDX были успешно устан?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Доклинические модели направлены на расширение знаний о биологии рака и прогнозирование эффективности лечения. В этой статье описывается генерация ксенотрансплантатов пациента (zPDX) на основе рыбок данио-рерио с фрагментами опухолевой ткани. Лечение zPDX проводили химиотерапией, терапевтический эффект которой оценивали с точки зрения клеточного апоптоза трансплантированной ткани.

Создание ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с рыбками данио, из рака поджелудочной железы для тестирования на химиочувствительность

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Ксенотрансплантат, полученный от пациентов с рыбками данио, является мощной доклинической моделью для прогнозирования профиля химиочувствительности онкологических больных in vivo. Протокол описывает генерацию модели, начиная с хирургического образца пациента. Ксенотрансплантируя небольшой фрагмент ткани, а не изолируя клетки в эмбрионы рыбок данио, можно поддерживать микроокружение опухоли, что является решающим шагом для прогрессирования опухоли и ответа на химиотерапию.Большим преимуществом модели является ее способность предсказывать прогноз пациента в клинически значимые сроки всего за одну неделю, выступая в качестве инструмента для персонализированной медицины. Начните обработку образца с промывания всей опухолевой ткани, собранной у пациента, пятью миллилитрами свежей опухолевой среды. Проведите пипеткой вверх и вниз 10 раз с помощью пластиковой пипетки Пастера.Тщательно аспирируйте и выбросьте моющее средство, прежде чем повторить стирку три раза. Погрузите образец в один-два миллилитра свежей опухолевой среды. Разрежьте образец опухоли на кусочки кубика размером от одного до двух миллиметров с помощью лезвия скальпеля, а затем поместите их в стерильную пятимиллилитровую пластиковую пробирку с опухолевой средой.Установив измельчитель тканей McIlwain на толщину 100 микрометров, поместите кусочки опухоли на круглый пластиковый стол измельчителя и измельчите их. Поверните стол на 90 градусов и повторите измельчение. Соберите измельченные фрагменты опухоли в 15-миллилитровую пластиковую пробирку, содержащую опухолевую среду.Центрифугируйте измельченные фрагменты опухоли в дозе 300 г в течение трех минут перед аспирацией и выбросом надосадочной жидкости. Инкубируйте фрагменты с раствором клеточного следа или с помощью альтернативного флуоресцентного трекера клеток, такого как CM-DiI или Deep Red, в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Во время инкубации аккуратно ресуспендируйте фрагменты каждые 10 минут.В конце окрашивания удалите любой свободный краситель, добавив опухолевую среду, дополненную не менее 1% белка. Объем будет в пять раз превышать объем окрашивания. Центрифугируйте фрагменты при 300 г в течение трех минут и выбросьте надосадочную жидкость.Добавьте один миллилитр фосфатного буферизованного физиологического раствора Dulbecco или DPBS и повторите этот этап промывки три раза. После этого суспендируйте фрагменты в пяти миллилитрах DPBS в 60-миллиметровой чашке Петри. Чтобы установить ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, или zPDX, обезболивают эмбрионы через два дня после оплодотворения.В чашке Петри, имеющей три агарозных цилиндра, положите эмбрион рыбки данио-рерио на цилиндр, обнажив одну сторону. Удалите излишки раствора, чтобы сохранить эмбрион в тонкой пленке. С помощью стерильных щипцов перенесите кусочек окрашенных фрагментов опухолевой ткани из 60-миллиметровой чашки Петри в 1%-ную агарозную подложку, где откладывается эмбрион.Затем возьмите ткань и поместите ее на желток эмбриона, прежде чем протолкнуть ее в перивителлиновое пространство с помощью стеклянной микроиглы, вытянутой теплом. Добавьте несколько капель E3 1% пенициллинового стрептомицина в эмбрион, чтобы вернуть его в жидкость. После повторения имплантации опухолевой ткани всем эмбрионам извлеките агарозные подложки из чашки Петри и инкубируйте эмбрионы при 35 градусах Цельсия.Через два часа после имплантации проверьте эмбрионы на наличие правильных ксенотрансплантатов с положительным окрашиванием с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отбрасывайте мертвые эмбрионы и эмбрионы без опухолевых фрагментов полностью внутри перивителлинового пространства. После этого случайным образом распределите эмбрионы по шести многолуночным планшетам, поровну разделенных на группы в соответствии с планом эксперимента.Разбавьте препараты, смешав их с E3 1%-ным стрептококком, чтобы приготовить коктейль FOLFOXIRI. После двух часов имплантации удалите среду из каждой лунки и добавьте лекарственный коктейль. Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 35 градусов Цельсия на три дня с ежедневной сменой среды для обновления лекарств.Для визуализации делайте снимки под 40-кратным объективом конфокального микроскопа. Используйте разрешение 1024 на 512 пикселей с шагом Z в пять микрометров. Все изображения zPDX, полученные для анализа апоптоза, обнаруженного в циано, показали, что комбинированная терапия увеличивала апоптоз клеток по сравнению с контрольной группой.В тематическом исследовании сообщалось, что статистически значимое увеличение доли апоптотических клеток в имплантированных ксенотрансплантатах было выявлено в группе, получавшей FOLFOXIRI, по сравнению с контрольной группой. В протоколе показан пример с использованием ткани рака поджелудочной железы, но ксенотрансплантаты, полученные от пациентов данио-рерио, могут быть получены из разных типов рака. Кроме того, поскольку модель имеет низкое этическое воздействие, ее легко использовать для скрининга новых лекарств in vivo.Этот метод является технически сложным и требует опытного оператора. Предыдущий опыт в манипулировании эмбрионами рыбок данио-рерио и микроинъекциях ускорит обучение этой технике.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Создание основной культуры саркомы мягких тканей, пациент производные

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Пациент полученных гетерогенных Xenograft Модель рака поджелудочной железы использованием черыщения зебрав в качестве хозяев для сравнительной оценки наркотиков

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Изоляция и характеристика пациента полученных поджелудочной железы Ductal Аденокарцинома ОрганоидНые Модели

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Улучшенная жизнеспособность для Ex vivo 3D гидрогелевых культур ксенотрансплантатов, полученных пациентами, в переливной микрофлюидной платформе

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...