Name: establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing
Uploaded: 2023-05-12T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Detta arbete finansierades av Fondazione Pisa (projekt 114/16). Författarna vill tacka Raffaele Gaeta från histopatologiska enheten i Azienda Ospedaliera Pisana för patientprovvalet och patologistödet. Vi tackar också Alessia Galante för det tekniska stödet i experimenten. Denna artikel är baserad på arbete från COST Action TRANSPAN, CA21116, med stöd av COST (European Cooperation in Science and Technology).

Det italienska folkhälsoministeriet godkände alla beskrivna djurförsök, i enlighet med direktiv 2010/63/EU om användning och skötsel av djur. Den lokala etiska kommittén godkände studien med registreringsnummer 70213. Informerat samtycke erhölls från alla inblandade ämnen. Innan du börjar ska alla lösningar och utrustning förberedas (avsnitt 1) och fisken ska korsas (avsnitt 2).
1. Beredning av lösningar och utrustning
OBS: Se t...

<ol>
	<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cancer.">Understanding cancer.</a> Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).</li><li>Krzyszczyk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+role+of+precision+and+personalized+medicine+for+cancer+treatment.">The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment.</a> Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).</li><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2022.">Cancer statistics, 2022.</a> CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).</li><li>Trunk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+treatment+strategies+in+pancreatic+cancer.">Emerging treatment strategies in pancreatic cancer.</a> Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).</li><li>Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer-A+disease+in+need:+Optimizing+and+integrating+supportive+care.">Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care.</a> Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).</li><li>Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+ductal+adenocarcinoma:+Treatment+hurdles,+tumor+microenvironment+and+immunotherapy.">Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy.</a> World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+based+personalized+medicine:+from+bench+to+bedside.">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).</li><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+application+of+patient-derived+xenograft+model+for+cancer+research.">The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research.</a> Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumor+models:+a+more+suitable+tool+for+pre-clinical+studies+in+colorectal+cancer.">Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer.</a> Journal of Experimental &amp; Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+patient-derived+xenografts+identify+chemo-response+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+patients.">Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients.</a> Cancers. 13 (16), 4131 (2021).</li><li>Usai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+a+zebrafish+avatar+for+co-clinical+trials.">A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials.</a> Cancers. 12 (3), 677 (2020).</li><li>Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benefits+of+zebrafish+xenograft+models+in+cancer+research.">Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).</li><li>Miserocchi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+and+potentialities+of+primary+cancer+cultures+in+preclinical+and+translational+studies.">Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).</li><li>Baghban, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+complexity+and+therapeutic+implications+at+a+glance.">Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance.</a> Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).</li><li>Albini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+and+the+tumor+microenvironment:+interplay+in+tumor+heterogeneity.">Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity.</a> Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).</li><li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis.">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li><li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening.">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077 (2021).</li><li>Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promise+of+patient-derived+xenografts:+the+best+laid+plans+of+mice+and+men.">The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men.</a> Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).</li><li>Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+associated+fibroblasts+(CAFs)+in+tumor+microenvironment.">Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.</a> Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).</li><li>Str&#228;hle, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+an+alternative+to+animal+experiments-a+commentary+on+the+definition+of+the+onset+of+protected+life+stages+in+animal+welfare+regulations.">Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations.</a> Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).</li><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+models:+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research.">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li></ol>

In vivo-modeller inom cancerforskning ger ovärderliga verktyg för att förstå cancerbiologi och förutsäga cancerbehandlingssvaret. För närvarande finns olika in vivo-modeller tillgängliga, till exempel genetiskt modifierade djur (transgena möss och knockoutmöss) eller patienthärledda xenotransplantat från humana primära celler. Trots många optimala funktioner har var och en olika begränsningar. I synnerhet saknar de ovannämnda modellerna ett tillförlitligt sätt att efterlikna patienten...

