Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por la Fondazione Pisa (proyecto 114/16). Los autores desean agradecer a Raffaele Gaeta de la Unidad de Histopatología de Azienda Ospedaliera Pisana por la selección de muestras de pacientes y el apoyo a la patología. También agradecemos a Alessia Galante por el apoyo técnico en los experimentos. Este artículo se basa en el trabajo de COST Action TRANSPAN, CA21116, apoyado por COST (Cooperación Europea en Ciencia y Tecnología).

El Ministerio de Salud Pública italiano aprobó todos los experimentos con animales descritos, de conformidad con la Directiva 2010/63/UE sobre el uso y cuidado de animales. El Comité de Ética local aprobó el estudio, con el número de registro 70213. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados. Antes de comenzar, se deben preparar todas las soluciones y el equipo (sección 1) y se deben cruzar los peces (sección 2).
1. Preparación de soluciones y equipo...

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Los modelos in vivo en la investigación del cáncer proporcionan herramientas invaluables para comprender la biología del cáncer y predecir la respuesta al tratamiento del cáncer. Actualmente, se dispone de diferentes modelos in vivo , por ejemplo, animales modificados genéticamente (ratones transgénicos y knockout) o xenoinjertos derivados de pacientes a partir de células primarias humanas. A pesar de muchas características óptimas, cada una tiene varias limitaciones. En particular, los modelo...

Uno de los problemas de la investigación clínica del cáncer es que el cáncer no es una sola enfermedad, sino una variedad de enfermedades diferentes que pueden evolucionar con el tiempo, requiriendo tratamientos específicos dependiendo de las características del propio tumor y del paciente1. En consecuencia, el desafío es avanzar hacia la investigación oncológica orientada al paciente, con el fin de identificar nuevas estrategias personalizadas para la predicción temprana de los resultados del tratamiento del cáncer2. Esto es particularmente relevante para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), ya que se considera un cáncer difícil de tratar, con una tasa de supervivencia a 5 años del 11%3.
El diagnóstico tardío, la progresión rápida y la falta de terapias efectivas siguen siendo los problemas clínicos más apremiantes de PDAC. El principal desafío es, por lo tanto, modelar al paciente e identificar biomarcadores que puedan ser aplicados en la clínica para seleccionar la terapia más efectiva en línea con la medicina personalizada 4,5,6. Con el tiempo, se han propuesto nuevos enfoques para modelar enfermedades cancerosas: organoides derivados del paciente (PDO) y xenoinjertos derivados de pacientes de ratón (mPDX) se originaron a partir de una fuente de tejido tumoral humano. Se han utilizado para reproducir la enfermedad para estudiar la respuesta y la resistencia a la terapia, así como la recurrencia de la enfermedad 7,8,9.
Del mismo modo, el interés en los modelos de xenoinjerto derivado del paciente (zPDX) basados en pez cebra ha aumentado, gracias a sus características únicas y prometedoras10, lo que representa una herramienta rápida y de bajo costo para la investigación del cáncer11,12. Los modelos zPDX requieren solo un tamaño de muestra tumoral pequeño, lo que hace factible el cribado de quimioterapia de alto rendimiento13. La técnica más común utilizada para los modelos zPDX se basa en la digestión completa de la muestra y la implantación de las poblaciones de células primarias, que reproduce parcialmente el tumor, pero tiene las desventajas de la falta de microambiente tumoral y la diafonía entre células malignas y sanas14.
Este trabajo muestra cómo se pueden usar las zPDX como modelo preclínico para identificar el perfil de quimiosensibilidad de pacientes con cáncer de páncreas. La valiosa estrategia facilita el proceso de xenoinjerto, ya que no hay necesidad de expansión celular, lo que permite acelerar el cribado de quimioterapia. La fortaleza del modelo es que todos los componentes del microambiente se mantienen tal como están en el tejido canceroso del paciente, porque, como es bien sabido, el comportamiento del tumor depende de su interacción15,16. Esto es altamente favorable sobre los métodos alternativos en la literatura, ya que es posible preservar la heterogeneidad tumoral y contribuir a mejorar la previsibilidad del resultado del tratamiento y la recaída de una manera específica del paciente, lo que permite que el modelo zPDX se utilice en ensayos coclínicos. Este manuscrito describe los pasos involucrados en la elaboración del modelo zPDX, comenzando con una parte de la resección del tumor del paciente y tratándola para analizar la respuesta a la quimioterapia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la incidencia de muchos tipos de cáncer sigue aumentando. Se ha avanzado mucho en términos de detección, prevención y tratamiento; Sin embargo, todavía faltan modelos preclínicos que predigan el perfil de quimiosensibilidad de los pacientes con cáncer. Para llenar este vacío, se desarrolló y validó un modelo de xenoinjerto derivado del paciente in vivo . El modelo se basó en embriones de pez cebra (Danio rerio) a los 2 días después de la fertilización, que se utilizaron como receptores de fragmentos de xenoinjerto de tejido tumoral tomados de la muestra quirúrgica de un paciente. 
También vale la pena señalar que las muestras biópticas no fueron digeridas o desagregadas, con el fin de mantener el microambiente tumoral, lo cual es crucial en términos de analizar el comportamiento tumoral y la respuesta a la terapia. El protocolo detalla un método para establecer xenoinjertos derivados de pacientes (zPDX) a base de pez cebra a partir de la resección quirúrgica de tumor sólido primario. Después de la detección por un anatomopatólogo, la muestra se disecciona con una hoja de bisturí. El tejido necrótico, los vasos o el tejido graso se extraen y luego se cortan en trozos de 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm. 
Las piezas se marcan con fluorescencia y se xenotrasplantan en el espacio perivitelino de los embriones de pez cebra. Se puede procesar un gran número de embriones a bajo costo, lo que permite análisis in vivo de alto rendimiento de la quimiosensibilidad de zPDX a múltiples medicamentos contra el cáncer. Las imágenes confocales se adquieren rutinariamente para detectar y cuantificar los niveles apoptóticos inducidos por el tratamiento de quimioterapia en comparación con el grupo control. El procedimiento de xenoinjerto tiene una ventaja de tiempo significativa, ya que se puede completar en un solo día, proporcionando una ventana de tiempo razonable para llevar a cabo un cribado terapéutico para ensayos coclínicos.