Ett av problemen med klinisk cancerforskning är att cancer inte är en enda sjukdom, utan en mängd olika sjukdomar som kan utvecklas över tiden, vilket kräver specifika behandlingar beroende på tumörens egenskaper och patienten1. Följaktligen är utmaningen att gå mot patientorienterad cancerforskning för att identifiera nya personliga strategier för tidig förutsägelse av cancerbehandlingsresultat2. Detta är särskilt relevant för pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC), eftersom det anses vara en svårbehandlad cancer, med en 5-årig överlevnad på 11%3.
Den sena diagnosen, snabba utvecklingen och bristen på effektiva terapier är fortfarande de mest pressande kliniska problemen med PDAC. Den största utmaningen är därför att modellera patienten och identifiera biomarkörer som kan appliceras i kliniken för att välja den mest effektiva terapin i linje med personlig medicin 4,5,6. Med tiden har nya metoder föreslagits för att modellera cancersjukdomar: patient-derived organoids (PDOs) och muspatient-derived xenografts (mPDX) härstammar från en källa till human tumörvävnad. De har använts för att reproducera sjukdomen för att studera svaret och resistensen mot terapi, liksom sjukdomsåterfall 7,8,9.
På samma sätt har intresset för zebrafiskbaserade patient-derived xenograft (zPDX) modeller ökat, tack vare deras unika och lovande egenskaper10, som representerar ett snabbt och billigt verktyg för cancerforskning11,12. zPDX-modeller kräver endast en liten tumörprovstorlek, vilket gör screening av kemoterapi med hög genomströmning möjlig13. Den vanligaste tekniken som används för zPDX-modeller är baserad på fullständig provsmältning och implantation av de primära cellpopulationerna, som delvis reproducerar tumören, men har nackdelarna med brist på tumörmikromiljö och överhörning mellan maligna och friska celler14.
Detta arbete visar hur zPDX kan användas som en preklinisk modell för att identifiera kemosensitivitetsprofilen hos patienter med bukspottkörtelcancer. Den värdefulla strategin underlättar xenograftprocessen, eftersom det inte finns något behov av cellexpansion, vilket möjliggör acceleration av kemoterapiscreeningen. Modellens styrka är att alla mikromiljökomponenter bibehålls som de är i patientens cancervävnad, eftersom, som det är välkänt, tumörens beteende beror på deras samspel15,16. Detta är mycket gynnsamt jämfört med alternativa metoder i litteraturen, eftersom det är möjligt att bevara tumörheterogeniteten och bidra till att förbättra förutsägbarheten av behandlingsresultat och återfall på ett patientspecifikt sätt, vilket gör att zPDX-modellen kan användas i samkliniska prövningar. Detta manuskript beskriver stegen som är involverade i att göra zPDX-modellen, börjar med en bit av patientens tumörresektion och behandlar den för att analysera svaret på kemoterapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil</td>
			<td>Teva Pharma AG</td>
			<td>SMP 1532755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 multiwell plate</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MAB1281&#160;</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium net QN6</td>
			<td>Penn-plax</td>
			<td>0-30172-23006-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTrace</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker CM-DiI&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C7001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Deep Red&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9661S</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>PanReac AppliChem ITW Reagents</td>
			<td>A3672,0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid -&#160; Lederfolin</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries, 3.5&#34;</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-203-G/X</td>
			<td>Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>WHEAW224581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit&#160;IgG&#160;(H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21244&#160;&#160;</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irinotecan</td>
			<td>Hospira</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Freezer Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>479-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McIlwain Tissue Chopper</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Mixer</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>822000049999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaliplatin</td>
			<td>Teva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3902500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 60 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83 3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1171.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Mount</td>
			<td>Tebu-bio</td>
			<td>18606-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SWAN3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle #3</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Micropipette Puller</td>
			<td>Shutter instrument</td>
			<td>P-30&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing

Cancer är en av de främsta dödsorsakerna i världen, och förekomsten av många typer av cancer fortsätter att öka. Stora framsteg har gjorts när det gäller screening, förebyggande och behandling. Prekliniska modeller som förutsäger kemosensitivitetsprofilen hos cancerpatienter saknas dock fortfarande. För att fylla detta gap utvecklades och validerades en in vivo patient-härledd xenograftmodell. Modellen baserades på zebrafiskembryon (Danio rerio) 2 dagar efter befruktning, som användes som mottagare av xenograftfragment av tumörvävnad som tagits från en patients kirurgiska prov. 
Det är också värt att notera att bioptiska prover inte smältes eller disaggregerades för att upprätthålla tumörmikromiljön, vilket är avgörande när det gäller att analysera tumörbeteende och svaret på terapi. Protokollet beskriver en metod för att etablera zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) från primär solid tumörkirurgisk resektion. Efter screening av en anatomipatolog dissekeras provet med hjälp av ett skalpellblad. Nekrotisk vävnad, kärl eller fettvävnad avlägsnas och hackas sedan i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm bitar. 
Bitarna märks sedan fluorescerande och xenotransplanteras in i perivitellinutrymmet hos zebrafiskembryon. Ett stort antal embryon kan bearbetas till en låg kostnad, vilket möjliggör in vivo-analyser med hög genomströmning av zPDX: s kemosensitivitet för flera cancerläkemedel. Konfokala bilder förvärvas rutinmässigt för att detektera och kvantifiera de apoptotiska nivåerna inducerade av kemoterapibehandling jämfört med kontrollgruppen. Xenograft-proceduren har en betydande tidsfördel, eftersom den kan slutföras på en enda dag, vilket ger ett rimligt tidsfönster för att genomföra en terapeutisk screening för samkliniska prövningar.

Detta protokoll beskriver den experimentella metoden för att etablera zPDX från primärt humant pankreasadenokarcinom. Ett tumörprov samlades in, maldes och färgades med fluorescerande färgämne, som beskrivs i protokollavsnitt 4. zPDX etablerades sedan framgångsrikt genom implantation av en tumörbit i perivitellinutrymmet på 2 dpf zebrafiskembryon, som beskrivs i protokollavsnitt 5. Som beskrivs i protokollavsnitt 6 screenades zPDX:erna ytterligare för att identifiera kemoterapikänslighetsprofilerna för cance...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing at JoVE.com

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Prekliniska modeller syftar till att öka kunskapen om cancerbiologi och förutsäga behandlingseffekt. Denna artikel beskriver genereringen av zebrafiskbaserade patient-derived xenografts (zPDX) med tumörvävnadsfragment. ZPDX behandlades med kemoterapi, vars terapeutiska effekt bedömdes med avseende på cellapoptos av den transplanterade vävnaden.

Etablering av zebrafisk patient-derived xenografts från bukspottskörtelcancer för kemosensitivitetstestning