Este protocolo describe el enfoque experimental para establecer zPDX a partir del adenocarcinoma pancreático humano primario. Se recogió, picó y tiñó una muestra tumoral con tinte fluorescente, como se describe en la sección 4 del protocolo. Las zPDX se establecieron con éxito mediante la implantación de un pedazo de tumor en el espacio perivitelino de 2 embriones de pez cebra dpf, como se describe en la sección 5 del protocolo. Como se describe en la sección 6 del protocolo, las zPDX se examinaron más a fondo...

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Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Los modelos preclínicos tienen como objetivo avanzar en el conocimiento de la biología del cáncer y predecir la eficacia del tratamiento. Este artículo describe la generación de xenoinjertos derivados de pacientes a base de pez cebra (zPDX) con fragmentos de tejido tumoral. Las zPDX se trataron con quimioterapia, cuyo efecto terapéutico se evaluó en términos de apoptosis celular del tejido trasplantado.

Establecimiento de xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra de cáncer de páncreas para pruebas de quimiosensibilidad

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

El xenoinjerto derivado del paciente con pez cebra es un poderoso modelo preclínico para predecir el perfil de quimiosensibilidad del paciente con cáncer in vivo. El protocolo describe la generación del modelo a partir de una muestra quirúrgica del paciente. Al xenoinjertar un pequeño fragmento de tejido en lugar de aislar células en embriones de pez cebra, es posible mantener el microambiente tumoral, que es el paso crucial para la progresión del tumor y la respuesta a la quimioterapia.La gran ventaja del modelo viene dada por su potencial para predecir el pronóstico del paciente en un plazo clínico relevante de tan solo una semana actuando como herramienta para la medicina personalizada. Comience el procesamiento de la muestra lavando todo el tejido tumoral recolectado del paciente con cinco mililitros de medio tumoral fresco. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de plástico Pasteur.Aspire y deseche cuidadosamente el medio de lavado antes de repetir el lavado tres veces. Sumerja la muestra en uno o dos mililitros de medio tumoral fresco. Corte la muestra del tumor en trozos cúbicos de uno a dos milímetros con una cuchilla de bisturí y luego colóquelos en un tubo de plástico estéril de cinco mililitros con medio tumoral.Después de ajustar el helicóptero de tejido McIlwain a un grosor de 100 micrómetros, coloque las piezas tumorales en la mesa circular de plástico del helicóptero y córtelas. Gire la mesa 90 grados y repita el picado. Recoja los fragmentos tumorales picados en un tubo de plástico de 15 mililitros que contenga el medio tumoral.Centrifugar los fragmentos tumorales picados a 300 G durante tres minutos antes de aspirar y desechar el sobrenadante. Incubar los fragmentos con la solución de trazas celulares o con un seguidor celular fluorescente alternativo como CM-DiI o Deep Red durante 30 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados. Durante la incubación, resuspenda suavemente los fragmentos cada 10 minutos.Al final de la tinción, retire cualquier tinte libre agregando un medio tumoral suplementado con al menos 1% de proteína. El volumen será cinco veces el volumen de tinción. Centrifugar los fragmentos a 300 G durante tres minutos y desechar el sobrenadante.Agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato o DPBS de Dulbecco y repita este paso de lavado tres veces. Una vez hecho esto, suspenda los fragmentos en cinco mililitros de DPBS en una placa de Petri de 60 milímetros. Para establecer los xenoinjertos derivados del