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Zebrafisk patient-derived xenograft är en kraftfull preklinisk modell för att förutsäga kemosensitivitetsprofil hos cancerpatienter in vivo. Protokollet beskriver genereringen av modellen med utgångspunkt från ett patientkirurgiskt prov. Genom att xenografera ett litet vävnadsfragment snarare än att isolera celler i zebrafiskembryon är det möjligt att upprätthålla tumörmikromiljön som är det avgörande steget för tumörprogression och svaret på kemoterapi.Den stora fördelen med modellen ges av dess potential att förutsäga patientens prognos inom en kliniskt relevant tidsram på bara en vecka som fungerar som ett verktyg för personlig medicin. Börja provbehandlingen genom att tvätta hela tumörvävnaden som samlats in från patienten med fem milliliter färskt tumörmedium. Pipettera den upp och ner 10 gånger med en plastpasteurpipett.Aspirera försiktigt och kassera tvättmediet innan du upprepar tvätten tre gånger. Fördjupa provet i en till två milliliter färskt tumörmedium. Skär tumörprovet i en till två millimeter kubbitar med ett skalpellblad och placera dem sedan i ett sterilt fem milliliter plaströr med tumörmedium.Efter att ha ställt in McIlwain Tissue Chopper till 100 mikrometer tjocklek, placera tumörbitarna på hackarens cirkulära plastbord och hugga dem. Rotera bordet 90 grader och upprepa huggningen. Samla de hackade tumörfragmenten i ett 15 ml plaströr som innehåller tumörmediet.Centrifugera de hackade tumörfragmenten vid 300 G i tre minuter innan du aspirerar och kasserar supernatanten. Inkubera fragmenten med cellspårlösningen eller med en alternativ fluorescerande cellspårare såsom CM-DiI eller Deep Red i 30 minuter i ett 37 grader Celsius vattenbad. Under inkubation, försiktigt resuspendera fragmenten var 10: e minut.Vid slutet av färgningen, ta bort eventuellt fritt färgämne genom att tillsätta ett tumörmedium kompletterat med minst 1% protein. Volymen blir fem gånger färgningsvolymen. Centrifugera fragmenten vid 300 G i tre minuter och kassera supernatanten.Tillsätt en milliliter Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning eller DPBS och upprepa detta tvättsteg tre gånger. När du är klar, suspendera fragmenten i fem milliliter DPBS i en 60 millimeter petriskål. För att etablera zebrafiskbaserade patient-derived xenografts eller zPDX, bedöva de två dagarna efter befruktning embryon.I en petriskål med tre agaroscylindrar lägger du ett zebrafiskembryo på en cylinder som exponerar ena sidan. Ta bort överskottslösningen för att hålla embryot i en tunn film. Använd sterila pincett, överför biten av färgade tumörvävnadsfragment från en 60 millimeter petriskål till 1% agarosstödet där embryot läggs.Ta sedan upp vävnaden och placera den på embryoäggulan innan du trycker in den i perivitellinutrymmet med hjälp av den värmedragna glasmikronålen. Tillsätt några droppar E3 1% penicillinstreptomycin till embryot för att föra tillbaka det i vätskan. Efter att ha upprepat implantationen av tumörvävnad i alla embryon, ta bort agarosstöden från petriskålen och inkubera embryon vid 35 grader Celsius.Två timmar efter implantation, kontrollera embryon för rätt xenotransplantat med positiv färgning med hjälp av ett fluorescerande stereomikroskop. Kassera döda embryon och embryon utan tumörfragment helt inuti perivitellinutrymmet. När du är klar fördelar du embryon slumpmässigt i sex flerbrunnsplattor, lika uppdelade i grupper enligt experimentplanen.Späd läkemedlen genom att blanda dem i E3 1% pen-strep för att förbereda FOLFOXIRI-cocktailen. Efter två timmars implantation, ta bort media från varje brunn och tillsätt läkemedelscocktail. Placera embryon i inkubatorn vid 35 grader Celsius i tre dagar med dagliga förändringar av mediet för att förnya drogerna.För avbildning, ta bilder under ett 40X-mål för konfokalmikroskopet. Använd upplösningen 1024 x 512 pixlar med ett Z-avstånd på fem mikrometer. Hela monteringsbilderna av zPDX som förvärvats för att analysera apoptos detekterad i cyano visade att den kombinerade terapin ökade cellapoptos jämfört med kontrollgruppgruppen.Fallstudien rapporterade att en statistiskt signifikant ökning av andelen apoptotiska celler i implanterade xenotransplantat identifierades för den FOLFOXIRI-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Protokollet visar ett exempel med hjälp av bukspottskörtelcancervävnad, men zebrafiskpatienthärledda xenotransplantat kan fastställas från olika typer av cancer. Dessutom, eftersom modellen har en låg etisk inverkan, är den lätt att utnyttja för in vivo-screening av nya läkemedel.Metoden är tekniskt utmanande och kräver en sakkunnig operatör. Tidigare expertis inom zebrafiskembryomanipulation och mikroinjektion kommer att påskynda träningen av tekniken.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived heterogena xenograft modell av pankreascancer med Zebrafish larver som värdar för jämförande drog bedömning

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering och karakterisering av patient-derived bukspottskörteln ductal adenocarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...