paciente a base de pez cebra o zPDX, anestesiar los embriones dos días posteriores a la fertilización.En una placa de Petri que tiene tres cilindros de agarosa, coloque un embrión de pez cebra en un cilindro exponiendo un lado. Retire el exceso de solución para mantener el embrión en una película delgada. Usando fórceps estériles, transfiera la pieza de fragmentos de tejido tumoral teñido de una placa de Petri de 60 milímetros al soporte de agarosa al 1% donde se coloca el embrión.Luego levante el tejido y colóquelo sobre la yema del embrión antes de empujarlo hacia el espacio perivitelino usando la microaguja de vidrio tirada por calor. Agregue algunas gotas de estreptomicina E3 1% penicilina al embrión para devolverlo al líquido. Después de repetir la implantación de tejido tumoral en todos los embriones, retire los soportes de agarosa de la placa de Petri e incube los embriones a 35 grados centígrados.Dos horas después de la implantación, compruebe los embriones para los xenoinjertos correctos con tinción positiva utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Desechar los embriones muertos y los embriones sin los fragmentos tumorales completamente dentro del espacio perivitelino. Una vez hecho esto, distribuya aleatoriamente los embriones en seis placas de múltiples pocillos, divididas equitativamente en grupos según el plan experimental.Diluir los medicamentos mezclándolos en E3 1% pen-strep para preparar el cóctel FOLFOXIRI. Después de dos horas de implantación, retire los medios de cada pocillo y agregue el cóctel de medicamentos. Coloque los embriones en la incubadora a 35 grados centígrados durante tres días con cambios diarios del medio para renovar los medicamentos.Para obtener imágenes, capture imágenes bajo un objetivo 40X del microscopio confocal. Utilice la resolución de 1024 por 512 píxeles con un espaciado Z de cinco micrómetros. Las imágenes completas de montaje de zPDXs adquiridas para analizar la apoptosis detectada en cyano mostraron que la terapia combinada aumentó la apoptosis celular en comparación con el grupo de control.El estudio de caso informó que se identificó un aumento estadísticamente significativo en la fracción de células apoptóticas en los xenoinjertos implantados para el grupo tratado con FOLFOXIRI en comparación con el grupo control. El protocolo muestra un ejemplo utilizando tejido de cáncer de páncreas, pero se pueden establecer xenoinjertos derivados de pacientes con pez cebra a partir de diferentes tipos de cáncer. Además, dado que el modelo tiene un bajo impacto ético, es fácilmente explotable para la detección in vivo de nuevos medicamentos.El método es técnicamente desafiante y requiere un operador experto. La experiencia previa en la manipulación de embriones de pez cebra y la microinyección acelerará el entrenamiento de la técnica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Establecimiento de un cultivo primario de Sarcoma de tejidos blandos derivados del paciente

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Modelo de xenoinjerto heterogéneo derivado del paciente del cáncer de páncreas utilizando larvas de pez cebra como anfitriones para la evaluación comparativa de fármacos

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Aislamiento y caracterización de modelos de organoide de adenocarcinoma ductal pancreático derivados del paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Pruebas de terapias dirigidas en cáncer mediante análisis de alteración estructural del ADN y xenoinjertos derivados del paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Examen de drogas de xenoinjertos de tumores derivados del paciente primario en peces cebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...